食品應(yīng)用生物技術(shù)實驗指導(dǎo)

1、項目一 產(chǎn)纖溶酶菌株的篩選纖溶酶是大豆發(fā)酵過程中由微生物分泌的一種蛋白水解酶，在酶學(xué)分類上有些是絲氨酸蛋白酶，有些是金屬蛋白酶，具有能直接降解血栓纖維蛋白，并不降解血漿纖維蛋白原，可口服，經(jīng)消化道直接吸收，安全可靠，在人體內(nèi)半衰期長，不易引起體內(nèi)出血等優(yōu)勢，被認(rèn)為是潛在的、安全的溶栓劑。一、基本原理能夠產(chǎn)生纖溶酶的菌株在初篩平板上生長后，其菌落周圍可形成明顯的蛋白水解圈。二、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)用選擇平板分離纖溶酶產(chǎn)生菌的方法，獲得產(chǎn)纖溶酶菌株。三、實驗器材1. 原料豆豉或納豆2. 溶液和試劑蛋白胨，牛肉膏，瓊脂粉，氯化鈉，酪蛋白，營養(yǎng)瓊脂，葡萄糖等。3. 儀器和用品三角瓶，培養(yǎng)皿，吸管，試管，涂布棒

2、，培養(yǎng)搖床，高壓滅菌鍋，天平、振蕩混合器四、操作步驟1. 初篩培養(yǎng)基的配制（%）：大豆蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化鈉0.5，酪蛋白2.0，瓊脂粉2.02. 菌種保存斜面的配制（%）：葡萄糖0.5，營養(yǎng)瓊脂 3.5。分裝成若干支試管，試管上帶棉塞。（每人3支試管）3. 培養(yǎng)基與器皿（1.5 ml離心管60個，無菌水100 ml）的滅菌121，滅菌15 min4. 菌液的制備分別稱取3 g原料于研缽中，加入10 ml無菌水研碎后，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，迷你離心機(jī)離心后，將上清液轉(zhuǎn)移至試管中，備用。5. 菌液的梯度稀釋與劃線移取上述菌液0.5 ml至4.5 ml無菌水中，制成10-1菌液，依次類推

3、，制成10-2，10-3，10-4菌液，分別將10-3，10-4菌液涂布到初篩培養(yǎng)基上，每個梯度涂布2塊平板，分別放入28、35培養(yǎng)20 h左右觀察結(jié)果。用接種環(huán)從實驗項目一的平板上選擇一個能產(chǎn)水解圈的菌株在選擇平板上劃線分離。（每人劃12個平板）6. 產(chǎn)纖溶酶菌株的分離純化7. 產(chǎn)纖溶酶菌株的菌落形態(tài)觀察及菌種保存將上述劃線后的平板放入37培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h后，將平板拍照，接種其中最為典型的菌株劃線保存在試管斜面上；觀察產(chǎn)纖溶酶菌株在選擇平板上的菌落形態(tài)，并對其進(jìn)行描述。項目二 產(chǎn)纖溶酶菌株的酶活測定一、基本原理1. 不同類型的纖溶酶都能在初篩平板上形成水解圈，細(xì)菌在平板上的生長條件和液體環(huán)

4、境中生長的情況相差很大，因此在平板上產(chǎn)圈能力強(qiáng)的菌株不一定就是纖溶酶的高產(chǎn)菌株，因此要進(jìn)行酶活測定復(fù)篩。2. 蛋白酶對酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷鎢酸和磷鉬酸混合試劑，即福林-酚試劑，堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)（鎢蘭和鎢蘭混合物）。由于蛋白質(zhì)中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物也呈此反應(yīng)。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反應(yīng)，來間接測定蛋白酶的活力。二、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)采用福林試劑測定纖溶酶活力。三、實驗器材1. 原料產(chǎn)纖溶酶菌株2. 溶液和試劑蛋白胨，牛肉膏，瓊脂粉，氯化鈉，干酪素，三氯乙酸，n

