分子診斷學(xué)：α-地貧瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果分析

1、LOGO 地中海貧血基因檢測地中海貧血基因檢測 -地貧地貧瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 及結(jié)果分析及結(jié)果分析 v1 學(xué)習(xí)與掌握瓊脂糖凝膠電泳原理和學(xué)習(xí)與掌握瓊脂糖凝膠電泳原理和 方法。方法。 v2 利用瓊脂糖凝膠電泳檢測和凝膠成利用瓊脂糖凝膠電泳檢測和凝膠成 像系統(tǒng)判斷像系統(tǒng)判斷地貧的基因類型。地貧的基因類型。 實驗?zāi)康模簩嶒災(zāi)康模?原理原理 v在在pHpH值為值為8.0-8.38.0-8.3時，核酸分子堿基幾乎不時，核酸分子堿基幾乎不 解離，磷酸解離，磷酸基團基團全部解離，核酸分子帶負全部解離，核酸分子帶負 電，在電泳時向電，在電泳時向正極正極移動。移動。 v采用適當濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支

2、持物，采用適當濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物， 在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不 同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從 而能達到分離核酸片段檢測其大小的目的。而能達到分離核酸片段檢測其大小的目的。 v核酸分子中嵌入熒光染料（如核酸分子中嵌入熒光染料（如EBEB）后，在）后，在 紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。 瓊脂糖瓊脂糖是從海藻中提取的、是從海藻中提取的、 由由D-D-和和 L- L-半乳糖殘基通過半乳糖殘基通過 和和糖苷鍵交替構(gòu)成的線糖苷鍵交替構(gòu)成的線 狀聚合物。瓊脂糖鏈形成螺

3、狀聚合物。瓊脂糖鏈形成螺 旋纖維，然后再聚合成半徑旋纖維，然后再聚合成半徑 為為20-30nm20-30nm的超螺旋結(jié)構(gòu)。的超螺旋結(jié)構(gòu)。 瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的最初濃度來控瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的最初濃度來控 制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊 脂糖形成較小的孔徑。脂糖形成較小的孔徑。 原理原理 干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，加熱煮沸變?yōu)槌吻?，干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，加熱煮沸變?yōu)槌吻澹?室溫冷卻、凝聚，即成瓊脂糖凝膠。室溫冷卻、凝聚，即成瓊脂糖凝膠。 影響影響 瓊脂糖濃度與線性瓊脂糖濃度與線性DNA分離范圍參數(shù)分離范圍參

4、數(shù) 相同大小的線狀相同大小的線狀 DNADNA片斷在不同濃度的瓊片斷在不同濃度的瓊 脂糖凝膠中遷移率不同脂糖凝膠中遷移率不同. .在一定濃度的瓊脂在一定濃度的瓊脂 糖凝膠中，不同大小的糖凝膠中，不同大小的DNADNA片段的遷移率也片段的遷移率也 是不同的。是不同的。 瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度(%)(%)分離范圍（分離范圍（kbkb） 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 DNA分子的大小分子的大小 v雙鏈雙鏈DNADNA分子在凝膠中遷移的速率與其分子在凝膠中遷移的速率與其 堿基數(shù)的常用對數(shù)成反比堿基

5、數(shù)的常用對數(shù)成反比。 v分子越大，遷移越慢。一是摩擦阻力分子越大，遷移越慢。一是摩擦阻力 越大，二是大分子通過凝膠孔徑的效越大，二是大分子通過凝膠孔徑的效 率低于較小的分子。率低于較小的分子。 DNA的構(gòu)象的構(gòu)象 DNA的構(gòu)象的構(gòu)象 v不同構(gòu)象不同構(gòu)象DNADNA分子在電場中移動的距離分子在電場中移動的距離 不同。具有相同分子量的線狀、開環(huán)狀不同。具有相同分子量的線狀、開環(huán)狀 和超螺旋和超螺旋DNADNA在瓊脂糖凝膠中移動速度在瓊脂糖凝膠中移動速度 不同。不同。 v遷移速度：遷移速度： 超螺旋的超螺旋的DNADNA線狀線狀DNA DNA 開環(huán)開環(huán)DNA DNA 。 緩沖液緩沖液 vDNA的泳動

