富血小板血漿在治療慢性難愈創(chuàng)面中的應(yīng)用

1、論文范文題目：富血小板血漿在治療慢性難愈創(chuàng)面中的應(yīng)用編輯：司馬小【關(guān)鍵詞】 富血小板血漿；慢性難愈創(chuàng)面；應(yīng)用慢性難愈創(chuàng)面（chronic nonhealing wounds）目前尚無明確定義，通常理解為在各種內(nèi)在或外界因素作用下創(chuàng)面不能通過正常的創(chuàng)面愈合進程達到愈合，進入一種病理性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，從而導致創(chuàng)面經(jīng)久不愈1。傳統(tǒng)的治療對慢性難愈創(chuàng)面效果不佳，而生長因子的出現(xiàn)使創(chuàng)面愈合的治療從被動轉(zhuǎn)為主動，為慢性難愈創(chuàng)面的治療帶來了希望，但生長因子的局部應(yīng)用受創(chuàng)面微環(huán)境影響而使其滅活快、作用時間短，難以達到預期的治療效果，同時也受到給藥途徑、劑型和經(jīng)濟負擔的限制。20世紀90年代以來，國內(nèi)外一些學者發(fā)

2、現(xiàn)富血小板血漿(plateletrich plasma，prp)中含有高濃度的生長因子，隨后一些學者發(fā)現(xiàn)prp具有明確的促進創(chuàng)面愈合、成骨及軟組織修復的作用和加速骨愈合的能力，它能明顯縮短創(chuàng)面愈合時間，提高骨愈合質(zhì)量，并且由于prp完全來源于自體，無疾病傳染及免疫排斥反應(yīng)，制作簡單，對組織損傷小，因此在臨床上具有良好的應(yīng)用前景2。本文主要對prp的制備、成分、應(yīng)用及其前景做一綜述。1 富血小板血漿harke等1于1977年首次分離制備富血小板血漿(plateletrich plasma，prp)，成功地將其用于心臟外科手術(shù)患者，避免了體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass,cp

3、b）期間血小板功能的損傷和術(shù)后失血。近年來自體 prp已廣泛應(yīng)用于心臟外科手術(shù)、口腔頜面外科以及骨組織和軟組織缺損修復等，并取得滿意效果。1.1 富血小板血漿分離原理1.1.1 目前制備prp的方法主要有血漿分離置換法和離心分離法。血漿分離置換法是利用多功能醫(yī)用血成分自動分離設(shè)備單采血小板成分，自動化程度高，制備得到的prp血小板純度和濃度均高，但此方法一般用于用血量較多(一般在150ml以上)或需建立靜脈循環(huán)通道，采集血小板后將其他血成分回輸者。該設(shè)備價格昂貴，限制了在臨床上的廣泛應(yīng)用，目前主要用于血庫血小板的采集以進行成分輸血。離心分離法制備prp對設(shè)備要求低，步驟簡單，其制作原理為：血液

4、中各組分的沉降系數(shù)不同，1次離心后血液分為3層，最底層是沉降系數(shù)最大的紅細胞層，最上層是血清層，交界處有一薄層(肉眼不易看見)，即富血小板層；1次離心后棄去上清層或紅細胞層，然后改變離心力再次離心，使更多的血小板分離出來。進行離心分離法時通常第1次離心選擇較低的離心力，以避免血小板過快沉降，而第2次離心采用較高的離心力，以促使血小板在較短時間內(nèi)完全沉降。實驗證明，在界面附近血小板含量最豐富，保留界面以下lmm的紅細胞層可大大提高血小板獲得率，減少血小板耗損。landesberg等2以不同離心力和離心時間2次離心制作prp時發(fā)現(xiàn)，離心力250g會導致血小板破壞過多，而1次離心時間5分鐘時得到的p

