生化需氧量測定方法簡介

1、 稀釋與接種法 微生物傳感器快速測定法 測壓法 活性污泥曝氣降解法 增溫法 生化需氧量原理 測定方法 實驗環(huán)境條件 樣品本身特性的影響 操作因素的影響 影響因素 常見問題 生化需氧量又稱生化耗氧量，英文（biochemical oxygen demand）縮寫 BOD，是表示水中有機物等需氧污染物質(zhì)含量的一個綜合指標(biāo)，它是指在規(guī)定條件 下，微生物分解存在的水中某些可氧化物質(zhì)，特別是有機物所進行的生物化學(xué)過程 中消耗溶解氧的量。其值越高，說明水中有機污染物質(zhì)越多，污染也就越嚴(yán)重。 微生物分解有機物是一個緩慢的過程，大致可分為兩個階段：第一階段主要是 碳水化合物被氧化，稱為碳化階段，在20下要72

2、0d才能完成；第二階段是含 氮化合物在硝化細(xì)菌的作用下被氧化為氨，當(dāng)水中的氧充足時，再被氧化為亞硝酸 和硝酸，稱為硝化階段。第二階段進行緩慢， 20下需100多天才能完成。經(jīng)過 5d的生化過程，碳化階段已進行了大半，并開始進入硝化階段。對生活污水來說， 它約等于完全氧化分解耗氧量的70%，因此，目前國內(nèi)外均采用20培養(yǎng)5d的生 化需氧量（簡稱BOD5），作為水體質(zhì)量的重要參數(shù)。 BOD5自作為水質(zhì)污染指標(biāo)以來，其測定方法一直在不斷 改進完善和發(fā)展。目前主要以稀釋和接種法作為經(jīng)典方法廣泛 應(yīng)用于水質(zhì)監(jiān)測、比對實驗、仲裁分析中，以微生物傳感器法 作為快速測定法應(yīng)用于快速測定分析中。此外還有測壓法、

3、增 溫法、活性污泥曝氣降解法、檢壓庫侖法、坪臺值法等應(yīng)用于 特定環(huán)境或研究分析中。 稀釋與接種法是指將水樣經(jīng)適度稀釋或者接種后在20培養(yǎng)5天，測 定培養(yǎng)前后水樣中溶解氧的質(zhì)量濃度，由培養(yǎng)前后溶解氧的質(zhì)量濃度之差， 計算每升樣品消耗的溶解氧量，以BOD5形式表示。作為測定BOD5的經(jīng) 典方法，其發(fā)展歷史可以追溯至1936年，美國公共衛(wèi)生協(xié)會將五日生化 需氧量稀釋法規(guī)定為水和廢水的檢驗方法，從而形成了標(biāo)準(zhǔn)稀釋法(BOD5 法)，并為ISO/TC-147推薦，1987年我國參照ISO5815-1983，將此方法 頒布為水質(zhì)分析方法標(biāo)準(zhǔn)GB7488-87，2009年環(huán)境保護部對GB7488-87 進行

4、修訂，并頒布 HJ 5052009標(biāo)準(zhǔn)。 微生物傳感器快速測定法原理是當(dāng)含有飽和溶解氧的水樣進入流通池中與微 生物傳感器接觸，水樣中溶解性可生化降解的有機物受到微生物菌膜中菌種的作 用，使擴散到氧電極表面上氧的質(zhì)量減少。當(dāng)水樣中可生化降解的有機物向菌膜 擴散速度（質(zhì)量）達到恒定時，此時擴散到氧電極表面上氧的質(zhì)量也達到恒定， 因此產(chǎn)生了一個恒定電流。由于恒定電流與水樣中可生化降解的有機物濃度的差 值與氧的減少量存在定量關(guān)系，據(jù)此可換算出水樣中生物化學(xué)需氧量。1990年 日本頒布了微生物電極法（JISK3602-1990）,我國于2002年頒布微生物傳感器 快速測定法（HJ/T86-2002）。此