5、aoh，na2co3，folin試劑，硼砂，酪氨酸，蒸餾水等。3. 儀器和用品三角瓶，培養(yǎng)皿，吸管，試管，涂布棒，高壓滅菌鍋，天平、振蕩混合器四、操作步驟1. 選擇平板的配制（%）：大豆蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化鈉0.5，酪蛋白2.0，瓊脂粉2.0，121，滅菌15 min。（200 ml2）預(yù)備實驗1（楊華、王金新）2. 擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制（%）：大豆蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化鈉0.5，酪蛋白2.0，15150的試管裝6 ml，121，滅菌15 min。（150 ml，分裝成25支試管，每6 7支一包）預(yù)備實驗1（楊華、王金新）3. 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制（%）：大豆蛋白胨1.0，牛肉膏

6、0.3，氯化鈉0.5，酪蛋白2.0，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌15 min。（1200 ml，分裝成24個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）預(yù)備實驗1（楊華、王金新）4. 菌液的制備用接種環(huán)從試管斜面上挑取一環(huán)菌株，在選擇平板上劃線，37倒置培養(yǎng)20 h，挑選有明顯水解圈的單菌落轉(zhuǎn)接入試管擴(kuò)大培養(yǎng)液中37震蕩培養(yǎng)6 h，轉(zhuǎn)接入裝有50 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)37震蕩培養(yǎng)16 h，4，5000 rpm離心10 min，取上清液用于纖溶酶活力的測定。5. ph7.2磷酸緩沖液的制備 預(yù)備實驗2（鄧海、張娟）取28mla液、72 ml b液混合后，用蒸餾水稀釋1

7、倍，即為ph7.2磷酸緩沖液。a液（0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液）稱取31.2 g nah2po3.2h2o，用蒸餾水溶解后定容至1000 ml。b液（0.2mol/l磷酸氫二鈉溶液）稱取71.6 g na2hpo3.12h2o，用蒸餾水溶解后定容至1000 ml。 6. folin試劑的配制 預(yù)備實驗2（鄧海、張娟）6.1 folin試劑在250 ml磨口回流瓶中，加入20 g鎢酸鈉，5 g鉬酸鈉及140 ml蒸餾水，再加10 ml85%磷酸，20 ml濃鹽酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10 h?；亓鹘Y(jié)束時，加入30g 硫酸鋰，10 ml蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15 mi

8、n，以便驅(qū)除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶，用少量蒸餾水洗滌回流瓶，洗滌液一并轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶，定容至200 ml，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。6.2 folin試劑使用液使用前，將folin試劑與水按1:2稀釋。7. 0.4 mol/l碳酸鈉溶液的配制 預(yù)備實驗3（瞿格格、喻順華）準(zhǔn)確稱取無水碳酸鈉42.4 g，以蒸餾水溶解定溶至1000 ml。8. 0.4 mol/l的三氯乙酸溶液的配制 預(yù)備實驗3（瞿格格、喻順華）準(zhǔn)確稱取65.4三氯乙酸，以蒸餾水溶解定溶至1000 ml。9. 0.5 mol/l的naoh的配制 預(yù)備

9、實驗3（瞿格格、喻順華）準(zhǔn)確稱取2 g naoh溶解并定至100 ml。10. 20.00 mg/ml干酪素溶液 預(yù)備實驗3（瞿格格、喻順華）稱取干酪素2.000 g，準(zhǔn)確至0.001 g，用少量的0.5 mol/l的氫氧化鈉溶液(若為酸性蛋白酶則用濃乳酸2 3滴)潤濕，加入約80 mlph7.2磷酸緩沖液，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，用適宜的緩沖液稀釋至刻度，此溶液在冰箱內(nèi)貯存。11. 100 g/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 預(yù)備實驗3（瞿格格、喻順華）準(zhǔn)確稱取預(yù)先于105干燥至恒重的l-酪氨酸0.1000 g，用1 mol/l的鹽酸60 ml 溶解后定容

