“生物技術(shù)實踐”模塊中若干問題探討

1、“生物技術(shù)實踐”模塊中若干問題探討 將未成熟的木瓜果實割口，收集其乳液，然后通過一系列加工得到木瓜蛋白酶，再添加一定比例的其他輔助劑，即制成了嫩肉粉。蛋白酶能對肉中的彈性蛋白和膠原蛋白實行部分水解，使肉類制品口感達到嫩而不韌、味美鮮香的效果。因為其嫩化速度快且效果明顯，所以當前已廣泛應(yīng)用于餐飲行業(yè)。因為嫩肉粉所含蛋白酶的活性與溫度、pH等相關(guān)，所以使用時最適溫度為左右，最適p大約在范圍內(nèi)，而在高溫、過酸或過堿的環(huán)境中，蛋白酶會變性失活，從而難以發(fā)揮作用。 紅曲粉是將紅曲米經(jīng)粉碎后加工形成，而紅曲米則以秈稻、粳稻、糯米等稻米為原料，用紅曲霉菌發(fā)酵而成，紅曲米外皮呈紫紅色，內(nèi)心呈紅色。紅曲霉，屬子

2、囊菌綱曲霉目曲霉科紅曲霉屬真菌，菌絲體初期在米粒內(nèi)部生長，無色，后漸變?yōu)樽霞t色。無性生殖時，菌絲分枝頂端形成單獨的或一小串球形或梨形的分生孢子。有性生殖時，產(chǎn)生球形、紅色閉囊果，內(nèi)生含有八個子囊孢子的子囊。紅曲米是中國獨特的傳統(tǒng)食品，距今已經(jīng)有千年歷史，早在李時珍所著本草綱目中就有記載。本世紀七十年代末，日本學者遠藤章教授等人從紅曲中分離出一種能降低人體血液中膽固醇的有效物質(zhì)，并且命名為Monacolin-k，為紅曲具有降血壓、降血脂作用提供了科學依據(jù)。紅曲用途廣泛，在烹飪中用于燒菜染色，如江蘇名菜櫻桃肉、無錫排骨的制作；用于燒臘、醬鹵食品，如廣東叉燒和某些鹵水的制作；用于制作紅腐乳和紅腸上色

3、，以及配制糖醋等復(fù)合味時調(diào)色；粥飯、面食、腐乳、糕點、糖果、蜜餞等在制作中也經(jīng)常用到紅曲粉；紅曲還可作為中醫(yī)藥材，具有降低血脂、健脾消食、活血化淤等特殊功效。 海藻酸鈉又名褐藻酸鈉、海帶膠、褐藻膠、藻酸鹽，為白色或淡黃色不定形粉末，無臭、無味，易溶于水，不溶于酒精等有機溶劑，是由海帶中提取的一種天然多糖。海藻酸鈉(C6H7O8Na)n主要由海藻酸的鈉鹽組成，由a-L-甘露糖醛酸(M單元)與b-D-古羅糖醛酸(G單元)通過1，4-糖苷鍵連接并由不同GGGMMM片段組成的聚合物。1881年，英國化學家E.C.Stanford首先對褐色海藻中的海藻酸鹽提取物實行科學研究，他發(fā)現(xiàn)該褐藻酸的提取物具有濃

4、縮溶液、形成凝膠和成膜的水平?，F(xiàn)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織、印染、造紙、日用化工等產(chǎn)品加工中，作為增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、粘合劑、上漿劑等使用。自20世紀80年代以來，褐藻酸鈉在食品應(yīng)用方面得到新的拓展，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，美國人稱之為“奇妙食品添加劑”，日本人譽之為“長壽食品添加劑”。在人造仿型食品加工中，海藻酸鈉是海藻蜇皮、海藻蜇絲、人造葡萄、人造櫻桃的主要原料；在冷食品加工中，海藻酸鈉作為冰淇淋、大雪糕的穩(wěn)定劑，其組織致密，溶解速度緩慢，也是爽口涼粉、果凍的主要原料；在糕點食品加工中，海藻酸鈉作為點心穩(wěn)定成型劑(餅干、面包、掛面、巧克力等)和面包上光劑，使餅干等香脆而不易破碎，使面條滑