5、rp血小板濃度與全血無明顯差異；建議1次離心后棄掉紅細胞層，然后再次離心，2次離心均采用200g的離心力且離心10分鐘，這樣制作的prp血小板計數(shù)明顯高于全血，為全血的6.17倍，血小板回收率為86.44 %。marx等3在制作prp時發(fā)現(xiàn)，先進行高速離心，1次離心后界面以下2mm的紅細胞層血小板濃度最高，棄去上清液后再次以低速離心，這樣可更好地提取血小板。但多數(shù)學者研究認為，采用改良appel法4，即先以低速離心后吸取全部上清液、交界層下少部分紅細胞置于另一支離心管，然后高速離心，所得的血小板回收率較高。1.1.2 prp中血小板濃度可達全血的16倍5，且其含有高濃度的生長因子，主要為血小板

6、源性生長因子(pdgf)、轉(zhuǎn)化生長因(tgf)、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、胰島素樣生長因子(igf)及表皮生長因子(egf)等。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗證實，prp中pdgf、tgf、vegf和egf的濃度為體內(nèi)正常濃度的38倍6。此外，prp內(nèi)的纖維網(wǎng)絡(luò)對促進細胞粘附、防止細胞流失也具有一定作用。1.1.3 目前，以prp為載體的生長因子已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床，但都是患者自體的prp。如果患者分離過多的血液，那么就會導致貧血或者影響身體健康。為了克服這一限制，huang qian 7設(shè)計從異體的prp中分離生長因子。研究結(jié)果表明，從prp中分離出來的生長因子有四個部分：a、b、c、d，其中大部分的

7、生長因子都是在b和c部分，而且可以有效地促進細胞增殖；分離出來的生長因子，經(jīng)真空冷凍干燥后儲存，仍可保持原來的生物活性。1.2 富血小板血漿凝膠的制備和激活無論以何種原理分離的prp，臨床上prp多以凝膠的形式應(yīng)用，prp凝膠是prp與氯化鈣和凝血酶混合而成的一種具有粘性的膠狀凝塊。目前已被證實最好的prp激活劑是10mg/ml氯化鈣溶液(一種枸櫞酸鹽抑制劑能夠使血漿凝固)和100uml牛凝血酶(一種激活劑能使纖維蛋白聚集成不可溶解的凝膠，誘導血小板脫顆粒并釋放介質(zhì)和細胞因子)混和制成。使用前，prp與激活劑按1：1的比例及少許空氣混和、搖勻，經(jīng)610s后即制成prp凝膠，均勻鋪于創(chuàng)面，外面覆

8、蓋生物材料或者紗布，增加凝膠與創(chuàng)面接觸的時間。最近，i.martineau等8研究表明，氯化鈣和凝血酶調(diào)節(jié)prp中生長因子的釋放、合成和降解，而且每一種生長因子都有自己特定的模式。不同濃度的氯化鈣和凝血酶對prp中生長因子的影響是有很大區(qū)別的，比如當凝血酶的濃度是142.8u/ml時，egf的濃度處于最高水平，當氯化鈣的濃度是14.3mg/ml時，il-1的濃度是最高的。1.3 富血小板血漿的作用機理1.3.1 prp作用的發(fā)揮有賴于其濃縮血小板被激活后a顆粒釋放出高濃度的各類生長因子及纖維蛋白原所形成的纖維網(wǎng)狀支架9，包括血小板衍生生長因子(pdgf)，轉(zhuǎn)移生長因子-12(tgf12)，血管

9、內(nèi)皮生長因子(vegf)，血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子，白介素1 (il1)，表皮生長因子（egf)，成纖維細胞生長因子，血小板激活因子10。這些因子是誘導組織生長所不可或缺的，纖維蛋白原所形成的纖維網(wǎng)狀支架可支持生長因子誘導生成新生組織。這些因子在刺激成骨細胞和前成骨細胞的增殖，抑制破骨細胞的形成和骨吸收， 增加膠原合成能力，促進內(nèi)皮細胞增殖，誘導新生血管生成，刺激體內(nèi)多種類型組織細胞的分裂和增殖，促進基質(zhì)合成和沉積，促進纖維組織生成的過程中起著不可或缺的作用。1.3.2 prp中含有高濃度的激活的生長因子加速創(chuàng)面愈合，由于各生長因子的比例與體內(nèi)正常生理濃度相近，能使各生長因子之間發(fā)揮最佳的協(xié)

