自由基對神經(jīng)損傷機理研究

1、自由基對神經(jīng)損傷機理自由基對神經(jīng)損傷機理研究研究 兼談依達拉奉對腦卒中作用兼談依達拉奉對腦卒中作用 自由基概述 缺血性腦卒中各階段自由基變化 依達拉奉有效減輕腦卒中病理損 害 總結(jié) 自由基概述 人人體內(nèi)體內(nèi)氧自由基約氧自由基約占自由基總量的占自由基總量的95%，也稱也稱活性氧活性氧 非氧自由基主要有非氧自由基主要有氫自由基氫自由基（H）和）和有機自由基有機自由基（R） 清除自由基：內(nèi)源性自由基清除系統(tǒng)清除自由基：內(nèi)源性自由基清除系統(tǒng) （酶類：酶類：超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶；、過氧化氫酶；非酶類非酶類：維生素：維生素C、E等）等） 氧自由基的類型氧自由基的類型 超氧陰離子過

2、氧化氫分子羥自由基氫過氧基烷過氧基 O2-H2O2OHHO2-ROO 烷氧基氮氧自由基過氧亞硝酸鹽氫過氧化物單線態(tài)氧 RONOONOOROOH 1O2 王志平,等. 西南軍醫(yī) 2010; 12(3) : 534-536 腦缺血腦缺血/再灌注時自由基的來源再灌注時自由基的來源 黃嘌呤氧化酶的形成增多 中性粒細胞的釋放 線粒體內(nèi)細胞色素氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào) 兒茶酚胺的增加 自由基通過以下途徑導(dǎo)致神經(jīng)自由基通過以下途徑導(dǎo)致神經(jīng)/ /血管細胞損傷血管細胞損傷： 細胞膜損傷：雙層結(jié)構(gòu)改變，膜流動性 ，通透性 蛋白質(zhì)損害：使各種蛋白、酶活性、離子泵等功能異常 核酸損害：核酸堿基改變，DNA斷裂，染色體畸變

3、誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生 自由基損傷 腦花生四烯酸（AA）鏈能引起毒性氧自由基增加，合成 潛在的水腫誘導(dǎo)因子白三烯（LT），這是導(dǎo)致腦水腫和 組織損傷的主要原因之一。在沙鼠的I/P模型中，MCI- 186能夠抑制腦白三烯合成的增加，明顯阻止水腫擴大。 自由基損傷導(dǎo)致的最終結(jié)果 腦 水 腫梗塞灶擴大 因缺血時間、再灌注時間的不同以及藥物干預(yù)效果的 差異，體積大小處于動態(tài)變化之中。 細胞凋亡在缺血半暗帶縮小及中心區(qū)擴大的過程中起 著十分重要的作用。 自由基損傷導(dǎo)致的最終結(jié)果自由基損傷導(dǎo)致的最終結(jié)果： 神經(jīng)癥狀 如果在神經(jīng)元細胞發(fā)生不可逆損傷前，腦組織恢復(fù)血供， 同時抑制了再灌注損傷，臨床的癥狀體征是臨時的

4、。 如果血流中斷時間延長、或恢復(fù)血供時無有效抑制再灌 注損傷即導(dǎo)致不可逆缺血性損傷（梗塞）和持久的神經(jīng) 功能缺損。 遲發(fā)性神經(jīng)細胞死亡 自由基損傷導(dǎo)致的最終結(jié)果自由基損傷導(dǎo)致的最終結(jié)果： 自由基 DNA損害 新的基因表達 細胞凋亡 調(diào)控凋亡程序 缺血性腦卒中時 ROS產(chǎn)生超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力 氧化應(yīng)激反應(yīng)（細胞吞噬）氧化應(yīng)激反應(yīng)（細胞吞噬） 金屬離子轉(zhuǎn)換金屬離子轉(zhuǎn)換 黃嘌呤氧化酶黃嘌呤氧化酶 血紅蛋白血紅蛋白 核黃素核黃素 細胞色素細胞色素P450 電子傳遞鏈電子傳遞鏈 脂質(zhì)過氧化脂質(zhì)過氧化 NADPH 氧化還原酶氧化還原酶 氧化酶類氧化酶類 王志平,等. 西南軍醫(yī) 2010; 12(3)

