第7章蛋白質(zhì)的分離純化與鑒定

1、protein engineering南華大學(xué)生化與分子生物學(xué)教研室辦公室第3教學(xué)樓315室版權(quán)聲明本課件版權(quán)所有未經(jīng)允許不得轉(zhuǎn)載。protein engineering曹運(yùn)長(zhǎng)博士、副教授南華大學(xué)生化與分子生物學(xué)教研室etel:eparationpurification and identification of proteins進(jìn)行蛋白修飾時(shí)需要單一蛋白質(zhì)為原料需要單一蛋白質(zhì)來(lái)研究其結(jié)構(gòu)與功能需要大量純化經(jīng)過(guò)改造的蛋白質(zhì)作為產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。為什么要分離、純化與鑒定蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分離、純化與鑒定的理論基礎(chǔ)分子大小帶電性質(zhì)變性與復(fù)性溶解特性結(jié)晶特性分子表面特性分子形狀紫外吸收特

2、性顏色反應(yīng)。透析、超濾、分子篩層析、page等電點(diǎn)沉淀、等電聚焦電泳、離子交換層析用尿素變性復(fù)性從包涵體中分離蛋白鹽析法分級(jí)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀結(jié)晶純化吸附層析親和層析蛋白定量分析雙縮脲反應(yīng)鑒定和定量蛋白蛋白定量分析親和層析蛋白定量分析吸附層析親和層析蛋白定量分析吸附層析蛋白定量分析吸附層析用尿素變性復(fù)性從包涵體中分離蛋白吸附層析用尿素變性復(fù)性從包涵體中分離蛋白第一節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化概述目的提高目標(biāo)蛋白的純度、產(chǎn)量、保持蛋白質(zhì)的活性。實(shí)驗(yàn)材料的選擇實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理蛋白質(zhì)粗分級(jí)蛋白質(zhì)細(xì)分級(jí)蛋白質(zhì)的結(jié)晶蛋白質(zhì)的鑒定。蛋白質(zhì)分離、純化與鑒定的主要步驟實(shí)驗(yàn)材料的選擇選擇標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)蛋白含量高所含雜質(zhì)少來(lái)源

3、廣、容易獲得成本低廉。實(shí)驗(yàn)材料有細(xì)胞、組織、器官甚至整個(gè)生物體。實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理液體材料離心、過(guò)濾后洗滌固體材料洗滌、材料破碎注意動(dòng)物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織油料種子等材料應(yīng)先用低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑如乙醚等脫脂。洗滌順序先自來(lái)水、后蒸餾水、蛋白質(zhì)提取緩沖液。細(xì)小材料洗滌方法將洗滌液懸浮材料、離心反復(fù)幾次。破碎方法組織、器官、整個(gè)生物體采用機(jī)械破碎即剪碎、研磨、勻漿、超聲、酶解、溶脹等方法。細(xì)菌、單細(xì)胞超聲、酶解、反復(fù)凍溶等方法。蛋白質(zhì)的提取離心或過(guò)濾去除不溶物得到蛋白質(zhì)粗提取物采用特定蛋白質(zhì)提取緩沖液抽提溶解蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)材料破碎后要求:釋放溶解目的蛋白防止其降解并保持目的蛋白的天然結(jié)構(gòu)和活性。蛋

4、白質(zhì)的粗分級(jí)目的:對(duì)蛋白提取液初步分離純化去除其他糖類(lèi)、脂類(lèi)、核酸等雜質(zhì)并初步去除其他雜蛋白得到濃縮后目標(biāo)蛋白的粗制品。方法鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀、透析、超濾、超速離心等。有些蛋白質(zhì)提取液體積較大又不適于用沉淀或鹽析法濃縮則可采用超過(guò)濾、凝膠過(guò)濾、冷凍真空干燥或其他方法如聚乙二醇濃縮法進(jìn)行濃縮。蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí)一般使用層析法包括凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時(shí)還可結(jié)合電泳法包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳等得到高純度的目標(biāo)蛋白樣品。注用于細(xì)分級(jí)分離的方法一般規(guī)模較小但分辨率很高。結(jié)晶是蛋白質(zhì)分離純化的最后步驟。盡管結(jié)晶并不能保證蛋白質(zhì)一定是均一的但只有某種蛋