5、法最大特點是水樣不需要培養(yǎng)5天，快速測定 即得結(jié)果，不僅節(jié)約了實驗時間，而且可以實時掌握這一水質(zhì)污染指標(biāo)，大大提 高了工作效率。 將水樣置于密閉培養(yǎng)瓶中，并放入CO2吸收劑用于吸收 水樣中微生物呼吸作用所產(chǎn)生的CO2，微生物在降解有機物 過程中消耗溶解氧造成此密閉系統(tǒng)內(nèi)壓力下降，測量此壓降 即可換算得生化需氧量。 在溫度為3035，用活性污泥強制曝氣降解樣品2h， 經(jīng)重鉻酸鉀消解生物降解前后的樣品，測定生物降解前后的 化學(xué)需氧量，其差值即為BOD，可根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)方法的對比實 驗結(jié)果換算為BOD5。 增溫法就是適當(dāng)提高反應(yīng)溫度，激化微生物的活性，加 速微生物的分解作用，縮短培養(yǎng)周期，達到快速測定。

6、研究 人員根據(jù)BOD 反映動力學(xué)原理，提出了增溫法快速測定 BOD5 培養(yǎng)時間計算公式，并計算出了適用絕大多數(shù)水樣的 通用增溫培養(yǎng)時間，通過對增溫法理論上的準(zhǔn)確性和可行性 的分析，證明增溫法是可行的。 以上BOD測定方法均各有優(yōu)劣：稀釋與接種法應(yīng)用廣泛 最為經(jīng)典，但操作復(fù)雜，時效性差；測壓法在此基礎(chǔ)上改進 為自動測定，但同樣需培養(yǎng)5天，難以快速通過這一指標(biāo)反 映水質(zhì)狀況；微生物傳感器法測定快速方便，但菌膜需要維 護且受干擾影響多；活性污泥曝氣降解法和增溫法縮短了培 養(yǎng)周期，但其精密度不高，僅適用于特定水樣。 BOD是通過微生物耗氧量間接反映水中可生化有機 物含量的一個指標(biāo)，而微生物的生化反應(yīng)是

7、一個復(fù)雜的過 程，水樣本身的特性、實驗環(huán)境條件以及人員的操作等因 素都會對其產(chǎn)生影響。 實驗環(huán)境條件對微生物的生化過程有很大影響。 樣品儲存運輸、培養(yǎng)以及測定過程的時間與溫度均會影響微生物的生長 繁殖，從而影響測定結(jié)果。 一般認(rèn)為2040是微生物生長的適宜溫度，在此范圍內(nèi)溫度提高 10，微生物活性提高12倍。溫度升高加快反應(yīng)速率，以致培養(yǎng)溫度每相 差1都會引起5%左右的誤差。稀釋與接種法規(guī)定樣品的儲存運輸時間應(yīng)在 采集后24 h內(nèi)，24 h內(nèi)不能分析，可冷凍保存，樣品培養(yǎng)時間為5d4h，測 定前待測試樣的溫度需達到（202），培養(yǎng)溫度為（201）。 要滿足這樣的實驗環(huán)境條件，樣品運輸過程中可使

8、用車載冰箱儲存，到 達實驗室后培養(yǎng)之前，可通過水浴將樣品快速升溫至20，培養(yǎng)過程中使用 誤差1的恒溫培養(yǎng)箱，整個操作室內(nèi)使用空調(diào)將環(huán)境溫度控制在20左右， 以保證培養(yǎng)前后測定過程中的環(huán)境溫度不會影響樣品。 嚴(yán)格控制實驗環(huán)境條件，可以排除外部因素的影響，而樣品 本身的特性，則直接關(guān)系到微生物的生存空間，排除掉水樣中對 微生物生化反應(yīng)有影響的干擾因子，才能更為真實的測定微生物 耗氧量，從而更為準(zhǔn)確的反映出樣品中可生化有機物的含量。 水樣的pH值會影響微生物的活性，過酸或過堿都會抑制其 生長。實驗研究發(fā)現(xiàn)pH在68之間微生物氧化作用最快6， 說 明此pH范圍適宜微生物生長。稀釋與接種法標(biāo)準(zhǔn)HJ/T5