10、至100 ml，即為1.00 mg/ml的酪氨酸溶液。吸取1.00 mg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10.00 ml，用0.1 mol/l鹽酸定容至100 ml，即得100.0 g/ml l-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，此溶液在冰箱內(nèi)貯存。12. 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用100 g/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制0100 g/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。試管號012345取 100 g/ml 酪氨酸溶液（ ml ）0246810蒸餾水（ ml ）1086420酪氨酸實際濃度（g/ml ）020406080100取上述不同濃度的酪氨酸1 ml與5 ml 0.4 mol/l na2co3、1 ml folin試劑混合，40 水浴顯色30

11、min，680 nm測定吸收值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試管號012345取不同濃度的酪氨酸溶液（ ml ）10.4 mol/l na2co3（ ml ）5folin試劑140 水浴顯色30 min取出用分光光度計于波長680 nm比色，以不含酪氨酸的0管為空白調(diào)零，分別測定吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。計算出當(dāng)od為1時的酪氨酸的量（g），即為吸光常數(shù)k值，其k值應(yīng)在95100范圍內(nèi)。 13. 樣品測定 13.1 先將干酪素溶液放入400.2恒溫水浴中，預(yù)熱5 min。13.2 取4支試管，各加入1 ml酶液。13.3 取一支作為空白管，加2 ml三氯

12、乙酸，其他3管作為測試管各加入1 ml干酪素，搖勻，40保溫10 min。13.4 取出試管，3支測試管中各加入2 ml三氯乙酸，空白管中加1 ml干酪素。 13.5 靜置10 min，使蛋白質(zhì)完全沉淀，然后用濾紙過濾沉淀。13.6 各取1 ml濾液，分別加0.4 mol/l的 na2co3 5 ml、folin試劑1 ml。在40顯色30 min。680 nm處測od值。 以空白管調(diào)零點。 五、結(jié)果計算 1. 酶活定義 1g固體酶粉（或1ml液體酶），在40（酸性ph=3.0、中性ph=7.5、堿性ph=10.5）條件下，1 min水解干酪素產(chǎn)生1 g酪氨酸為一個酶活力單位。 2. 計算酶的

13、活性單位依據(jù)以下公式 蛋白酶的活力= ak4/10n u/g(ml) a：樣品平行試驗的平均od值 k：吸光常數(shù) 4：反應(yīng)試劑的總體積 10：酶解反應(yīng)時間 n：酶液稀釋總倍數(shù)項目三 碳源對菌株產(chǎn)纖溶酶活力的影響一、實驗材料1. 實驗原料：高產(chǎn)豆豉纖溶酶菌株2. 試劑：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂粉、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、干酪素、麥芽糖、甘露糖、果糖、甘露醇、玉米淀粉、大豆粉、四棱豆粉，三氯乙酸，naoh，na2co3，folin試劑，蒸餾水等。3. 器皿：三角瓶，培養(yǎng)皿，吸管，試管，涂布棒，高壓滅菌鍋，天平、振蕩混合器、具塞比色試管等。4. 儀器設(shè)備：分光光度計、滅菌鍋。二、實驗操作步驟1

14、. 培養(yǎng)基制備（1）選擇平板的配制（%）：蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化鈉0.5，干酪素 2.0，瓊脂粉2.0，121，滅菌20 min。預(yù)備實驗（劉炎平、申超凡）（2）擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制（%）：葡萄糖1.0，蛋白胨1.0，氯化鈉0.5，15150的試管裝6 ml，121，滅菌20 min。預(yù)備實驗1（劉炎平、申超凡）（3）發(fā)酵培養(yǎng)基1的配制（%）：葡萄糖2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（4）發(fā)酵培養(yǎng)基2的配制（%）：蔗糖2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，

15、250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（5）發(fā)酵培養(yǎng)基3的配制（%）：可溶性淀粉 2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（6）發(fā)酵培養(yǎng)基4的配制（%）：干酪素 2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（7）發(fā)酵培養(yǎng)基5的配制（%）：玉米淀粉2.0，

16、蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（8）發(fā)酵培養(yǎng)基6的配制（%）：麥芽糖2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（9）發(fā)酵培養(yǎng)基7的配制（%）：甘露醇2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（10）發(fā)酵培養(yǎng)基8的配制（

17、%）：糊精2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（11）發(fā)酵培養(yǎng)基9的配制（%）：果糖2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（12）發(fā)酵培養(yǎng)基10的配制（%）：四菱豆粉2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（1