5、韌，減少面條的折斷和面包的破碎；海藻酸鈉是果醬、辣醬、果子凍、番茄醬、魚糕、布丁、色拉調(diào)味汁的良好增稠劑；海藻酸鈉可做啤酒穩(wěn)定劑和酒的澄清劑；在冷藏保鮮中，在水果、魚肉等食品上涂上一層海藻酸鈉薄膜，與空氣不直接接觸，可阻止細菌侵入，抑制食品本身的水分蒸發(fā)，延長貯藏時間。褐藻酸鈉不但是一種安全的食品添加劑，而且可作為仿生食品或療效食品的基材，可減緩脂肪糖和膽鹽的吸收，具有降低血清膽固醇、血中甘油三酯和血糖的作用，可預(yù)防高血壓、糖尿病、肥胖癥等疾病，在腸道中還能抑制有害金屬如鍶、鎘、鉛等在體內(nèi)的積累。 另外，牛肉膏是用新鮮牛肉經(jīng)過剔除脂肪、消化、過濾、濃縮而得到的一種棕黃色至棕褐色的膏狀物。牛肉膏

6、中含有肌酸、肌酸酐、多肽、氨基酸、核苷酸、有機酸、無機鹽及維生素等物質(zhì)。該產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于生物制藥發(fā)酵及各種培養(yǎng)基的制備，其主要作用是補充氮源、碳源、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)。而酵母膏（酵母浸膏）是采用新鮮酵母為原料，經(jīng)酵母酶解自溶、分離過濾、濃縮而得到的一種棕黃色至棕褐色的膏狀物。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黃色至淺棕色，較澄清。酵母浸膏富含蛋白質(zhì)、氨基酸類、肽類、核苷酸、B族維生素、微量元素等。在培養(yǎng)微生物方面的主要作用是補充氮源和提供微生物生長所需的氨基酸及各種維生素等生長因子，一般用量為0.2%2.0%。在醫(yī)藥制品、生物工程、科研、衛(wèi)生防疫、細菌檢驗等方面應(yīng)用十分廣泛，效果顯著。在工業(yè)

7、化生產(chǎn)中，廣泛應(yīng)用于生物發(fā)酵菌種必不可少的菌種培養(yǎng)基，可大大提升菌種的生存率和繁殖率，從而提升產(chǎn)品的質(zhì)量檔次和收得率。 2、添加蛋白酶的洗衣粉不能洗滌毛絲織物，而添加纖維素酶的洗衣粉為何能洗滌棉織品？ 蛋白質(zhì)類纖維（羊毛、蠶絲等）織物不能使用添加堿性蛋白酶的洗衣粉實行洗滌，因為堿性蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，使羊毛、蠶絲等纖維受到破壞。但是纖維素酶卻能使織物增艷出新，這是為什么呢？ 成熟棉纖維的主要成分是纖維素，纖維素是天然高分子化合物，由葡萄糖分子按-1，4糖苷鍵連接而成。棉纖維中大分子的排列比較復(fù)雜，纖維內(nèi)某些區(qū)域因為大分子的橫向吸引使大分子排列比較整齊密實，縫隙孔洞較少，這稱為結(jié)晶區(qū)。相反，另一

8、些區(qū)域大分子排列比較紊亂，堆砌比較疏松，其中有較多的縫隙孔洞，密度較低，這稱為非結(jié)晶區(qū)或無定形區(qū)。所以，在一根棉纖維中，同時存有著結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)，棉纖維的結(jié)晶度約為70%，即棉纖維內(nèi)大約有30%的無定形區(qū)。 纖維素酶包括內(nèi)切酶（Cx酶）、外切酶（C1酶）和葡萄糖苷酶。內(nèi)切酶作用于無定形的纖維素區(qū)域，使纖維素斷裂成片斷；外切酶又叫纖維二糖水解酶，它作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)或小片段纖維素，從糖鏈末端開始切掉兩個葡萄糖分子，產(chǎn)生纖維二糖；葡萄糖苷酶則將纖維二糖分解成葡萄糖。 20世紀80年代，日本的一家公司首先推出含有堿性纖維素酶制劑的洗衣粉。堿性纖維素酶本身不能去除衣物上的污垢，它的作用主要是去除棉

9、紡織品表面的浮毛以及表面附著的沉積性頑漬，同時能夠使纖維的結(jié)構(gòu)變得蓬松，從而使?jié)B入到纖維深處的塵土和污垢能夠與洗衣粉充分接觸，從而達到更好的去污效果。所以使用含有堿性纖維素酶制劑的洗衣粉能夠使洗滌后的棉紡織品增艷出新、柔軟蓬松，織紋清晰，色澤更加鮮艷，穿著更加舒適。當然過量、超時、反復(fù)使用含有堿性纖維素酶制劑的洗衣粉，也會損傷棉麻等天然纖維織物。 3、“DNA的粗提取與鑒定”實驗中預(yù)冷酒精的作用是什么？ 在“DNA的粗提取與鑒定”實驗中，若提取的DNA量少、雜質(zhì)多，就會出現(xiàn)實驗現(xiàn)象不明顯的結(jié)果。為了使本實驗取得良好效果，能夠通過多種方法對DNA實行純化。利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解