5、白質(zhì)在溶液中數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)時(shí)才能形成結(jié)晶。結(jié)晶過(guò)程本身也伴隨著一定程度的純化而重結(jié)晶又可除去少量夾雜的蛋白質(zhì)。由于結(jié)晶中從未發(fā)現(xiàn)過(guò)變性蛋白質(zhì)因此蛋白質(zhì)的結(jié)晶不僅是純度的一個(gè)標(biāo)志也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標(biāo)。蛋白質(zhì)的鑒定目的確定蛋白質(zhì)的純度、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸組成及排列順序、結(jié)晶特性及高級(jí)結(jié)構(gòu)、免疫特性、生物學(xué)功能等。蛋白質(zhì)的純度色譜、電泳、結(jié)晶。分子質(zhì)量、等電點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠電泳、質(zhì)譜ief。氨基酸組成及排列順序高效液相色譜、edman降解法。結(jié)晶特性及高級(jí)結(jié)構(gòu)射線(xiàn)晶體衍射法、核磁共振法。免疫特性蛋白質(zhì)免疫印跡分析。生物學(xué)功能基因工程方法如轉(zhuǎn)基因、基因敲除、基因沉默等。第二節(jié)蛋白質(zhì)的

6、提取目標(biāo)保證蛋白質(zhì)溶解和維持天然的結(jié)構(gòu)和活性。條件選擇合適的蛋白質(zhì)提取緩沖液。緩沖液的成分控制溶液ph的緩沖對(duì)控制溶液離子強(qiáng)度的無(wú)機(jī)鹽控制溶液氧化還原狀態(tài)的還原劑蛋白酶抑制劑金屬離子螯合劑標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白去污劑水和防腐劑甘油。控制溶液ph的緩沖對(duì): 蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)蛋白質(zhì)含有酸/堿aa殘基具有兩性?決多數(shù)蛋白質(zhì)pi通常在6.0 左右。常用的緩沖對(duì)na2k2hpo4/ nakh2po4trisbase / hcltrisbase /gly巴比妥鈉/ hcl檸檬酸鈉/ 檸檬酸乙酸鈉/ 乙酸。溶液ph處在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度最低。因此溶液ph應(yīng)盡量遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)并接近其生理ph?？刂迫?/p>

7、液離子強(qiáng)度的無(wú)機(jī)鹽: 原理蛋白質(zhì)在生理環(huán)境中都處在一定離子強(qiáng)度的溶液中如動(dòng)物和人體液的離子強(qiáng)度相當(dāng)于0.9的生理鹽水。處于高滲或低滲的溶液中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變甚至失去活性。目的有助于維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能還有助于增加蛋白質(zhì)的溶解度。常用的無(wú)機(jī)鹽動(dòng)物蛋白抽提用nacl植物蛋白使用kcl?？刂迫芤貉趸€原狀態(tài)的還原劑: 原理細(xì)胞內(nèi)氧濃度細(xì)胞外大氣的氧濃度。蛋白質(zhì)提取出來(lái)后處于高濃度的氧環(huán)境易氧化。氧化的基團(tuán)巰基。結(jié)果蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或失活。措施加入還原劑如-巰基乙醇、dtt二硫蘇糖醇。蛋白酶抑制劑: 原理在細(xì)胞內(nèi)蛋白酶處于特定的區(qū)域植物細(xì)胞液泡動(dòng)物細(xì)胞溶酶體。細(xì)胞破碎后目標(biāo)蛋白質(zhì)與蛋白酶直接

8、接觸導(dǎo)致降解。措施加入蛋白酶抑制劑。金屬離子螯合劑: 原理金屬離子對(duì)目標(biāo)蛋白具有一定影響。措施加入金屬離子螯合劑如乙二胺四乙酸edta同時(shí)也是金屬蛋白酶的強(qiáng)烈抑制劑。標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白: 原理蛋白質(zhì)在高濃度條件下蛋白質(zhì)之間會(huì)發(fā)生相互作用可減少溶劑對(duì)蛋白質(zhì)的影響維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。措施加入一定濃度的bsa。去污劑: 原理去污劑易使細(xì)胞破碎有利于提取膜蛋白。常用的去污劑triton x-100tween-20 80sdschaps3-3-膽酰胺丙基-二乙胺-丙磺酸用途兩性表面活性劑chaps是一種非變性的zwitterionic去垢劑、蛋白質(zhì)裂解液用于增溶膜蛋白和裂解蛋白-蛋白之間的相互作用。原理ch