18、3）發(fā)酵培養(yǎng)基11的配制（%）：大豆粉2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）2. folin試劑的配制 2.1 folin試劑在250 ml磨口回流瓶中，加入20 g鎢酸鈉，5 g鉬酸鈉及140 ml蒸餾水，再加10 ml85%磷酸，20 ml濃鹽酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10 h。回流結(jié)束時，加入30g 硫酸鋰，10 ml蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15 min，以便驅(qū)除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。轉(zhuǎn)移至2

19、00ml容量瓶，用少量蒸餾水洗滌回流瓶，洗滌液一并轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶，定容至200 ml，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。2.2 folin試劑使用液使用前，將folin試劑與水按1:2稀釋。3. 0.4 mol/l碳酸鈉溶液的配制 準(zhǔn)確稱取無水碳酸鈉42.4 g，以蒸餾水溶解定溶至1000 ml。4. 0.4 mol/l的三氯乙酸溶液的配制 準(zhǔn)確稱取65.4三氯乙酸，以蒸餾水溶解定溶至1000 ml。5. 0.5 mol/l的naoh的配制 準(zhǔn)確稱取2 g naoh溶解并定至100 ml。6. ph7.2磷酸緩沖液的制備 取28mla液、72 ml b液混合后，用蒸餾水稀釋1倍，即為ph

20、7.2磷酸緩沖液。a液（0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液）稱取31.2 g nah2po3.2h2o，用蒸餾水溶解后定容至1000 ml。b液（0.2mol/l磷酸氫二鈉溶液）稱取71.6 g na2hpo3.12h2o，用蒸餾水溶解后定容至1000 ml。7. 20.00 mg/ml干酪素溶液的制備 預(yù)備實驗（劉炎平、申超凡）稱取干酪素2.000 g，準(zhǔn)確至0.001 g，用少量的0.5 mol/l的氫氧化鈉溶液(若為酸性蛋白酶則用濃乳酸2 3滴)潤濕，加入約80 mlph7.2磷酸緩沖液，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，用適宜的緩沖液稀釋至刻度，此溶液

21、在冰箱內(nèi)貯存。8. 粗酶液的制備用接種環(huán)從試管斜面上挑取一環(huán)菌株，在選擇平板上劃線，37倒置培養(yǎng)20 h，挑選有明顯水解圈的單菌落轉(zhuǎn)接入試管擴(kuò)大培養(yǎng)液中37震蕩培養(yǎng)6 h，按2%的比例分別轉(zhuǎn)接入裝有50 ml不同發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中（3瓶）繼續(xù)37震蕩培養(yǎng)20 h，4，5000 rpm離心10 min，收集上清液為粗酶液。9. 酶活的測定取粗酶液1ml，按照福林試劑法測定其纖溶酶活力，研究碳源對產(chǎn)酶的影響，通過酶活力確定最佳碳源。項目四 氮源對菌株產(chǎn)纖溶酶活力的影響一、實驗材料1. 實驗原料：高產(chǎn)豆豉纖溶酶菌株2. 試劑：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、干酪素、瓊脂粉、葡萄糖、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵

22、母膏(粉)、牛肉膏(粉)、干酪素、硝酸鉀、硝酸銨、脲素、硝酸鈉，三氯乙酸，naoh，na2co3，folin試劑，蒸餾水等。3. 器皿：三角瓶，培養(yǎng)皿，吸管，試管，涂布棒，高壓滅菌鍋，天平、振蕩混合器、具塞比色試管等。4. 儀器設(shè)備：分光光度計、滅菌鍋。二、實驗操作步驟1. 培養(yǎng)基制備（1）選擇平板的配制（%）：蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化鈉0.5，干酪素 2.0，瓊脂粉2.0，121，滅菌20 min。預(yù)備實驗（鄒白玲、黃云虹）（2）擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制（%）：葡萄糖1.0，蛋白胨1.0，氯化鈉0.5，15150的試管裝6 ml，121，滅菌20 min。預(yù)備實驗1（鄒白玲、黃云虹）（3）發(fā)