10、度的不同，通過調(diào)節(jié)NaCl溶液濃度去除雜質(zhì)，因為2mol/LNaCl溶液可溶解DNA，但可除去在高鹽溶液中不溶的雜質(zhì)，0.14mol/LNaCl溶液可析出DNA，但能除去溶解于低鹽溶液中的雜質(zhì)。在濾液中加入嫩肉粉能夠分解雜質(zhì)蛋白，因為嫩肉粉中含有木瓜蛋白酶能夠催化水解蛋白質(zhì)。將濾液放在6075的恒溫水浴箱中保溫而使雜質(zhì)蛋白變性，因為絕絕大部分蛋白質(zhì)不能忍受6080的高溫，而DNA在80以上才會變性。而將處理后的濾液加入與濾液體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液（體積分數(shù)為95%）的作用主要有四：一是利用低溫抑制核酸水解酶的活性，防止DNA的降解；二是低溫條件下降低分子運動，易于DNA沉淀析出而形成白色絲

11、狀物；三是低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少絲狀物的斷裂；四是利用DNA和蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度差異，將DNA與雜質(zhì)蛋白進一步分離，因為DNA不溶于酒精而某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。所以加入預(yù)冷的酒精后懸浮于溶液中的DNA相對雜質(zhì)較少而析出的DNA絲狀物則較多。 4、DNA含量的計算公式中數(shù)字“50”是什么意思？ 教材中DNA含量的計算公式為：DNA含量（mg/mL）=50（260 nm的讀數(shù)）稀釋倍數(shù)，這涉及到DNA含量的測定方法。分光光度法是測定物質(zhì)濃度的常用方法，DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強的吸收水平，因而在260nm處具有一個強烈的吸收峰；蛋白質(zhì)中含有的色氨酸和酪氨酸

12、在280nm波段有一強烈的吸收峰，利用上述特點能夠測定物質(zhì)含量。教材的公式中“50”的含義是：在標準厚度為1 cm的比色杯中，OD260（OD是光密度optical delnsity的縮寫）為1相當于50 mg/mL的dsDNA（雙鏈DNA），40 mg/mL的RNA，37 mg/mL的ssDNA（單鏈DNA）以及30 mg/mL的寡核苷酸，所以若是測定RNA的含量，50應(yīng)該換為40，其他物質(zhì)以此類推。 當DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時，會影響DNA吸光度。一般情況下同時檢測同一樣品的OD260、OD280，計算其比值能夠來衡量樣品的純度。實驗室中純DNA的OD260/OD28

13、01.8(OD260/OD2801.9,表明有RNA污染；OD260/OD2801.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染） ，純RNA的OD260/OD280約為1.7 2.0（OD260/OD2801.7時表明有蛋白質(zhì)或酚污染；OD260/OD2802.0時表明可能有異硫氰酸殘存）。 5、什么叫PCR反應(yīng)體系？ 多聚酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板快速復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝，而這個過程的發(fā)生和完成需要一系列的物質(zhì)條件，這些物質(zhì)條件共同組成了PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系主要由緩沖液、模板、dNTP

14、，耐熱DNA聚合酶、引物及其特定的反應(yīng)條件。與細胞內(nèi)DNA復(fù)制相比，PCR反應(yīng)體系中沒有解旋酶，而是通過9095的高溫使DNA變性解鏈；PCR反應(yīng)體系中也沒有添加ATP，是由dNTP釋放外側(cè)的兩個磷酸基團而提供能量；PCR反應(yīng)體系中的引物不是RNA片段，而通常為一段特定的DNA單鏈；PCR反應(yīng)體系中的DNA聚合酶不是常見的普通DNA聚合酶，而是熱穩(wěn)定性很強的耐熱DNA聚合酶。 緩沖液除了提供一定的pH緩沖水平外，還有一些有助于反應(yīng)實行的成分。PCR反應(yīng)緩沖液通常采用10mmol/L的Tris-HCl（pH8.39.0，室溫）緩沖液體系，它是兩性離子緩沖劑，其中含有可激活DNA聚合酶活性中心的M