6、受緩沖液的組成和離子強的泳動受緩沖液的組成和離子強 度的影響度的影響。 缺乏離子，電導(dǎo)率嚴重降低，電泳遷移率很缺乏離子，電導(dǎo)率嚴重降低，電泳遷移率很 慢；離子強度過高，電導(dǎo)率升高，極易產(chǎn)生大量慢；離子強度過高，電導(dǎo)率升高，極易產(chǎn)生大量 的熱能，最嚴重的結(jié)果是凝膠熔化，的熱能，最嚴重的結(jié)果是凝膠熔化，DNADNA變性變性 v最常用的緩沖液是最常用的緩沖液是1TAE(Tris-醋酸- EDTA)和和TBE(Tris-TBE(Tris-硼酸硼酸-EDTA)-EDTA)。 電泳電壓電泳電壓 v低壓條件下，線狀低壓條件下，線狀DNADNA在瓊脂糖凝膠上在瓊脂糖凝膠上 泳動速度和電壓成正比。隨著電壓升高，

7、泳動速度和電壓成正比。隨著電壓升高， 高分子量的高分子量的DNADNA片段泳動速度和電壓不片段泳動速度和電壓不 成正比關(guān)系，分辨率下降了，因此為了成正比關(guān)系，分辨率下降了，因此為了 得到良好的分離效果，電場電壓不宜超得到良好的分離效果，電場電壓不宜超 過過5V/CM5V/CM。 指示劑指示劑 v常用的電泳上樣緩沖液常用的電泳上樣緩沖液 含溴酚藍，有的還含有含溴酚藍，有的還含有 二甲苯青，這些指示劑二甲苯青，這些指示劑 可以指示電泳的速度，可以指示電泳的速度， 也可以利用其遷移率大也可以利用其遷移率大 致估計致估計DNADNA的分子量，的分子量， 而與瓊脂糖濃度無關(guān)。而與瓊脂糖濃度無關(guān)。 v （

8、本試劑已包含指示劑，電泳（本試劑已包含指示劑，電泳 時無需另加）時無需另加） 染色染色 v溴化乙淀（溴化乙淀（EBEB）是核酸）是核酸 的染色劑，能插入的染色劑，能插入DNADNA分分 子中形成熒光結(jié)合物，子中形成熒光結(jié)合物， EBEB在紫外線照射下的發(fā)在紫外線照射下的發(fā) 射熒光。熒光的強度與射熒光。熒光的強度與 DNADNA的含量成正比，從而的含量成正比，從而 可以確定可以確定DNADNA片段在凝膠片段在凝膠 中的位置及估計出待測中的位置及估計出待測 樣品的濃度樣品的濃度 v EB是強致癌劑是強致癌劑. v 今天采用的是廠家提供的替今天采用的是廠家提供的替 代染料代染料 染色劑即可以在電泳前

9、染色劑即可以在電泳前 加入樣液，又可以電泳加入樣液，又可以電泳 后再對凝膠染色后再對凝膠染色 材料和設(shè)備 v材料：材料：PCR擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物 v設(shè)備：微量移液器，電泳儀，瓊脂糖設(shè)備：微量移液器，電泳儀，瓊脂糖 平板電泳裝置，微波爐，凝膠成像系平板電泳裝置，微波爐，凝膠成像系 統(tǒng)等。統(tǒng)等。 試劑準備 1. TAE電泳緩沖液：電泳緩沖液： 50X TAE 1X TAE ：取取5050TAETAE緩沖液緩沖液20ml20ml，加水，加水 至至1000ml1000ml 2 . DNA Marker標準分子量標準分子量 電泳操作步驟電泳操作步驟 2 2、膠槽準備膠槽準備 取出膠板和梳子，將膠板放入膠槽