23、酵培養(yǎng)基1的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（4）發(fā)酵培養(yǎng)基2的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，大豆蛋白胨2.0，氯化鈉0.5， 250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（5）發(fā)酵培養(yǎng)基3的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，胰蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 m

24、l三角瓶，50 ml/三角瓶）（6）發(fā)酵培養(yǎng)基4的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，酵母膏(粉)2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（7）發(fā)酵培養(yǎng)基5的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，牛肉膏(粉)2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（8）發(fā)酵培養(yǎng)基6的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，干酪素2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 m

25、in。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（9）發(fā)酵培養(yǎng)基7的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，硝酸鉀2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（10）發(fā)酵培養(yǎng)基8的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，硝酸銨2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（11）發(fā)酵培養(yǎng)基9的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，脲素2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為

26、50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（12）發(fā)酵培養(yǎng)基10的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，硝酸鈉2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（13）發(fā)酵培養(yǎng)基11的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，大豆蛋白胨1.0，牛肉膏 1.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）2. folin試劑的配制 2.1 folin試

27、劑在250 ml磨口回流瓶中，加入20 g鎢酸鈉，5 g鉬酸鈉及140 ml蒸餾水，再加10 ml85%磷酸，20 ml濃鹽酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10 h。回流結(jié)束時，加入30g 硫酸鋰，10 ml蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15 min，以便驅(qū)除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶，用少量蒸餾水洗滌回流瓶，洗滌液一并轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶，定容至200 ml，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。2.2 folin試劑使用液使用前，將folin試劑與水按1:2稀釋。待添加的隱藏文字內(nèi)容13. 0.4 mol/l碳酸鈉溶液的

28、配制 準(zhǔn)確稱取無水碳酸鈉42.4 g，以蒸餾水溶解定溶至1000 ml。4. 0.4 mol/l的三氯乙酸溶液的配制 準(zhǔn)確稱取65.4三氯乙酸，以蒸餾水溶解定溶至1000 ml。5. 0.5 mol/l的naoh的配制 準(zhǔn)確稱取2 g naoh溶解并定至100 ml。6. ph7.2磷酸緩沖液的制備 取28mla液、72 ml b液混合后，用蒸餾水稀釋1倍，即為ph7.2磷酸緩沖液。a液（0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液）稱取31.2 g nah2po3.2h2o，用蒸餾水溶解后定容至1000 ml。b液（0.2mol/l磷酸氫二鈉溶液）稱取71.6 g na2hpo3.12h2o，用蒸餾水溶解

29、后定容至1000 ml。7. 20.00 mg/ml干酪素溶液的制備 預(yù)備實驗（鄒白玲、黃云虹）稱取干酪素2.000 g，準(zhǔn)確至0.001 g，用少量的0.5 mol/l的氫氧化鈉溶液(若為酸性蛋白酶則用濃乳酸2 3滴)潤濕，加入約80 mlph7.2磷酸緩沖液，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，用適宜的緩沖液稀釋至刻度，此溶液在冰箱內(nèi)貯存。8. 粗酶液的制備用接種環(huán)從試管斜面上挑取一環(huán)菌株，在選擇平板上劃線，37倒置培養(yǎng)20 h，挑選有明顯水解圈的單菌落轉(zhuǎn)接入試管擴(kuò)大培養(yǎng)液中37震蕩培養(yǎng)6 h，按2%的比例分別轉(zhuǎn)接入裝有50 ml不同發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中

30、（3瓶）繼續(xù)37震蕩培養(yǎng)20 h，4，5000 rpm離心10 min，收集上清液為粗酶液。9. 酶活的測定取粗酶液1ml，按照福林試劑法測定纖溶酶活力，研究氮源對產(chǎn)酶的影響，通過酶活力確定最佳氮源。項目五 正交實驗優(yōu)化無機(jī)鹽對菌株產(chǎn)纖溶酶活力的影響一、實驗材料1. 實驗原料：高產(chǎn)豆豉纖溶酶菌株2. 試劑：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、干酪素、瓊脂粉、葡萄糖、胰蛋白胨、k2hpo4, kh2po4, mgso4, cac12，三氯乙酸，naoh，na2co3，folin試劑，蒸餾水等。3. 器皿：三角瓶，培養(yǎng)皿，吸管，試管，涂布棒，高壓滅菌鍋，天平、振蕩混合器、具塞比色試管等。4. 儀器設(shè)備：分光光