15、g2, Mg2濃度高低還可顯著影響PCR擴增產(chǎn)物的特異性。此外，緩沖液中還含有50mmol/L的K,有利于引物與模板的退火。有些緩沖液中還加入明膠或血清蛋白（100g/mL）及去污劑（如Tween20等），對Taq DNA聚合酶起穩(wěn)定作用。 模板中含有待擴增的DNA，其數(shù)量直接影響擴增效果。對于一般PCR擴增，104107個模板分子能夠達到滿意的效果。除了模板數(shù)量外，模板的純度也非常重要，不能有其他DNA、太多的蛋白質(zhì)的污染，特別是其他DNA的污染，即使是痕量DNA，也會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。 dNTP（脫氧核苷三磷酸）為dATP、dCTP、dGTP和dTTP4種脫氧核苷三磷酸的混合物。dN

16、TP溶于pH為7.0的NaOH貯存液中，最初的貯存液可稀釋到10mol/L，分裝后存放在-20冰箱保存中。dNTP的4種脫氧核苷三磷酸必須等濃度配合以減少錯配誤差，使用濃度在20200 mol/L之間，濃度過低則反應(yīng)速率降低，濃度過高則特異性下降，因為dNTP能絡(luò)合溶液中的Mg2，從而產(chǎn)生錯配或抑制TaqDNA聚合酶的活性。利用PCR技術(shù)擴增時，脫氧核苷酸不直接作為反應(yīng)底物，而是dNTP作為反應(yīng)底物，在聚合酶作用下dNTP分解釋放出外側(cè)的兩個磷酸基團，同時提供能量，真正直接參與DNA結(jié)構(gòu)組成的還是脫氧核苷酸。 耐熱DNA聚合酶必須在90以上的高溫下仍具有活性，因為PCR反應(yīng)的變性、復(fù)性和延伸溫

17、度條件分別約為9095、5560、7075，正是因為耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用才使PCR技術(shù)得以實現(xiàn)和應(yīng)用，而且只需一次性加入反應(yīng)體系中，不必每次高溫變性后再添加酶。當前使用的耐高溫DNA聚合酶主要有Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶等。 引物是指在PCR反應(yīng)中與待擴增的靶DNA區(qū)段兩翼互補的寡聚核苷酸，其本質(zhì)是單鏈DNA片段。PCR擴增產(chǎn)物的大小及擴增的靶序列在基因組中的位置是由引物限定的，所以引物的選擇具有決定性意義。引物長短與PCR反應(yīng)特異性高低相關(guān)，一般來說，引物長的，特異性高，一般設(shè)計的引物由2030個核苷酸組成

18、。引物設(shè)計時不但要考慮引物的長度，而且還要考慮引物中堿基GC的含量、引物對之間不能發(fā)生互補等多種因素，引物設(shè)計能夠借助一些計算機引物設(shè)計軟件實行。 6、什么是變性膠？SDS的作用是什么？ 聚丙烯酰胺凝膠電泳是常用的一種電泳方法，而聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速率取決于蛋白質(zhì)所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素，為了消除凈電荷對遷移速率的影響，能夠在聚丙烯酰胺凝膠中加入SDS（sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸鈉）、DTT（dithiothreito

19、l，二硫蘇糖醇）或尿素而使之成為變性膠。所謂變性膠是指在聚丙烯酰胺凝膠中加入SDS、DTT或尿素而制成的凝膠。SDS是一種陰離子表面活性劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變原有的構(gòu)象，特別是在強還原劑DTT等存有的情況下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原，這就保證了蛋白質(zhì)分子與SDS的充分結(jié)合從而形成帶負電的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，所帶的SDS的負電荷遠遠大于蛋白質(zhì)本身的電荷量，因而消除了不同種類蛋白質(zhì)分子間的電荷差異對電泳遷移速率的影響。此外，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在水溶液中的形狀類似橢圓長棒狀，不同的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的橢圓棒短軸長度是相近的，僅僅長軸長度隨蛋白質(zhì)分子量的大小而成正比變化。這樣，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移速率就不再受蛋白質(zhì)分子形狀和所帶凈電荷的影響，此時蛋白質(zhì)電泳遷移速率主要取決于蛋白質(zhì)的分子量。但是因為SDS能使蛋白質(zhì)完全變性，特別是由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，所以測定的結(jié)果僅僅單條肽鏈的分子量。SDS-PAGE變性膠（即添加SDS的聚丙烯酰胺凝膠）不但能夠用于檢測蛋白質(zhì)分子量、分離蛋白質(zhì)和亞基組分，而且還能使DNA和RNA變性，從而準確分離DNA和RNA。如果在聚丙烯酰胺凝膠中沒有加入SDS、DTT或尿素等變性試劑