儀器分析精品課程課件-第三章2 高效液相色譜

1、1 高效液相色譜高效液相色譜 2 3 高效液相色譜高效液相色譜 4 一、概述一、概述 定義定義 高效液相色譜高效液相色譜 5 一、概述一、概述 特點特點 6 GCGC與與HPLCHPLC比較比較 GCHPLC 流動相流動相惰性氣體（無親和性，只惰性氣體（無親和性，只 起運載作用）起運載作用） 氣體、沸點較低的化合物氣體、沸點較低的化合物 不同極性的液體（有一定不同極性的液體（有一定 親和作用）親和作用） 溫溫 度度 較高較高一般室溫一般室溫 分析對象分析對象 高沸點、不穩(wěn)定的天然產高沸點、不穩(wěn)定的天然產 物、生物大分子、高分子物、生物大分子、高分子 化合物化合物 7 一、一、概述概述 - 分類

2、分類 (1) (1) 分配色譜分配色譜 (2) (2) 吸附或液固色譜吸附或液固色譜 (3) (3) 離子色譜離子色譜 (4) (4) 凝膠色譜或尺寸排阻色譜凝膠色譜或尺寸排阻色譜 8 二、各種色譜方法二、各種色譜方法 9 （一）分配色譜（一）分配色譜 10 （一）分配色譜（一）分配色譜 分離原理分離原理 11 （一）分配色譜（一）分配色譜- - 固定相固定相 12 R - 極性基團極性基團 疏水基團疏水基團 Si Si OO O HCl Si Si O OH OH Cl Si(CH3)2R Si Si O O O Si(CH3)2R Si(CH3)2R （一）分配色譜（一）分配色譜- - 固

3、定相固定相 OH OH 14 固定相性質固定相性質 極性極性非極性非極性 鍵合基團鍵合基團 極性基團極性基團疏水基團疏水基團 流動相性質流動相性質 非極性非極性極性極性 出峰順序出峰順序 極性小先出極性小先出極性大先出極性大先出 15 （二）吸附色譜（二）吸附色譜 分離原理分離原理 16 以固體吸附劑為固定相，如硅以固體吸附劑為固定相，如硅 膠、氧化鋁等，較常使用的是膠、氧化鋁等，較常使用的是5 5 10m10m的硅膠吸附劑。流動相可以是的硅膠吸附劑。流動相可以是 各種不同極性的一元或多元溶劑各種不同極性的一元或多元溶劑。 17 固定相為離子交換樹固定相為離子交換樹 脂，流動相為無機酸脂，流動

4、相為無機酸 或無機堿的水溶液?；驘o機堿的水溶液。 各種離子根據它們與樹脂上的交換基各種離子根據它們與樹脂上的交換基 團的交換能力的不同而得到分離。團的交換能力的不同而得到分離。 18 19 （四）排阻色譜法（四）排阻色譜法 20 1. 1. 軟凝膠：軟凝膠：鉸鏈葡萄糖的多孔聚合物，鉸鏈葡萄糖的多孔聚合物， 聚丙烯酰胺凝膠。（凝膠過濾色譜）聚丙烯酰胺凝膠。（凝膠過濾色譜） 2. 2. 半硬凝膠：半硬凝膠：聚苯乙烯珠（凝膠滲透色譜）聚苯乙烯珠（凝膠滲透色譜） 高硬凝膠和玻璃：高硬凝膠和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球，多孔玻璃或多孔硅球， 經化學鍵合處理，不隨壓力及溶劑改變經化學鍵合處理，不隨壓力及溶劑改

5、變 尺寸，（高效排阻色尺寸，（高效排阻色 譜）譜） 固定相固定相 21 （四）排阻色譜法（四）排阻色譜法 H P L C 應應 用用 概概 圖圖 23 流動液貯存提供脫氣流動液貯存提供脫氣 輸液泵輸液泵 進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng) 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 控制與記錄系統(tǒng)控制與記錄系統(tǒng) 三三、液相色譜儀液相色譜儀 24 25 26 1. 流動相貯存與脫氣流動相貯存與脫氣 27 2. 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng) 活塞泵活塞泵 注射泵注射泵 氣動泵氣動泵 29 注射泵注射泵 32 33 常用的柱子 34 微柱 35 36 5. HPLC 檢測器檢測器 38 （1 1）吸光檢測器）吸光檢測器 v 單波長單波長

6、UVUV檢測器，光源用檢測器，光源用HgHg燈，加濾光燈，加濾光 片可以到片可以到254254，280280，313313，334334，365365等。等。 生化中用到很多。生化中用到很多。 v 多波長多波長 光度計類似，光柵或棱鏡分光光度計類似，光柵或棱鏡分光 PMT/PD 單波長檢測單波長檢測 PDA 多波長同時檢測，三維多波長同時檢測，三維 Alg（I0/It)= b c Tungsten lamp Coupling lens Deuterium lamp Source lens (Achromat) Holmium oxide filter Support lens Flow cel

7、l Spectro lens Grating Array Programmable Slit Time Wavelength msec nm LIGHT SHIFT REGISTER SWITCH VIDEO LINE READOUT CYCLE PHOTODIODE CAPACITOR TRANSISTOR DiodeArray-Details 42 43 90%MeOH 0.5mLs/min coelute (2) (2) 熒光檢測器熒光檢測器 45 熒光強度與溶液濃度的關系：熒光強度與溶液濃度的關系： 熒光強度正比于吸收的光量與熒光量子產率熒光強度正比于吸收的光量與熒光量子產率F F I

8、f=FIa If-熒熒光強度光強度 Beers Law: Ia = I0 It = I0(1-10-e elc) I 0 _- 入射光強度入射光強度 ；I t -透射光強度透射光強度 e elc0.05, e e-2.3e elc = 1 2.3 e elc If = 2.3 F F Io e elc If = Kc 46 （2）熒光檢測器熒光檢測器 47 （3） 折光檢測器折光檢測器 48 (4)蒸發(fā)光散射檢測器 EvaporativeLightScatteringDetector(ELSD) 50 四、四、HPLCHPLC分離利用分離利用 基本原理基本原理- -色譜分離的本質色譜分離的本質 峰寬峰寬, , 保留值等保留值等 塔板理論塔板理論( (計算塔板高度計算塔板高度, ,柱長柱長, ,分離度等分離度等) ) 速率理論速率理論( (速率方程各項意義速率方程各項意義, ,影響因素影響因素) ) 對峰寬和分離效果的影響對峰寬和分離效果的影響, ,載氣的選擇等等載氣的選擇等等 分離條件的選擇分離條件的選擇 色譜固定相分類色譜固定相分類,選擇原則選擇原則,出峰順序出峰順序 柱長柱長,柱溫柱溫,載氣載氣 儀器儀器 哪些組成部分哪些組成部