5、 : 534-536 劉揚,等. 中國中醫(yī)藥咨訊 2010; (10) : 210-211 缺血性腦卒中過量自由基的危害 損害大分子（核損害大分子（核 酸、蛋白質(zhì)、脂酸、蛋白質(zhì)、脂 質(zhì)）質(zhì)） 損害細胞膜損害細胞膜 自由基自由基 抗氧化物質(zhì)抗氧化物質(zhì) 問題問題：急性缺血性腦卒中各病程自由基的變化情況？：急性缺血性腦卒中各病程自由基的變化情況？ 王志平,等. 西南軍醫(yī) 2010; 12(3) : 534-536 需要需要 抗自由基抗自由基 主要內(nèi)容 自由基概述 缺血性腦卒中各階段自由基變化 依達拉奉有效減輕腦卒中病理 損害 總結(jié) 缺血性腦卒中溶栓再灌注后 誘導(dǎo)機體產(chǎn)生氧化性損傷 Oxidative

6、 Stress After Thrombolysis-Induced Reperfusion in Human Stroke Carmen Domnguez, Pilar Delgado, Angel Vilches, 試驗組試驗組(n=160)：t-PA治療的缺血性腦卒中患者對照組(n=60) 基基線線t-PA后后1ht-PA后后2h 研究方法研究方法 t-PA后后24h t-PA后后12h 采血： Domnguez C, et al. Stroke. 2010 Apr;41(4)653-60 P655;Par1-2 急性期24h：患者MDA顯著升高 患者在基線、1h、2h、12h、24h的

7、變化情況 Domnguez C, et al. Stroke. 2010 Apr;41(4)653-60 P656;FigA 對對照照基基線線1h2h 平均MDA(95% CI)micromolar 1.0 2 0.6 0.8 1.2 12h24h 所有組 vs.對照：*P0.001 * * * * 自 由 基 增 多 注：過量的ROS極易與腦組織中的脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)產(chǎn)生丙二醛（MDA），因此MDA 常作為衡量自由基變化的指標(biāo) 急性期14天：重度患者MDA仍較高 一項對急性腦卒中患者14天內(nèi)MDA檢測結(jié) 果顯示： 0 2 4 6 8 10 12h24h3天7天14天 輕度 中度 重度 對照

8、MDA濃度濃度 Nmol/mL * 注注：vs對照：*P0.05，*P0.01； vs輕型： P0.05； vs中型： P0.05； vs組內(nèi)24h ：# P0.05 # # * # * # 李舟,等.浙江醫(yī)學(xué) 2012; 34(22) : 1818-1820 高 P1819;Tab2; P1820;Par2; 急性期14天：重度患者SOD仍較低 該項研究對患者14天內(nèi)SOD檢測結(jié)果顯示： 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12h24h3天7天14天 輕度 中度 重度 對照 SOD濃度濃度 Nmol/mL * 注注：vs對照：*P0.05，*P0.01； vs輕型： P0.05；

9、vs中型： P0.05； vs組內(nèi)24h ：# P0.05 # # 李舟,等.浙江醫(yī)學(xué) 2012; 34(22) : 1818-1820 * * 低 P1819;Tab3; P1820;Par2; 急性期(21天)：脂質(zhì)過氧化物累積增 加 一項探究急性缺血性腦卒中患者血液ROOH 的動態(tài)變化： 急性階段急性階段為為21天天（WHO標(biāo)準(zhǔn)）標(biāo)準(zhǔn)） Alexandrova M et al.J Clin Neurosci. 2004 Jun;11(5):501-6. 血漿ROOH nmol/ml 對照組1周2周3周 *P=0.0009 *P=0.021 *P=0.010 P504;Par4;Fig6