9、05- 2009中規(guī)定若樣品或稀釋后樣品pH值不在68范圍內(nèi)，應(yīng)用鹽 酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值至68。水和廢水監(jiān)測分 析方法中則要求將pH值調(diào)節(jié)到6.57.5范圍內(nèi)。 由于游離氯或結(jié)合氯會影響微生物的活性，當(dāng)樣品中含有少 量余氯時，需在采樣后放置12h使游離氯散發(fā)。對在短時間內(nèi) 不能消失的余氯，可加入適量亞硫酸鈉溶液去除樣品中存在的余 氯和結(jié)合氯。 含有大量顆粒物、需要較大稀釋倍數(shù)的樣品或經(jīng)冷凍保存的 樣品，測定前均需對樣品進行均質(zhì)化處理，否則會產(chǎn)生較大誤差。 一般可攪拌使其混合均勻，對于高懸濁樣品可使用水浴超聲器對 其進行超聲波振蕩處理，使其均質(zhì)混合。 若樣品中有大量藻類存在，藻類生

10、存的呼吸作用和光合作用 會改變樣品中溶解氧含量，培養(yǎng)過程中藻類死亡后會作為有機物 被微生物分解，增加耗氧量，導(dǎo)致BOD5測定結(jié)果偏高。當(dāng)分析 結(jié)果精度要求較高時，測定前應(yīng)用濾孔為1.6m的濾膜（5.1） 過濾，檢測報告中注明濾膜濾孔的大小。 若樣品含鹽量低，缺乏微生物生長所需的無機營養(yǎng)元素，限 制其生長繁殖，造成沒有足夠的微生物去降解樣品中的有機物， 使測定結(jié)果虛低。稀釋與接種法標(biāo)準(zhǔn)HJ/T505-2009中規(guī)定非稀 釋樣品的電導(dǎo)率小于125S/cm時，需加入適量鹽溶液，使樣品 的電導(dǎo)率大于125S/cm。 樣品中微生物的生存也受到其中重金屬等有毒物質(zhì)含量的影 響。某些重金屬離子吸附于微生物的

11、細(xì)胞壁后，可穿透細(xì)胞壁進 入細(xì)胞質(zhì)，與菌體蛋白質(zhì)結(jié)合使之變性。研究人員發(fā)現(xiàn)重金屬等 有毒物質(zhì)超過一定限值會對微生物活性產(chǎn)生影響，可使用經(jīng)馴化 的微生物接種液稀釋水對水樣進行稀釋，或提高稀釋倍數(shù)以減少 其濃度。而高濃度殺菌劑、農(nóng)藥類等物質(zhì)還會對微生物膜內(nèi)菌種 產(chǎn)生毒害作用，造成微生物傳感器測定法產(chǎn)生較大的誤差。 一般測定水樣BOD5時，主要生物氧化作用為碳化作用，硝 化作用很不顯著或根本不發(fā)生，但若樣品中含有硝化細(xì)菌（如生 物處理池出水）時，在測定BOD5時部分含氮化合物的耗氧量也 計入其中，因此須加入硝化抑制劑，抑制硝化過程。需要注意的 是硝化抑制劑也是有機物，加入后也會被微生物分解而耗氧，造

12、 成系統(tǒng)誤差，可通過測定全程序空白扣除。 除樣品本身特性和外部實驗條件兩大影響因素之外，實驗 人員的操作也是關(guān)鍵影響因素。 樣品中的溶解氧含量是一個動態(tài)平衡值，有可能受采集、 保存、稀釋、培養(yǎng)、測定等一系列操作影響。操作過程中應(yīng)注意 不使水樣曝氣，并通過快速升溫或震搖方式排除過飽和氧。 操作中使用的玻璃器皿應(yīng)徹底洗凈，以防瓶壁沾染有機物或 對微生物有毒害作用的物質(zhì)，造成測定結(jié)果的誤差。 當(dāng)樣品無法直接培養(yǎng)測定時，可接種或稀釋后測定。接種液 的作用是向樣品中提供合適的微生物以分解有機物，稀釋水的作 用是提供微生物生存需要的氮磷等營養(yǎng)元素以及足夠的溶解氧， 保障其新陳代謝的正常。這其中使用的接種液