10、同作用11。同時ppp含有大量纖維蛋白，能為修復細胞提供良好的支架，可刺激軟組織再生，促進傷口早期閉合和防止感染 12。國外有學者13在通過對結(jié)腸縫合術(shù)后裂開壓力的測量實驗中發(fā)現(xiàn)prp在降低炎癥發(fā)生的過程中也發(fā)揮著重要的作用，最新研究證實14，這一作用的機理是prp中的巨噬細胞釋放il1特定的原始抑制因子，控制早期炎癥的發(fā)生。1.3.3 prp凝膠可以防止血小板的流失，使血小板在局部長時間分泌生長因子，這些外源性生長因子促修復作用：(1)作為化學趨化劑趨化炎性細胞與組織修復細胞，為創(chuàng)面殺菌以及后期修復創(chuàng)造條件；(2)直接作用于組織修復細胞上生長因子受體，通過其促分裂效應(yīng)加快細胞周期轉(zhuǎn)變來促進創(chuàng)

11、面修復；(3)激活上調(diào)組織修復細胞上生長因子受體活性，加快信號傳遞15。此外，prp不僅含有高濃度的血小板并且富含凝結(jié)因子，正常情況下這些凝結(jié)因子保持著正常的生理水平。被激活的血小板所包含的大量的蛋白在創(chuàng)面愈合過程中有著促進作用，血小板在凝結(jié)后l0分鐘就能激活這些蛋白，從而縮短愈合的臨床過程。2 富血小板血漿在慢性難愈創(chuàng)面愈合中的作用創(chuàng)面愈合是一種特定的對完整組織再生的宿主免疫反應(yīng)，實驗證明，創(chuàng)傷時創(chuàng)面的生長因子活性改變，即合成減少、降解和失活增加16。局部使用prp，創(chuàng)面出血部位可以獲取混合的血小板和冷沉淀物，增加外源性生長因子。2.1 目前研究證實pdgf通過增加細胞的移動增殖以及增加細胞

12、基質(zhì)產(chǎn)物促使肉芽組織快速形成而發(fā)揮作用。在創(chuàng)面的成纖維細胞和角質(zhì)細胞內(nèi)有pdgfmrna的表達，因此pdgf能夠增加創(chuàng)面成纖維細胞和炎癥細胞的浸潤，在損傷后期誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)變，使傷口組織膠原合成增加，促進肉芽組織生長。人tgf有三種亞型，即tgf13，各亞型在體內(nèi)空間及損傷后時間分布各不相同。有研究表明，組織創(chuàng)傷后的炎癥前期，局部相關(guān)的細胞因子有所增加，而tgf水平暫時下降，膠原沉積減少。激活的血小板可產(chǎn)生tgf，tgf對細胞分化、增生、炎癥過程具有刺激作用，對細胞外基質(zhì)的合成、重塑具有獨特作用。tgf不僅通過促進成纖維細胞趨化，產(chǎn)生膠原纖維和細胞外基質(zhì)，還可減少膠原酶的合成，

13、增加金屬蛋白酶抑制劑的產(chǎn)生，從而減少傷口中的酶解作用，促進傷口愈合。實驗證明，在傷口模型中注入外源性tgf，可激活成纖維細胞，刺激膠原纖維生成，促進傷口愈合，tgf1 、tgf2還可增加傷口愈合拉力17。egf與受體結(jié)合后發(fā)揮活性，egf受體幾乎在所有細胞都有表達，但以表皮細胞最為豐富。皮膚損傷后，局部使用prp后可釋放egf。egf不僅加速表皮生長，而且有增加基質(zhì)形成和結(jié)締組織收縮的作用。動物切割傷模型已證實外用egf能加速表皮生長并增加傷口愈合張力。研究顯示，重組人堿性成纖維細胞生長因子(rhbfgf)和重組人表皮生長因子(rhegf)均具有創(chuàng)面修復作用，二者比較rhbfgf在修復早中期促