10、自 由 基 增 多 急性期（21天)：TBARM累積增加 該項研究中硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)（TBARM）的變化 對照組1周2周3周 血漿TBARM nmol/ml *P0.0077 *P=0.020 *P=0.027 P504;Par4;Fig7B 自 由 基 增 多 Alexandrova M et al.J Clin Neurosci. 2004 Jun;11(5):501-6. 卒中發(fā)病6月后：丙二醛顯著高于對 照組 一項探究缺血性腦卒中卒中發(fā)生6個月后，血清MDA水平變化，N=38 動脈粥樣硬化 N=19 腔隙性腦梗死 N=19 健康志愿者 N=30 MDA水平（中位數(shù)） 3.5 （1

11、.56-6.82） 3.83 （1.17-5.66） 1.69 （0.45-3.50） P0.001 P0.001 nmol/mL Bir LS et al. Exp. Med. 2006 Jan;208(1)33-9 P36;Tab1;Fig1. 自由基在腦卒中病程中長期存在 病程病程存在自由基損傷存在自由基損傷 急性期急性期 （21天）天） 第一階段 （2448h內(nèi)） 所有患者所有患者 第二階段 （314天） 部分中度患者部分中度患者 重度患者重度患者 第三階段 （1521天） 重度患者重度患者 恢復(fù)期恢復(fù)期（26個月）部分重度患者部分重度患者 后遺癥期后遺癥期（6個月以后）未見臨床報道

12、研究顯示：研究顯示：急性缺血性腦卒中的自由基損傷情況 Bir LS et al. Exp. Med. 2006 Jan;208(1)33-9 Alexandrova M et al.J Clin Neurosci. 2004 Jun;11(5):501-6. 李舟,等.浙江醫(yī)學(xué) 2012; 34(22) : 1818-1820 Domnguez C, et al. Stroke. 2010 Apr;41(4)653-60 自由基損傷與炎癥相互作用 是損傷長期存在的原因 血細胞氧血細胞氧 化性損傷化性損傷 血栓形成血栓形成NONO生物利用度降低生物利用度降低 氧化氧化LDLLDL 內(nèi)皮氧化性損傷

13、內(nèi)皮氧化性損傷 動脈粥樣化動脈粥樣化 血管收縮血管收縮 卒中卒中 Alexandrova,et al. Biol. Med.2005, 39, 297-316. P230;Par1;Fig1. P298;Par1;L9-L13 炎癥炎癥 補體系統(tǒng)激活補體系統(tǒng)激活 凝血纖溶異常凝血纖溶異常 血小板激活血小板激活 血小板血小板- -白細白細 胞聚集體胞聚集體 激活白細胞激活白細胞 某某些細胞因子和急些細胞因子和急 性炎癥標(biāo)志物變化性炎癥標(biāo)志物變化 血脂異常血脂異常 內(nèi)皮細胞活化內(nèi)皮細胞活化 ROS 上調(diào)內(nèi)皮細胞和白上調(diào)內(nèi)皮細胞和白 細胞表面粘附細胞表面粘附分子分子 OH H2O2 O2 主要內(nèi)容

14、自由基概述 缺血性腦卒中各階段自由基變化 依達拉奉有效減輕腦卒中病理損害 總結(jié) 21 依達拉奉陰離 子將帶有的 1 個電子提供給 自由基而達到 清除自由基的 目的 依達拉奉：提供電子，清除自由基 依達拉奉清除腦缺血后增加的有害的 OH和其它毒性氧自由基 有效抑制 1.羥自由基與細胞膜脂質(zhì)作用而生成脂性自由基 2.細胞膜脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng) 3.氧自由基介導(dǎo)的蛋白質(zhì)、核酸不可逆的破壞作用 直接阻斷神經(jīng)細胞損傷和血管內(nèi)皮細胞損傷 控制腦梗塞進展和癥狀惡化 依達拉奉顯著降低自由基水平 Shen LH, et al. Neuroscience. 2012 Oct 25;223315-24 P318,Fi

15、gA.B 0 2 4 6 8 10 12 1天3天7天14天 MDA濃度濃度nmol/t 假手術(shù)組 MCAO 依達拉奉 0 10 20 30 40 50 60 70 1天3天7天14天 SOD活性活性Nu/t vs 假手術(shù)組 ：*P0.01 vs.MCAO組：#P 0.01 # # # * * * * * * 單藥治療單藥治療 依達拉奉顯著減輕腦梗死面積依達拉奉顯著減輕腦梗死面積 小鼠局灶性腦缺血損傷小鼠局灶性腦缺血損傷模型模型 研究目的：探究依達拉奉對模研究目的：探究依達拉奉對模 型小鼠型小鼠MMP-9、細胞凋亡、細、細胞凋亡、細 胞自噬的影響胞自噬的影響 研究分組：