13、和接種稀釋液的配 制及其質(zhì)量是影響測定結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。 稀釋水要控制水溫在(201)，曝氣1小時，使其溶解氧達 到8mg/L以上。使用前每升水中加入鹽溶液混勻，20保存。 在曝氣的過程中防止污染，特別是防止帶入有機物、金屬、氧化 物或還原物。研究發(fā)現(xiàn)稀釋水的原水選用很關(guān)鍵，離子交換水易 受到樹脂床的污染，不宜采用，而一般蒸餾水作為BOD稀釋水 源，其空白值可達到規(guī)定要求。稀釋水中氧的濃度不能過飽和， 使用前需開口放置1小時，且應(yīng)在24小時內(nèi)使用。剩余的稀釋水 應(yīng)棄去。 接種液配制的關(guān)鍵在于根據(jù)實際水樣選取能適應(yīng)該水樣的微 生物。一般可購買接種微生物用的接種物質(zhì)配制，也可選用未受 工業(yè)廢水污

14、染的生活污水、含有城鎮(zhèn)污水的河水或湖水、污水處 理廠的出水等。分析含有難降解物質(zhì)的工業(yè)廢水時，可在其排污 口下游適當(dāng)處取水樣作為廢水的馴化接種液。 而接種稀釋水則根據(jù)接種液的來源不同，每升稀釋水中加入 適量接種液：城市生活污水和污水處理廠出水加110 ml，河 水或湖水加10100 ml，且需存放在（201）的環(huán)境中，現(xiàn) 配現(xiàn)用。 測定樣品的同時，需使用葡萄糖-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液檢查接種 液、稀釋水的質(zhì)量，其測定結(jié)果BOD5應(yīng)在180 mg/L230 mg/L之內(nèi)。且需檢查空白試樣的BOD5，稀釋水測定結(jié)果不能超 過0.5mg/L，接種液測定結(jié)果不能超過1.5mg/L，否則應(yīng)檢查可 能的污染來源。

15、 樣品的稀釋倍數(shù)也是影響測定結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。稀釋過 低則沒有足夠的溶解氧供微生物消耗，稀釋過高則樣品中微生物 生存環(huán)境改變太大，失去重復(fù)性和顯著性，測定值不真實。合適 的稀釋程度需使培養(yǎng)過程中耗氧量不小于2mg/L，培養(yǎng)后樣品中 剩余溶解氧不小于2mg/L，且剩余的溶解氧為開始濃度的1/3 2/3為最佳。 BOD5實際測定過程中，常會遇到多種狀況，排除各 種干擾因素，才能測出更為真實的BOD5值。而稀釋倍數(shù) 的選取，一直是此實驗操作的難點所在，且直接關(guān)系到實 驗成敗與否。 由于特定樣品的總有機碳（TOC）、高錳酸鹽指數(shù)（IMn）、化學(xué)需 氧量（CODCr）、生化需氧量（BOD5）之間存在一

16、定的比例關(guān)系，可以 通過測定其他有機物污染指標(biāo)含量，間接估計BOD5值，再根據(jù)此期望值 以及水樣的類型等特性，確定樣品的稀釋倍數(shù)。但對于不同的樣品，其 中各種有機物的含量不一樣，則各有機物污染指標(biāo)之間的比例關(guān)系不同， 難以根據(jù)某一比例關(guān)系估計BOD5期望值。 根據(jù)實踐經(jīng)驗，一般情況下溶解氧含量足夠的清潔地表水BOD5值較 低，可不經(jīng)稀釋直接測定，而受污染的地表水，需根據(jù)其污染物種類與 含量的不同，具體分析其稀釋倍數(shù)。 稀釋倍數(shù)的合理選取一直是從業(yè)人員的研究內(nèi)容之一，國內(nèi)外就其確定 方法進行了大量的探索研究，并提出不同的經(jīng)驗公式。 有關(guān)稀釋倍數(shù)的選擇方法主要有以下幾種：一是以高錳酸鹽指數(shù)（IMn