9、aps保護(hù)蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)可溶解膜蛋白從而解除蛋白與蛋白質(zhì)間的相互作用。透析可除去等。注意低濃度去污劑利于蛋白質(zhì)溶解高濃度的去污劑會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。水和防腐劑: 甘油: 原理為避免細(xì)菌和其它雜質(zhì)污染配制緩沖液通常選用蒸餾水、雙蒸水、三蒸水、去離子水使用時(shí)高壓滅菌。有時(shí)還需加防腐劑如nan3等。原理甘油利于維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性。通常加入2050終濃度的甘油。舉例酶試劑常用50的甘油保存于-20。第三節(jié)蛋白質(zhì)的粗分級(jí)目的得到蛋白粗提取液后濃縮目標(biāo)蛋白去除部分雜質(zhì)。硫酸銨分級(jí)沉淀鹽析法有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀超速離心等電點(diǎn)沉淀透析超濾蛋白質(zhì)結(jié)晶。粗分級(jí)方法一、硫酸銨分級(jí)沉淀: 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)colloi

10、dal system膠體溶液的特點(diǎn)分子直徑在1-100 nm內(nèi)、溶于水、不易聚集沉淀。蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素1.同種蛋白帶同種電荷相互排斥。2.表面有水化膜。蛋白質(zhì)分子表面的親水基團(tuán)如一nh2-cooh -oh以及co-nh-等在水溶液中能與水分子起水化作用使蛋白質(zhì)分子表面形成一個(gè)水化層每克蛋白質(zhì)分子能結(jié)合0.30.5克水。鹽析蛋白質(zhì)在高濃度的中性鹽溶液中會(huì)沉淀析出。原理破壞水化膜、中和表面電荷。鹽通常為硫酸銨。硫酸銨分級(jí)沉淀由于不同蛋白質(zhì)沉淀所需的鹽離子濃度不同因此調(diào)節(jié)硫酸銨濃度可使不同的蛋白質(zhì)分階段沉淀下來(lái)。優(yōu)點(diǎn)硫酸銨溶解度高、溶解過(guò)程發(fā)熱少、蛋白沉淀完全、價(jià)格便宜。注鹽析沉淀一般不引起

11、蛋白質(zhì)變性。當(dāng)除去鹽后復(fù)可溶解。?向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會(huì)沉淀析出?原因鹽析注意事項(xiàng)硫酸銨溶解度和溶液溫度的關(guān)系。解決方法提取一般在低溫下進(jìn)行。添加固體硫酸銨時(shí)會(huì)造成局部濃度過(guò)大而導(dǎo)致蛋白質(zhì)不可逆變性。解決方法邊加邊攪拌或加飽和硫酸銨溶液。實(shí)例25下往蛋白粗提液中加入20硫酸銨攪拌溶解3060min蛋白質(zhì)沉淀離心回收繼續(xù)提高上清液中硫酸銨濃度至40 攪拌溶解3060min蛋白質(zhì)沉淀離心回收繼續(xù)提高硫酸銨濃度至55 攪拌溶解3060min蛋白質(zhì)沉淀離心回收共得到a、b、c和上清液四部分。優(yōu)點(diǎn)使蛋白得到初步純化并使蛋白得到了濃縮。缺陷分辨率不高蛋白質(zhì)中含高鹽需脫鹽使用透析、超濾、凝膠

