第2章蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及分離純化

1、研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法 入射的入射的x射線投射到被檢物體上引起光波的射線投射到被檢物體上引起光波的 散射，散射光含有物體構(gòu)造的全部信息，散射，散射光含有物體構(gòu)造的全部信息， 用透鏡收集和重組散射光波產(chǎn)生物體的放用透鏡收集和重組散射光波產(chǎn)生物體的放 大圖像。大圖像。 核磁共振（核磁共振（NMR） 核磁共振的方法與技術(shù)作為分析物質(zhì)的手段核磁共振的方法與技術(shù)作為分析物質(zhì)的手段 ， 由于其可深入物質(zhì)內(nèi)部而不破壞樣品由于其可深入物質(zhì)內(nèi)部而不破壞樣品 ，并具有迅，并具有迅 速、準確、分辨率高等優(yōu)點而得以迅速發(fā)展和廣速、準確、分辨率高等優(yōu)點而得以迅速發(fā)展和廣 泛應用泛應用 ，已經(jīng)從物理學滲

2、透到化學、生物、地質(zhì)、，已經(jīng)從物理學滲透到化學、生物、地質(zhì)、 醫(yī)療以及材料等學科醫(yī)療以及材料等學科 ，在科研和生產(chǎn)中發(fā)揮了巨，在科研和生產(chǎn)中發(fā)揮了巨 大作用大作用 。 核磁共振是核磁共振是1946年由美國斯坦福大學布洛赫年由美國斯坦福大學布洛赫 (F.Block)和哈佛大學珀賽爾和哈佛大學珀賽爾(E.M.Purcell)各自獨各自獨 立發(fā)現(xiàn)的，兩人因此獲得立發(fā)現(xiàn)的，兩人因此獲得1952年諾貝爾物理學獎。年諾貝爾物理學獎。 50多年來，核磁共振已形成為一門有完整理論的多年來，核磁共振已形成為一門有完整理論的 新學科。新學科。 核磁共振基本原理核磁共振基本原理 核磁共振原理核磁共振原理 實現(xiàn)實現(xiàn)核

3、核磁共振的兩種方法磁共振的兩種方法 檢測共振信號的方法檢測共振信號的方法 傅里葉傅里葉(Fourier)(Fourier)變換變換 核磁共振原理核磁共振原理 半數(shù)以上的原子核具有自旋，旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生一小磁場。當加一外磁半數(shù)以上的原子核具有自旋，旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生一小磁場。當加一外磁 場，這些原子核的能級將分裂，既場，這些原子核的能級將分裂，既塞曼效應塞曼效應。 在外磁場在外磁場B B0 0中塞曼分裂圖：中塞曼分裂圖： 共振條件：共振條件： = = 0 0 = = 0 0 實現(xiàn)實現(xiàn)核核磁共振的兩種方法磁共振的兩種方法 a掃場法掃場法: : 改變改變 0 0 b b掃頻法掃頻法: : 改變改變 核磁共振新技術(shù)

4、核磁共振新技術(shù) 核磁雙共振核磁雙共振 二維核磁共振二維核磁共振 NMR成像技術(shù)成像技術(shù) 魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù) 極化轉(zhuǎn)移技術(shù)極化轉(zhuǎn)移技術(shù) NMR成像技術(shù)成像技術(shù) 投影重建成像方法投影重建成像方法 FourierFourier成像方法成像方法 弛豫時間成像方法弛豫時間成像方法 逐點掃描方法逐點掃描方法 線掃描方法線掃描方法 切片掃描方法切片掃描方法 高分率成像和快速成像法高分率成像和快速成像法 蛋白質(zhì)分子中的非共價鍵：蛋白質(zhì)分子中的非共價鍵： （1）氫鍵：）氫鍵： 羧基上的氧與亞氨基上的氫原子所羧基上的氧與亞氨基上的氫原子所 形成。形成。 作用：鏈內(nèi)維持二級結(jié)構(gòu)；鏈間為作用：鏈內(nèi)維持二級結(jié)構(gòu)；