10、中取出膠板和梳子，將膠板放入膠槽中; ; 將梳子垂直插入到膠槽的小凹槽內(nèi)，梳齒底將梳子垂直插入到膠槽的小凹槽內(nèi)，梳齒底 端和板面有端和板面有1mm1mm的間隙的間隙; ; 將膠槽放在調(diào)整好的水平臺上。將膠槽放在調(diào)整好的水平臺上。 一、瓊脂糖凝膠的制備（示教視頻）一、瓊脂糖凝膠的制備（示教視頻） 1 、電泳緩沖液準備電泳緩沖液準備 取取5050TAETAE緩沖液緩沖液20ml20ml，加水至，加水至1000ml1000ml，配，配 制成制成1 1TAETAE稀釋緩沖，待用。稀釋緩沖，待用。 電泳操作步驟電泳操作步驟 v3、凝膠準備凝膠準備 用用1 1TAETAE配制配制1 1瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝

11、膠。 稱稱1g1g瓊脂糖置三角瓶中，加瓊脂糖置三角瓶中，加100ml100ml 1 1TAE; TAE; 微波爐加熱大約微波爐加熱大約3-53-5分鐘，熔化瓊脂糖分鐘，熔化瓊脂糖; ; 熔化的瓊脂糖自然冷卻到熔化的瓊脂糖自然冷卻到50506060時，輕輕混時，輕輕混 勻準備鋪膠勻準備鋪膠。 4、鋪膠：鋪膠：將冷卻致將冷卻致6060的凝膠倒入準備好的膠槽的凝膠倒入準備好的膠槽 內(nèi)，內(nèi)，凝膠厚度凝膠厚度3 35mm,5mm,室溫下靜置半小時左右，凝室溫下靜置半小時左右，凝 膠固化。膠固化。 5 5、輕輕拔出固定在凝膠中的梳子。將帶凝、輕輕拔出固定在凝膠中的梳子。將帶凝 膠的膠板置于電泳槽中，并使膠

12、的膠板置于電泳槽中，并使樣品孔位于樣品孔位于 電場負極電場負極，向電泳槽中加入向電泳槽中加入1 1TAETAE電泳緩電泳緩 沖液，越過凝膠表面即可沖液，越過凝膠表面即可。 6 6、原梳齒處、原梳齒處( (樣品孔樣品孔) )即被緩沖液充滿，如即被緩沖液充滿，如 發(fā)現(xiàn)有發(fā)現(xiàn)有氣泡氣泡，應(yīng)設(shè)法去除應(yīng)設(shè)法去除。 電泳操作步驟電泳操作步驟 二二 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 1 1、加樣：加樣： 直接從直接從PCRPCR擴增后的反應(yīng)管中取擴增后的反應(yīng)管中取5l5l紅色液體加入紅色液體加入 電泳孔中，注意不要加到孔外；電泳孔中，注意不要加到孔外； markermarker：5ul5ul 2 2、電泳：電泳

13、：蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳 開始電泳前，再次確認凝膠樣品孔處于電場的負極。開始電泳前，再次確認凝膠樣品孔處于電場的負極。 電泳條件：電壓電泳條件：電壓120-130V120-130V；時間；時間20-3020-30分鐘左右分鐘左右 電泳操作步驟電泳操作步驟 分組實驗 v1-4號號第一個槽，第一個槽， 5-8號號第二個槽第二個槽 v 樣品樣品 加樣孔加樣孔 陽性陽性 1 2 marker 3 4 陰性陰性 對照對照 陽性陽性 5 6 marker 7 8 陰性陰性 對照對照 3 3、電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠、電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠 4 4、電泳結(jié)

14、果分析：、電泳結(jié)果分析： 紫外檢測儀直接觀察電泳條帶紫外檢測儀直接觀察電泳條帶 凝膠成像系統(tǒng)拍照凝膠成像系統(tǒng)拍照 觀察電泳帶及其位置，并與核酸分觀察電泳帶及其位置，并與核酸分 子量標準子量標準MarkerMarker比較被擴增產(chǎn)物的大小，比較被擴增產(chǎn)物的大小， 判斷基因型。判斷基因型。 電泳操作步驟電泳操作步驟 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 （- 3.7/-3.7） （-4.2/ -4.2） （- 3.7 / -SEA ) （-3.7/ -4.2） （- 4.2 / -SEA ) （ - - / - 4.2) （ - - / -3.7) （ - - /-SEA