12、過(guò)濾等。二、有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀: 原理原理一是有機(jī)溶劑會(huì)降低水的介電常數(shù)導(dǎo)致一是有機(jī)溶劑會(huì)降低水的介電常數(shù)導(dǎo)致降低降低蛋白質(zhì)顆蛋白質(zhì)顆粒之間的相互排斥作用。二是會(huì)與蛋白爭(zhēng)奪水分子粒之間的相互排斥作用。二是會(huì)與蛋白爭(zhēng)奪水分子破壞水化破壞水化膜膜。常用的有機(jī)溶劑常用的有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、丙酮。甲醇、乙醇、丙酮。有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀不同蛋白質(zhì)分子表面的極性與非極性氨不同蛋白質(zhì)分子表面的極性與非極性氨基酸比例不同沉淀所需有機(jī)溶劑的濃度也不同。從而將不同基酸比例不同沉淀所需有機(jī)溶劑的濃度也不同。從而將不同的蛋白質(zhì)分離。的蛋白質(zhì)分離。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)分辨能力高、蛋白沉淀后無(wú)需脫鹽、有機(jī)溶劑易去除。分辨能

13、力高、蛋白沉淀后無(wú)需脫鹽、有機(jī)溶劑易去除。缺點(diǎn)缺點(diǎn)易引起蛋白質(zhì)變性。易引起蛋白質(zhì)變性。嚴(yán)格控制在低溫下操作、并盡量縮嚴(yán)格控制在低溫下操作、并盡量縮短處理時(shí)間則可使變性速度減慢。短處理時(shí)間則可使變性速度減慢。三、超速離心法centrifugation: 在離心力作用下溶液中不溶顆粒物會(huì)沉淀析出進(jìn)而分離。離心力表示方法相對(duì)離心力rcf離心力常用地球引力的倍數(shù)來(lái)表示。用數(shù)字g0.98m/s2來(lái)表示。如1 000g。每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)rpm與rcf之間的換算用公式rcf1.119105rpm2r r 為離心機(jī)轉(zhuǎn)頭半徑注意相對(duì)離心力rcf與離心機(jī)轉(zhuǎn)頭半徑無(wú)關(guān)。每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)rpm與離心機(jī)轉(zhuǎn)頭半徑有關(guān)。離心沉降速率與

14、物質(zhì)顆粒大小關(guān)系顆粒越小需要的離心力越大離心時(shí)間越長(zhǎng)。離心機(jī)型號(hào)的分類(lèi)根據(jù)轉(zhuǎn)速普通離心機(jī)最大離心力小于50006000g. 用于組織碎片、細(xì)胞的沉淀。高速冷凍離心機(jī)小于8000090000g有制冷和真空系統(tǒng)。用于亞細(xì)胞器的沉淀。超速離心機(jī)50萬(wàn)60萬(wàn)g。用于病毒、核酸、蛋白的沉淀。使用前應(yīng)平衡普通離心機(jī)對(duì)稱(chēng)兩管誤差小于0.1g高速冷凍和超速離心機(jī)誤差應(yīng)小于0.01g。實(shí)例采用有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀后得到的肌肉丙酮粉采用超速離心分離肌動(dòng)蛋白。四、等電點(diǎn)沉淀法: 不同蛋白其pi不同。調(diào)整溶液ph不同蛋白在各自pi處依次沉淀分子間相互排斥作用力消失導(dǎo)致易聚集而沉淀?？稍俳Y(jié)合離心法或凝膠電泳分離。等電點(diǎn)沉淀

15、法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):沉淀分離得到的蛋白質(zhì)不會(huì)發(fā)生變性可濃縮蛋白。缺點(diǎn)生物體內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相差不大如人體蛋白pi大多數(shù)為6.8一個(gè)ph 條件下沉淀得到的蛋白往往不只有一種蛋白。只能用于蛋白質(zhì)的粗分級(jí)。五、透析法dialysis: 利用蛋白質(zhì)分子不能透過(guò)半透膜將其與小分子物質(zhì)分開(kāi)半透膜為玻璃紙或纖維素材料。優(yōu)點(diǎn)不僅用于蛋白粗分級(jí)還可用于蛋白濃縮。六、超濾法super-filteration: 利用壓力、抽濾或離心力等使水和其它小分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜而蛋白質(zhì)被截留在膜上以達(dá)到濃縮和脫鹽目的。濾膜有多種規(guī)格可選擇性的截留相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)。七、結(jié)晶法: 天然蛋白質(zhì)在一定條件下濃度達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)時(shí)