31、度計、滅菌鍋。二、實驗操作步驟1. 選擇平板的配制（%）：蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化鈉0.5，干酪素 2.0，瓊脂粉2.0，121，滅菌20 min。預(yù)備實驗（周維、丁超）2. 擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制（%）：葡萄糖1.0，胰蛋白胨1.0，氯化鈉0.5，15150的試管裝6 ml，121，滅菌20 min。預(yù)備實驗1（周維、丁超）3. l9(34)正交實驗因素水平表k2hpo4(%)kh2po4(%)mgso4(%)cac12(%)10.050.050.025020.10.10.050.0230.150.150.0750.044. l9(34)正交實驗設(shè)計表k2hpo4(%)kh2po4(%)m

32、gso4(%)cac12(%)11(0.05)1(0.05)1(0.025)1(0)21(0.05)2(0.1)2(0.05)2(0.02)31(0.05)3(0.15)3(0.075)3(0.04)42(0.10)1(0.05)2(0.05)3(0.04)52(0.1)2(0.1)3(0.075)1(0)62(0.1)3(0.15)1(0.025)2(0.02)73(0.15)1(0.05)3(0.075)2(0.02)83(0.15)2(0.1)1(0.025)3(0.04)93(0.15)3(0.15)2(0.05)1(0)5. 發(fā)酵培養(yǎng)基的制備（1）培養(yǎng)基1(%)：可溶性淀粉 2.0，

33、胰蛋白胨2.0，k2hpo4 0.1，kh2po4 0.1，mgso4 0.025，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（2）培養(yǎng)基2(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，k2hpo4 0.1，kh2po4 0.2，mgso4 0.05，cac12 0.02，250 ml三角瓶裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（3）培養(yǎng)基3(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，k2hpo4 0.1，kh2po4 0.3，mgso4 0.075，cac12 0.04，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（4）培養(yǎng)基4(%)：可溶

34、性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，k2hpo4 0.2，kh2po4 0.1，mgso4 0.05，cac12 0.04，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（5）培養(yǎng)基5(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，k2hpo4 0.2，kh2po4 0.2，mgso4 0.075，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（6）培養(yǎng)基6(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，k2hpo4 0.2，kh2po4 0.3，mgso4 0.025，cac12 0.02，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（7）培

35、養(yǎng)基7(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，k2hpo4 0.3，kh2po4 0.1，mgso4 0.075，cac12 0.02，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（8）培養(yǎng)基8(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，k2hpo4 0.3，kh2po4 0.2，mgso4 0.025，cac12 0.04，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（9）培養(yǎng)基9(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，k2hpo4 0.3，kh2po4 0.3，mgso4 0.05，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20

36、 min。（10）發(fā)酵培養(yǎng)基10的配制（%）：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（11）培養(yǎng)基11(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，酵母膏 0.5，氯化鈉0.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。2. folin試劑的配制 2.1 folin試劑在250 ml磨口回流瓶中，加入20 g鎢酸鈉，5 g鉬酸鈉及140 ml蒸餾水，再加10 ml85%磷酸，20 ml濃鹽酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10 h?；亓鹘Y(jié)束時，加入30g 硫酸鋰，10 ml蒸餾水及數(shù)滴液體

37、溴，開口繼續(xù)沸騰15 min，以便驅(qū)除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶，用少量蒸餾水洗滌回流瓶，洗滌液一并轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶，定容至200 ml，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。2.2 folin試劑使用液使用前，將folin試劑與水按1:2稀釋。3. 0.4 mol/l碳酸鈉溶液的配制 準(zhǔn)確稱取無水碳酸鈉42.4 g，以蒸餾水溶解定溶至1000 ml。4. 0.4 mol/l的三氯乙酸溶液的配制 準(zhǔn)確稱取65.4三氯乙酸，以蒸餾水溶解定溶至1000 ml。5. 0.5 mol/l的naoh的配制 準(zhǔn)確稱取2 g naoh溶解并定至