14、進肉芽組織生成，rhegf在中晚期可加速創(chuàng)面的上皮化18。igf包括igf1和igf2，其中igf1在創(chuàng)傷修復中的作用研究的比較多。prp中有高濃度的igf1，當其被釋放后，是血管內(nèi)皮細胞的趨向劑，可以刺激血管內(nèi)皮細胞遷移到創(chuàng)傷部位，促進新生血管的形成。igf1也可以促進許多細胞生長，如成纖維細胞、骨細胞和軟骨細胞。此外，igf1可以與pdgf協(xié)同作用增加表皮和內(nèi)皮的再生。vegf包括vegfa、b、c、d、e和胎盤生長因子。最早發(fā)現(xiàn)的vegfa，具有促進血管新生及增強血管通透性的作用。vegfa與內(nèi)皮細胞表面受體vegfr1和vegfr2結(jié)合，促進內(nèi)皮細胞合成no，激活血管新生。vegfa還

15、可促進內(nèi)皮細胞分裂。vegfc主要與淋巴管內(nèi)皮細胞上的vegfr3受體結(jié)合，同時也可與vegfr2結(jié)合。它是內(nèi)皮細胞的化學趨化及分裂因子，可能同時具有促進血管及淋巴管新生的作用。vegfd與vegfc相似，具有促進血管及淋巴管新生的作用。2.2 在實驗與臨床研究中，prp表現(xiàn)出良好的促進難愈合傷口的修復作用。carter在用prp修復馬小腿傷口的實驗中，發(fā)現(xiàn)prp的修復效果明顯好于對照組，認為prp里大量的生長因子彌補了馬小腿傷口處生長因子過少，較快地啟動了修復機制，形成上皮組織，加快血管再生，為傷口的修復提供了較好的環(huán)境和血供。另外，在實驗中還發(fā)現(xiàn)，prp治療組傷口瘢痕小，可能由于prp中含

16、有大量白細胞和單核細胞，抑制了傷口處的炎癥反應(yīng)，導致瘢痕較少19。但是，monteiro20在使用prp修復馬前肢遠端傷口的實驗中，通過傷口組織學檢查、測量tgf1、生物學材料評估以及膠原、 mrna 檢測，發(fā)現(xiàn)prp對小面積的創(chuàng)面作用不明顯，而更適合于大面積組織缺損的治療，同時也認為是為治療慢性創(chuàng)傷提供一個新的渠道。crovetti16用prp治療皮膚潰瘍，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)prp能更好地在傷口處形成肉芽組織，促進傷口上皮組織完全再生。prp在局部釋放多種生長因子共同促進了傷口的恢復，如tgf對中性粒細胞和單核細胞的趨化作用介導傷口的炎癥反應(yīng)，pdgf刺激成纖維細胞的增殖分化，促進組織重塑，

17、vegf則加快血管再生，但是治療組患者的疼痛是否明顯較對照組減輕，目前尚未證實。lee21等研究和評價prp治療家兔全層皮膚缺損的促進作用。分0.3ml,0.6ml,0.9ml三組治療劑量，一周和兩周后測定創(chuàng)面上皮形成率、創(chuàng)面收縮率、組織填充及體積分數(shù)的成纖維細胞等，結(jié)果表明，prp通過加速上皮移行和血管原性反應(yīng)，減少創(chuàng)面面積，達到治愈全層皮膚的作用；同時也提出了，可以通過改變prp的治療時間間隔和治療劑量，探究和評價prp在治療創(chuàng)面時的長期效果。hom22等使用prp治療全層真皮缺損創(chuàng)面進行前瞻性研究，結(jié)果表明，使用prp組與使用抗生素軟膏組和半暴露療法組相比，創(chuàng)面愈合的速度更快，瘢痕增生不