16、就會(huì)結(jié)天然蛋白質(zhì)在一定條件下濃度達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)時(shí)就會(huì)結(jié)晶析出。有時(shí)由于沉淀劑的作用而聚集沉淀也可能形成結(jié)晶晶析出。有時(shí)由于沉淀劑的作用而聚集沉淀也可能形成結(jié)晶析出。如在高濃度硫酸銨作用下溶菌酶會(huì)形成晶體。析出。如在高濃度硫酸銨作用下溶菌酶會(huì)形成晶體。盡管結(jié)晶并不能保證蛋白質(zhì)一定是均一的但只有某種蛋盡管結(jié)晶并不能保證蛋白質(zhì)一定是均一的但只有某種蛋白質(zhì)在溶液中數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)時(shí)才能形成結(jié)晶。白質(zhì)在溶液中數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)時(shí)才能形成結(jié)晶。通常只有高活性、高純度、高濃度的蛋白質(zhì)才能結(jié)晶由于通常只有高活性、高純度、高濃度的蛋白質(zhì)才能結(jié)晶由于結(jié)晶中從未發(fā)現(xiàn)過(guò)變性蛋白質(zhì)結(jié)晶中從未發(fā)現(xiàn)過(guò)變性蛋白質(zhì)因此蛋白質(zhì)的結(jié)晶不僅是

17、因此蛋白質(zhì)的結(jié)晶不僅是純純度度的一個(gè)標(biāo)志也是斷定制品處于的一個(gè)標(biāo)志也是斷定制品處于天然狀態(tài)天然狀態(tài)的有力指標(biāo)。的有力指標(biāo)。意義意義蛋白質(zhì)晶體是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析的重要材料。蛋白質(zhì)晶體是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析的重要材料。八、其它方法: 重金屬鹽沉淀法蛋白質(zhì)顆粒如帶負(fù)電荷這樣它就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀法蛋白質(zhì)顆粒如帶正電荷容易與生物堿試劑和酸類(lèi)如三氯乙酸沉淀法的酸根負(fù)離子發(fā)生反應(yīng)生成不溶性鹽而沉淀。加熱變性沉淀法所有蛋白質(zhì)加熱后會(huì)發(fā)生變性而凝固。注意注意以上方法常能使蛋白質(zhì)發(fā)生變性。只有在純化變性以上方法常能使蛋白質(zhì)發(fā)生變性。只有在純化變性蛋白時(shí)才可使用這些分離

18、方法。蛋白時(shí)才可使用這些分離方法。問(wèn)答題以螺旋藻為材料從中分離純化藻膽蛋白。請(qǐng)簡(jiǎn)要敘述其實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線(xiàn)或?qū)嶒?yàn)方案。1. 實(shí)驗(yàn)材料的選擇2. 實(shí)驗(yàn)材料的預(yù)處理3. 藻膽蛋白的粗分級(jí)。第四節(jié)蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí)目的目的粗分級(jí)的蛋白產(chǎn)品的濃度、純度還需進(jìn)一步提高。粗分級(jí)的蛋白產(chǎn)品的濃度、純度還需進(jìn)一步提高。方法方法一般使用一般使用層析法層析法和和電泳法。層析法層析法又稱(chēng)之為色譜法。包括凝膠過(guò)濾、離子交換層析、又稱(chēng)之為色譜法。包括凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。吸附層析以及親和層析等。電泳法電泳法包括區(qū)帶電泳、等電聚焦電泳、雙向凝膠電泳等包括區(qū)帶電泳、等電聚焦電泳、雙向凝膠電泳等作為最后的純化