38、100 ml。6. ph7.2磷酸緩沖液的制備 取28mla液、72 ml b液混合后，用蒸餾水稀釋1倍，即為ph7.2磷酸緩沖液。a液（0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液）稱取31.2 g nah2po3.2h2o，用蒸餾水溶解后定容至1000 ml。b液（0.2mol/l磷酸氫二鈉溶液）稱取71.6 g na2hpo3.12h2o，用蒸餾水溶解后定容至1000 ml。7. 20.00 mg/ml干酪素溶液的制備 預(yù)備實驗（周維、丁超）稱取干酪素2.000 g，準(zhǔn)確至0.001 g，用少量的0.5 mol/l的氫氧化鈉溶液(若為酸性蛋白酶則用濃乳酸2 3滴)潤濕，加入約80 mlph7.2磷酸緩

39、沖液，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，用適宜的緩沖液稀釋至刻度，此溶液在冰箱內(nèi)貯存。配制2瓶，各100 ml。8. 粗酶液的制備用接種環(huán)從試管斜面上挑取一環(huán)菌株，在選擇平板上劃線，37倒置培養(yǎng)20 h，挑選有明顯水解圈的單菌落轉(zhuǎn)接入試管擴(kuò)大培養(yǎng)液中37震蕩培養(yǎng)6 h，按2%的比例分別轉(zhuǎn)接入裝有50 ml不同發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中（3瓶）繼續(xù)37震蕩培養(yǎng)20 h，4，5000 rpm離心10 min，收集上清液為粗酶液。9. 酶活的測定取粗酶液1ml，按照福林試劑法測定纖溶酶活力，研究各培養(yǎng)基中纖溶酶活力的大小，確定最佳無機(jī)離子。項目六 起始ph對菌株產(chǎn)纖溶

40、酶活力的影響一、實驗材料1. 實驗原料：高產(chǎn)豆豉纖溶酶菌株2. 試劑：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、干酪素、瓊脂粉、葡萄糖、胰蛋白胨，三氯乙酸，naoh，na2co3，folin試劑，蒸餾水等。3. 器皿：三角瓶，培養(yǎng)皿，吸管，試管，涂布棒，高壓滅菌鍋，天平、振蕩混合器、具塞比色試管等。4. 儀器設(shè)備：分光光度計、滅菌鍋。二、實驗操作步驟1. 選擇平板的配制（%）：蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化鈉0.5，干酪素 2.0，瓊脂粉2.0，121，滅菌20 min。預(yù)備實驗（劉雅麗、李艷梅）2. 擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制（%）：葡萄糖1.0，胰蛋白胨1.0，氯化鈉0.5，15150的試管裝6 ml，121，滅菌

41、20 min。預(yù)備實驗1（劉雅麗、李艷梅）3. 1 mol/l hcl 50 ml預(yù)備實驗1（劉雅麗、李艷梅）4. 1 mol/l naoh 50 ml預(yù)備實驗1（劉雅麗、李艷梅）5. 發(fā)酵培養(yǎng)基1的配制（%）：經(jīng)前幾次實驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/l的鹽酸溶液調(diào)ph 至4.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）4. 發(fā)酵培養(yǎng)基2的配制（%）：經(jīng)前幾次實驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/l的鹽酸溶液調(diào)ph 至5.0，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分

42、裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（3）發(fā)酵培養(yǎng)基3的配制（%）：經(jīng)前幾次實驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/l的鹽酸溶液調(diào)ph 至5.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（4）發(fā)酵培養(yǎng)基4的配制（%）：經(jīng)前幾次實驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/l的鹽酸溶液調(diào)ph 至6.0，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（5）發(fā)酵培養(yǎng)基5的配制（%）：經(jīng)前幾次實驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/l的鹽酸溶液

43、調(diào)ph 至6.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（6）發(fā)酵培養(yǎng)基6的配制（%）：經(jīng)前幾次實驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/l的鹽酸溶液或1mol/l的naoh溶液調(diào)ph 至7.0，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（7）發(fā)酵培養(yǎng)基7的配制（%）：經(jīng)前幾次實驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/l的naoh溶液調(diào)ph 至7.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，