17、） 除以3、4、5得稀釋倍數(shù)，由于高錳酸鉀的氧化率低，對有些有機物不能完 全氧化或不能氧化，因而，該法適用范圍上頗受限制，只適用于污染較輕的 廢水和地面水等；二是以回歸法確定稀釋倍數(shù)，由于水質(zhì)變化復(fù)雜，故其相 關(guān)性也在變化，因此所用的回歸方程也應(yīng)經(jīng)常校正，而且對于每一種不同的 水樣，其所用的回歸方程也不同，因此這種方法的適用局限性更大，不具有 推廣價值；三是以化學(xué)需氧量（CODCr）值乘以系數(shù)0.075,0.15,0.225作為三 個稀釋倍數(shù)，該法適用于工業(yè)廢水，也有一定的局限性。 當(dāng)不能準(zhǔn)確的選擇稀釋倍數(shù)時，可以多取幾個不同稀釋倍數(shù)培養(yǎng)，選擇 最合適的作為實驗結(jié)果，如果都符合稀釋與接種法標(biāo)準(zhǔn)

18、HJ/T505-2009中的 規(guī)定要求，則可以取其平均值。但在實際操作中，同一樣品幾個不同稀釋倍 數(shù)測定的結(jié)果有時會出現(xiàn)稀釋倍數(shù)較大的耗氧量反而多的現(xiàn)象。出現(xiàn)這種情 況有可能是試樣中有微生物毒性物質(zhì)，此時選擇與稀釋倍數(shù)無關(guān)的結(jié)果，并 取其平均值。 試樣測定結(jié)果與稀釋倍數(shù)的關(guān)系確定如下：一個試樣要做2個以上不同 的稀釋倍數(shù)，每個試樣每個稀釋倍數(shù)做平行雙樣同時進行培養(yǎng)。測定培養(yǎng)過 程中每瓶試樣氧的消耗量，并畫出氧消耗量對每一稀釋倍數(shù)試樣中原樣品的 體積曲線。若此曲線呈線性，則此試樣中不含有任何抑制微生物的物質(zhì)，即 樣品的測定結(jié)果與稀釋倍數(shù)無關(guān)；若曲線僅在低濃度范圍內(nèi)呈線性，取線性 范圍內(nèi)稀釋比的試

19、樣測定結(jié)果計算平均BOD5值。 由稀釋倍數(shù)造成較大誤差的出現(xiàn)也與微生物的生長情況密切相關(guān)。稀釋 倍數(shù)大，水體中溶解氧就高，微生物繁殖的空間就大。因為對微生物而言， 如果各方面條件滿足，它將以幾何速度繁殖。據(jù)有關(guān)資料表明，大腸桿菌每 一代的平均繁殖時間為17min，5d培養(yǎng)期間，大腸桿菌可以繁殖400多代， 當(dāng)天1個菌落第5d可以繁殖成2個菌落，因此，即使當(dāng)天的微生物群落數(shù)有 很大差異，經(jīng)過5天繁殖，到第5天，水體中的微生物總數(shù)就趨于相近。稀釋 倍數(shù)不同，導(dǎo)致微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的變化，稀釋倍數(shù)越高，水體中生態(tài) 結(jié)構(gòu)改變越大，微生物生存空間越大，測定值偏離真值越大。研究發(fā)現(xiàn)用 “半數(shù)倍”代替“整

20、數(shù)倍”，盡量減少稀釋倍數(shù)，據(jù)此思路測得的BOD5值 較為理想。 修訂的主要內(nèi)容有： 增加了檢出限； 方法原理部分明確規(guī)定培養(yǎng)溫度和時間，增加 （2+5）天培養(yǎng)時間的內(nèi)容； 增加了接種液的選擇； 增加了樣品前處理方法內(nèi)容； 增加了稀釋接種法稀釋倍數(shù)的確定方法內(nèi)容； 細(xì)化了五日生化需氧量的測定方法； 增加了質(zhì)量保證和質(zhì)量控制章節(jié)。 新方法的檢出限為0.5mg/L，方法的測定下限為2mg/L，非稀釋 法和非稀釋接種法的測定上限為6mg/L，稀釋與稀釋接種法的測定上 限為6000mg/L。 培養(yǎng)前 溶解氧 C1 培養(yǎng)后溶解氧C2C1-C2BOD5 HJ535-2009 大于等于2 (1/3)C1C2(2/3)C1 260.56000 BG/T7488-