16、假手術(shù)組、對照組研究分組：假手術(shù)組、對照組 （Ve）、依達拉奉（）、依達拉奉（A、B） 0 91.38 67.68 66.08 0 20 40 60 80 100 Sc組Ve組A組B組 總梗死面積總梗死面積 # # #p0.05 vs Ve mm.2 Liu N, et al.Brain Res. 2011 Jun 23;139766-75 P69,Fig3(a-e). 單藥治療單藥治療 依達拉奉減輕細胞凋亡和自噬 0 1007.84 550.95 544.24 0 400 800 1200 Sc組Ve組A組B組 凋亡細胞數(shù)凋亡細胞數(shù) 細胞數(shù)mm.2 風(fēng)險比 # # #p0.05 vs Ve

17、# # *p0.05 vs Sc #p0.05 vs Ve * 0.23 0.31 0.2 0.13 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Sc組Ve組A組B組 LC-3（微血管蛋白）（微血管蛋白） Liu N, et al.Brain Res. 2011 Jun 23;139766-75 P70,Fig4(f-g). 單藥治療單藥治療 降低MMP-9和水通道蛋白的表達 # # *p0.01 vs Sc *p0.05 vs Sc #p0.05 vs Ve * * * 風(fēng)險比 0.11 0.68 0.43 0.45 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

18、 1 Sc組Ve組A組B組 MMP-9含量含量 0.23 0.63 0.5 0.49 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Sc組Ve組A組B組 AQ-4含量含量 *p0.05 vs SC #p0.05 vs Ve # # * * Liu N, et al.Brain Res. 2011 Jun 23;139766-75 P105,Tab2. 單藥治療單藥治療 臨床證實：依達拉奉顯著抑制MMP- 9 Isahaya K, et al. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2012 Feb;21(2)102-7. 3.857 4.029

19、4.499 4.538 3.807 3.533.449 3.42 3 3.5 4 4.5 5 入院時48h7天 14天 MMP-9含量含量 對照 依達拉奉 ng/ML p=0.042 p=0.037 P105,Tab2. 單藥治療單藥治療 依達拉奉降低出血性轉(zhuǎn)化風(fēng)險 內(nèi)皮細胞 緊密 連接蛋白 基膜 自由基 MMP9 A：正常狀態(tài)B：tPAtPA后后，缺血再灌注損傷 Yamashita T, et al. Cell Transplant. 2011;20(1)95-7. P96,Fig1. 出血性轉(zhuǎn)化（HT） Yamashita T, et al. J Cereb Blood Flow Meta

20、b. 2009 Apr;29(4)715-25 聯(lián)合溶栓聯(lián)合溶栓 依達拉依達拉奉奉 自由基與自由基與MMP-9損傷血管內(nèi)皮損傷血管內(nèi)皮 依達拉奉聯(lián)合t-PA Deguchi K,et al. Brain Res. 2012 Feb 3;1436168-77 研究研究目的目的：探究依達拉奉聯(lián)合t-PA對神經(jīng)修復(fù)再生蛋白因 子的影響 檢測指標(biāo)檢測指標(biāo)： neurocan Sema3A Nogo-R GAP43 DCC 聯(lián)合溶栓聯(lián)合溶栓 P169,Par2;:L1-L4;Fig1. 依達拉奉顯著降低t-PA后梗死面積 聯(lián)合溶栓聯(lián)合溶栓 251 265 187 222 0 80 160 240 320