18、明顯。guo等23對47例下肢慢性難愈創(chuàng)面（均是經(jīng)過24個月治療未愈合）進行臨床觀察：創(chuàng)面清創(chuàng)后注射自體prp凝膠，每兩個月注射1次或者兩次，隨訪4個月，2個月后表現(xiàn)出軟組織循環(huán)明顯改善，創(chuàng)面大量肉芽組織生長；4個月后創(chuàng)面愈合率高于79.3%并且具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果表明，prp有效地增強軟組織缺損的修復和加速下肢慢性難愈創(chuàng)面的愈合。marquez等24對10例眼睛化學燒傷的患者應(yīng)用自體prp,治療組結(jié)膜下注射prp，對照組使用傳統(tǒng)方法，結(jié)果治療組的治療時間明顯縮短、瘢痕形成也不明顯，認為是prp中大量的生長因子通過細胞膜微孔上的受體間的相互作用參與細胞間的信息聯(lián)絡(luò)，此外，可以加強細胞的增殖、分

19、化，促進創(chuàng)面的愈合。3 富血小板血漿的發(fā)展優(yōu)勢和存在問題3.1 目前臨床使用的prp是通過離心自體全血得到的血小板濃縮物，近年來已受到很多學者的關(guān)注。研究證實，prp具有許多獨特優(yōu)勢：第一，prp是自源性的，這從根本上解決和避免了外源性生長因子引起的免疫排斥、疾病傳染及異種重組基因產(chǎn)品可能改變?nèi)祟愡z傳結(jié)構(gòu)的擔憂。第二，prp 制備簡便、快捷，方法較為成熟，檢測手段規(guī)范，制備質(zhì)量有保證。第三，prp含有多種高濃度的生長因子，各生長因子的比例與體內(nèi)正常比例相似并具有最佳的協(xié)同作用，這在一定程度上彌補了單一生長因子治療的缺點。第四，用凝血酶可將prp凝固成膠狀，膠狀prp不僅可粘合組織缺損，還可防止

20、血小板的流失，使血小板在局部長時間分泌生長因子，保持較高的生長因子濃度。第五，prp制備對患者的損傷小，只需從患者靜脈取血即可。國外現(xiàn)已生產(chǎn)出專門的prp制作機，可先從靜脈取血，在提取高濃度血小板后將剩余血成分回輸體內(nèi)，此方法成本低，可減輕醫(yī)療費用。第六，到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)prp對機體的不良反應(yīng)。3.2 prp的缺點，極大地限制了其在臨床的推廣應(yīng)用：（1）在開放的系統(tǒng)內(nèi)制備及在多個容器中轉(zhuǎn)移，易受外界污染；（2）血小板在體外易受外源性刺激而破壞或激活，例如抽血時間過長、針頭過小、應(yīng)用止血帶、不適當?shù)目鼓齽┖痛嫜鳌u勻程度、放置時間等，都會人為地造成血小板活化；（3）血小板與生長因子濃度的

21、關(guān)系較復雜，可能受制作過程中多種因素的影響，也可因血小板激活方式(冷凍激活、凝血酶激活)、激活程度、生長因子檢測試劑盒靈敏度的差異產(chǎn)生變化；（4）血小板及其生長因子在體內(nèi)的壽命不超過5天，即使prp在凝血酶或鈣離子的激活下形成凝膠塊，凝膠塊中的血小板內(nèi)容物(包括生長因子)持續(xù)釋放也僅為1周左右，不可能作用于組織修復的全過程。3.3 當然，今后還有許多問題亟須解決，比如：（1）進一步建立高效穩(wěn)定的prp制作方法，研究不同方法制作和不同濃度激活劑的prp分泌的生長因子生物學性能，明確prp凝膠在體內(nèi)分泌的生長因子及各種生長因子之間的相互作用，判斷prp用于創(chuàng)面修復的最佳治療濃度和治療時間；（2）從

22、異體prp中分離生長因子已被廣泛關(guān)注，理論上這種方法可以減少免疫原性，防止免疫排斥，但是還需要進一步研究證實7；（30研究不同的prp產(chǎn)品，適應(yīng)不同的臨床使用條件，并且規(guī)定生產(chǎn)技術(shù)流程和產(chǎn)品安全問題25。相信伴隨著人們對prp研究的不斷深入，prp的應(yīng)用會更廣更方便?！緟⒖嘉墨I】harke h，tanger d，furstdenzer s，et aleffect of a preoperative separation of platelets on the postoperative blood loss subsequent to extrac0rp0real circulation in

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