44、分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（8）發(fā)酵培養(yǎng)基8的配制（%）：經(jīng)前幾次實驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/l的naoh溶液調(diào)ph 至8.0，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（9）發(fā)酵培養(yǎng)基9的配制（%）：經(jīng)前幾次實驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/l的naoh溶液調(diào)ph 至8.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（10）發(fā)酵培養(yǎng)基10的配制（%）：經(jīng)前幾次實驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol

45、/l的naoh溶液調(diào)ph 至9.0，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）（11）發(fā)酵培養(yǎng)基11的配制（%）：經(jīng)前幾次實驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/l的naoh溶液調(diào)ph 至9.5，250 ml三角瓶的裝瓶量為50 ml，121，滅菌20 min。（150 ml，分裝成3個250 ml三角瓶，50 ml/三角瓶）2. folin試劑的配制 2.1 folin試劑在250 ml磨口回流瓶中，加入20 g鎢酸鈉，5 g鉬酸鈉及140 ml蒸餾水，再加10 ml85%磷酸，20 ml濃鹽酸，充分混合，接上

46、回流冷凝管，以小火回流10 h?；亓鹘Y(jié)束時，加入30g 硫酸鋰，10 ml蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15 min，以便驅(qū)除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶，用少量蒸餾水洗滌回流瓶，洗滌液一并轉(zhuǎn)移至200ml容量瓶，定容至200 ml，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。2.2 folin試劑使用液使用前，將folin試劑與水按1:2稀釋。3. 0.4 mol/l碳酸鈉溶液的配制 準(zhǔn)確稱取無水碳酸鈉42.4 g，以蒸餾水溶解定溶至1000 ml。4. 0.4 mol/l的三氯乙酸溶液的配制 準(zhǔn)確稱取65.4三氯乙酸，以蒸餾水溶解定溶至1

47、000 ml。5. 0.5 mol/l的naoh的配制 準(zhǔn)確稱取2 g naoh溶解并定至100 ml。6. ph7.2磷酸緩沖液的制備 取28mla液、72 ml b液混合后，用蒸餾水稀釋1倍，即為ph7.2磷酸緩沖液。a液（0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液）稱取31.2 g nah2po3.2h2o，用蒸餾水溶解后定容至1000 ml。b液（0.2mol/l磷酸氫二鈉溶液）稱取71.6 g na2hpo3.12h2o，用蒸餾水溶解后定容至1000 ml。7. 20.00 mg/ml干酪素溶液的制備 預(yù)備實驗1（劉雅麗、李艷梅）稱取干酪素2.000 g，準(zhǔn)確至0.001 g，用少量的0.5 m

48、ol/l的氫氧化鈉溶液(若為酸性蛋白酶則用濃乳酸2 3滴)潤濕，加入約80 mlph7.2磷酸緩沖液，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，用適宜的緩沖液稀釋至刻度，此溶液在冰箱內(nèi)貯存。配制2瓶，各100 ml。8. 粗酶液的制備用接種環(huán)從試管斜面上挑取一環(huán)菌株，在選擇平板上劃線，37倒置培養(yǎng)20 h，挑選有明顯水解圈的單菌落轉(zhuǎn)接入試管擴(kuò)大培養(yǎng)液中37震蕩培養(yǎng)6 h，按2%的比例分別轉(zhuǎn)接入裝有50 ml不同發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中（3瓶）繼續(xù)37震蕩培養(yǎng)20 h，4，5000 rpm離心10 min，收集上清液為粗酶液。9. 酶活的測定取粗酶液1ml，按照福林試劑法測定纖溶酶活力，研究各培養(yǎng)基中纖溶酶活力的大小，確定最佳無機(jī)離子。項目七 芽孢桿菌be1304生長曲線及其產(chǎn)溶酶活力變化曲線的測定一、實驗材料1. 實驗原料：高產(chǎn)纖溶酶芽孢桿菌be13042. 試劑：蛋白胨、牛肉膏、