21、 V+VV+tPAE+VE+tPA mm.2 P169,Fig2(A-E). 總梗死總梗死面積面積 p0.05 p0.01 Deguchi K,et al. Brain Res. 2012 Feb 3;1436168-77 依達拉奉顯著升高修復(fù)蛋白因子 聯(lián)合溶栓聯(lián)合溶栓 Sema3A表達量表達量（125Da） 1 1.4 0.6 2 1 0 0.5 1 1.5 2 2.5 SV+V V+tPA E+V E+tPA 1.2 1.4 0.6 1.8 1.3 0 0.5 1 1.5 2 2.5 SV+V V+tPA E+V E+tPA Nogo-R表達量表達量(66Da) p0.01p0.01 p0

22、.01p0.01 P170-173,Fig3-Fig6 Deguchi K,et al. Brain Res. 2012 Feb 3;1436168-77 依達拉奉改善干細胞治療引起的腦 損傷 研究目的研究目的：探究依達拉奉聯(lián)合干細胞治療 缺血性腦卒中的作用 聯(lián)合聯(lián)合干細胞治療干細胞治療 Shen LH, et al. Neuroscience. 2012 Oct 25;223315-24 細胞凋亡率細胞凋亡率 P318,Par2;Fig1B 7.12 27.8 11.54 0 5 10 15 20 25 30 對照組I/RE+I/R P0.01 % P0.01 聯(lián)合依達拉奉顯著改善功能恢復(fù)

23、P320,Fig5 1天天3天天 2 0 14 7天天14天天 * 基基線線 12 10 8 4 2 6 神經(jīng)功能評分（mNSS） 神經(jīng)功能恢復(fù)情況神經(jīng)功能恢復(fù)情況 * # # 再灌注時間再灌注時間 MCAO 依達拉奉 BMSCs 聯(lián)合組 P 0.05 vs MCAO 對照 0.05 vs MCAO對照 P0.01 vs BMSCs 組 Shen LH, et al. Neuroscience. 2012 Oct 25;223315-24 *P0.01 vs MCAO 對照 #P0.01 vs 依達拉奉 主要內(nèi)容 自由基概述 缺血性腦卒中各階段自由基變化 依達拉奉有效減輕腦卒中病理損 害 總結(jié)

24、 中重度缺血性腦卒中患者，基礎(chǔ)及臨床研究顯示：自由基損中重度缺血性腦卒中患者，基礎(chǔ)及臨床研究顯示：自由基損 傷長期存在傷長期存在 依達拉奉有效清除自由基，抑制依達拉奉有效清除自由基，抑制MMP9MMP9，保護基底膜，保護腦，保護基底膜，保護腦 微血管的完整性，改善神經(jīng)功能微血管的完整性，改善神經(jīng)功能 t-PAt-PA溶栓聯(lián)用依達拉奉可減少出血性轉(zhuǎn)化，依達拉奉聯(lián)合干溶栓聯(lián)用依達拉奉可減少出血性轉(zhuǎn)化，依達拉奉聯(lián)合干 細胞治療療效更優(yōu)細胞治療療效更優(yōu) 參考文獻 王志平,孫紅斌.氧自由基與缺血性卒中. 西南軍醫(yī) 2010; 12(3) 534-536. 劉揚,李日涵,劉暢. 氧自由基與缺血再灌注損傷.

25、中國中醫(yī)藥咨訊 2010; (10) 210-211. Domnguez C, et al. Oxidative Stress After Thrombolysis-Induced Reperfusion in Human StrokeStroke. 2010 Apr;41(4)653-60 李舟,蔣亞平.急性腦梗死患者溶血磷脂酸、丙二醛和超氧化物歧化酶的變化及臨床意義.浙江醫(yī)學(xué) 2012; 34(22) : 1818-1820。 Alexandrova M et al. Dynamics of free radical processes in acute ischemic stroke:i

26、nfluence on neurological status and outcome. J Clin Neurosci. 2004 Jun;11(5)501-6. Bir LS et al. Increased Serum Malondialdehyde Levels in Chronic Stage of Ischemic Stroke. Exp. Med. 2006 Jan;208(1)33-9. Alexandrova,et al. Oxidative stress during the chronic phase of stroke. Free Rad. Biol. Med.2005, 39, 297- 316. Shen LH, et al. .PROTECTIVE EFFECTS OF MCI-186 ON TRANSPLANTATION OF BONE MARROW STROMAL CELLS IN RAT ISCHEMIC STROKE