15、 ) 注意事項注意事項 1 1 實驗用具和溶液均有可能受到實驗用具和溶液均有可能受到染料染料的污染，的污染， 操作過程應(yīng)操作過程應(yīng)戴手套戴手套! ! 2 2 加樣時小心操作加樣時小心操作, , 槍頭伸入孔中緩慢加入，槍頭伸入孔中緩慢加入， 避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。 3 3 本體系含有正常對照條帶，無論有無發(fā)生缺本體系含有正常對照條帶，無論有無發(fā)生缺 失，每個樣本至少應(yīng)有一條電泳條帶，否則，失，每個樣本至少應(yīng)有一條電泳條帶，否則， 提示擴增失敗，應(yīng)重新檢測提示擴增失敗，應(yīng)重新檢測 -地貧地貧實驗原理實驗原理 v考慮到四對引物要在同一管擴增并通 過電

16、泳來判斷結(jié)果，設(shè)計引物位置時 各PCR產(chǎn)物的條帶大小要有區(qū)別，最 終-3.7、-4.2和SEA的擴增 條帶分別約為：2.0kbp、1.7kbp、 1.4kbp和1.2kbp 電泳條帶與基因型的對應(yīng)關(guān)系 v條帶大小條帶大小 基因型基因型基因型基因型條帶大小條帶大小 v2.0 kb -3.71.4 kb-4.2 v1.7 kb 1.2 kb-SEA 電泳條帶與基因型判斷 v出現(xiàn)電泳條帶出現(xiàn)電泳條帶 基因型基因型 v1.7Kb (- /- ) v1.7Kb 2.0Kb (- / -3.7) v1.7Kb 1.4Kb (-/ -4.2) v1.7Kb 1.2Kb (-/-SEA ) v2.0Kb 1.

17、2Kb (-3.7 / -SEA ) v2.0Kb 1.4Kb （-3.7/ -4.2） v1.4Kb 1.2Kb (- 4.2 / -SEA ) v2.0Kb （- 3.7/- 3.7） v1.4 kb （-4.2/ -4.2） v1.2Kb （- SEA /- SEA ）。）。 地中海貧血的血液學(xué)表型特征地中海貧血的血液學(xué)表型特征 RBC 參數(shù)參數(shù) MCV MCH 細胞形態(tài)變化細胞形態(tài)變化 Hb電泳分析電泳分析 Hb A2 () 或或 ( ) Hb Barts Hb H () Hb E ( ) a地貧的基因型與表現(xiàn)型地貧的基因型與表現(xiàn)型 Normal (/) 正常正常 + thal tra

18、it (/- 3.7) (/- 4.2) 靜止型單一靜止型單一基因缺失或喪失功能基因缺失或喪失功能 臨床無任何癥狀，一般血液學(xué)檢查無異樣，僅 平均紅細胞體積(MCV) 位于正常值下限。 a地貧的基因型與表現(xiàn)型地貧的基因型與表現(xiàn)型 Hb H disease (- 3.7/-SEA) (- 4.2/-SEA) o Thal trait ( /-SEA) ( - / - ) 血紅蛋白血紅蛋白H病病3個個基因缺失或喪失功能基因缺失或喪失功能 肝脾腫大，中度貧血。小細胞，低色素，HbH含 量較高，易發(fā)生溶血，有些病例需不定期輸血， 癥重者甚至需切除脾臟。 標準型標準型2個個基因缺失或喪失功能基因缺失或喪失功能 臨床無癥狀，血液學(xué)檢查出現(xiàn)輕微貧血，紅細 胞大小不均一，平均紅細胞體積(MCV) 及平均 血紅蛋白含量(MCH)明顯偏低。 a地貧的基因型與表現(xiàn)型地貧的基因型與表現(xiàn)型 Hb Barts Hydrops (-SEA/-SEA) Hb Barts Hb Barts 水腫胎兒綜合癥水腫胎兒綜合癥 4個基因缺失或喪失功能 患胎于妊娠晚期或產(chǎn)后數(shù)小時內(nèi)死亡，全身水 腫，肝脾腫大。 評價評價 v1 1、本實驗的局限性為本方法僅檢測本實驗的局限性為本方法僅檢測3 3種中種中