19、步驟。作為最后的純化步驟。注注用于細(xì)分級(jí)分離的材料一般規(guī)模較小但分辨率很高。用于細(xì)分級(jí)分離的材料一般規(guī)模較小但分辨率很高。一原理一原理凝膠層析也稱(chēng)為排阻凝膠層析、凝膠過(guò)濾和分凝膠層析也稱(chēng)為排阻凝膠層析、凝膠過(guò)濾和分子篩層析。子篩層析。它是利用凝膠把物質(zhì)按它是利用凝膠把物質(zhì)按分子大小不同進(jìn)行分離分子大小不同進(jìn)行分離的一種方法。的一種方法。洗脫時(shí)洗脫時(shí)大分子物質(zhì)大分子物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔不能進(jìn)入凝膠由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部只能沿著凝膠顆粒間的孔隙隨溶劑向下移動(dòng)因此內(nèi)部只能沿著凝膠顆粒間的孔隙隨溶劑向下移動(dòng)因此流程短首先流出層析柱流程短首先流出層析柱而小分子物質(zhì)而小分子物質(zhì)由于直徑小

20、于凝膠網(wǎng)孔能自由進(jìn)出膠粒網(wǎng)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔能自由進(jìn)出膠粒網(wǎng)孔使之洗脫時(shí)流程增長(zhǎng)移動(dòng)速度慢而后流出層析柱。孔使之洗脫時(shí)流程增長(zhǎng)移動(dòng)速度慢而后流出層析柱。一、凝膠層析分子篩層析: 分子篩層析二凝膠介質(zhì)1. 葡聚糖凝膠凝膠過(guò)濾常用的凝膠是交聯(lián)葡聚糖。為環(huán)氧丙烷交聯(lián)右旋糖苷制成。商品名為sephadex g。不同規(guī)格型號(hào)用英文字母g和數(shù)值表示有g(shù)-10g-15g-25g-50g-75g-100g-150和g-200。g后面數(shù)值為1克干膠吸水值的10倍。例如g-200為每克干膠吸水20克。g后面數(shù)值越大凝膠孔徑越大適于分離蛋白的質(zhì)量越大。此外還有sephadex lh-20lh-60是sephade

21、x g-25的羧丙基衍生物能溶于水及親脂溶劑用于分離脂溶性物質(zhì)。2. 瓊脂糖凝膠瓊脂糖是瓊脂中不帶電荷的中性組成成份為半乳糖及其衍生物以氫鍵方式相互連接凝聚而成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。商品名因生產(chǎn)廠家而異如agarose sigma sepharose pharmacia bio-gel-a bio-rad。把瓊脂糖溶于熱水冷卻后制成凝膠。制成的小顆粒用于凝膠過(guò)濾。適于用sephadex不能分級(jí)分離的大分子的凝膠過(guò)濾。瓊脂糖凝膠應(yīng)用于分子篩層析的不多主要作為凝膠基質(zhì)在其上連接其它分子制成離子交換層析、親和層析等介質(zhì)。3.聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺acr和甲叉雙丙烯酰胺bis交聯(lián)

22、而成。調(diào)節(jié)acr 和bis的濃度可制成孔徑大小不同的凝膠。交聯(lián)劑越多孔隙越小。商品名為bio-gel p主要由bio-rad公司生產(chǎn)適合蛋白和多糖的純化。4. sephacryl凝膠:由葡聚糖和甲叉雙丙烯酰胺組成為葡聚糖凝膠的改進(jìn)型。特點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度大、洗脫速度快。5. superdex凝膠由葡聚糖和瓊脂糖交聯(lián)而成。由pharmacia生產(chǎn)。有較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性和高的分辨率。6. superose凝膠由瓊脂糖交叉連接而成。由pharmacia生產(chǎn)。具有洗脫速度快、分辨率高、樣品容量大等優(yōu)點(diǎn)。1. 凝膠的預(yù)處理凝膠顆粒的溶脹。2. 裝凝膠層析柱:無(wú)斷層、無(wú)氣泡、床面平整。3. 平衡、上樣、洗脫、檢測(cè)與收集。平衡先蒸餾水洗脫平衡、后洗脫液洗脫平衡。4. 層析柱再生35體積的洗脫液洗脫平衡或用23倍體積的非離子去垢劑洗脫或用naoh浸泡再用蒸餾水清洗。5. 層析柱拆卸6. 凝膠的保存。加入20乙醇或nan3在4長(zhǎng)期保存。三實(shí)驗(yàn)方法二、離子交換層析: 一原理是用離子交換劑作固定相利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)