5、鏈間為 三、四級結(jié)構(gòu)所需。三、四級結(jié)構(gòu)所需。 （2）疏水鍵：）疏水鍵：aa非極性側(cè)鏈形成。非極性側(cè)鏈形成。 作用：維持三級結(jié)構(gòu)。作用：維持三級結(jié)構(gòu)。 穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力 （3）鹽鍵：鹽鍵： 帶正負電荷的帶正負電荷的 側(cè)鏈通過靜電側(cè)鏈通過靜電 引力形成。引力形成。 （4）范德華力：）范德華力： 中性分子或原中性分子或原 子間的作用力。子間的作用力。 次級鍵的特點與作用次級鍵的特點與作用 鍵能弱；鍵能弱； 數(shù)量多。數(shù)量多。 所以，在維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中起重要作所以，在維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中起重要作 用。用。 維系蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)維系蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)：肽鍵、二

6、硫鍵肽鍵、二硫鍵 維系蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)：維系蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)：氫鍵氫鍵 維系蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)：維系蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)：疏水相互作用力疏水相互作用力、氫鍵、氫鍵、 范德華力、鹽鍵范德華力、鹽鍵 維系蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵維系蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵 a鹽鍵（離子鍵鹽鍵（離子鍵 ） b氫鍵氫鍵 c疏水相互作用力疏水相互作用力 d 范德華力范德華力 e二硫鍵二硫鍵 f 酯鍵酯鍵 氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵，均為氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵，均為 次級鍵次級鍵 氫鍵、范德華力雖然鍵能小，但數(shù)量大氫鍵、范德華力雖然鍵能小，但數(shù)量大 疏水相互作用力

7、對維持三級結(jié)構(gòu)特別重要疏水相互作用力對維持三級結(jié)構(gòu)特別重要 鹽鍵數(shù)量小鹽鍵數(shù)量小 二硫鍵對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象很重要，二硫鍵越多，二硫鍵對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象很重要，二硫鍵越多， 蛋白質(zhì)分子構(gòu)象越穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子構(gòu)象越穩(wěn)定 離子鍵離子鍵氫鍵氫鍵 范德華力范德華力 疏水相互作用力疏水相互作用力 酰胺平面與二面角酰胺平面與二面角 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 指蛋白質(zhì)多肽鏈本身的折疊和盤繞形式；蛋白指蛋白質(zhì)多肽鏈本身的折疊和盤繞形式；蛋白 質(zhì)分子中鄰近的氨基酸之間由于氫鍵的作用質(zhì)分子中鄰近的氨基酸之間由于氫鍵的作用 盤旋折疊形成的立體空間結(jié)構(gòu)。包括：盤旋折疊形成的立體空間結(jié)構(gòu)。包括： - 螺旋結(jié)構(gòu)螺旋結(jié)構(gòu)

8、- 折疊結(jié)構(gòu)折疊結(jié)構(gòu) - 轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu) 自由回轉(zhuǎn)自由回轉(zhuǎn) 維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要作用力是維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要作用力是氫鍵氫鍵 （1） - 螺旋螺旋(-helix) 因肽鏈中因肽鏈中aa殘基殘基 中的中的-NH與前三與前三 個個aa的的C=O間間 可形成氫鍵，使可形成氫鍵，使 得肽鏈呈螺旋狀得肽鏈呈螺旋狀 盤曲。盤曲。 氫鍵取向幾乎與氫鍵取向幾乎與 中心軸平行中心軸平行。 多肽鏈中的各個肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺多肽鏈中的各個肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺 旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為 0.54nm,含含3.6個氨基酸殘基；兩個氨基酸

9、之間的距個氨基酸殘基；兩個氨基酸之間的距 離離0.15nm. 肽鏈內(nèi)形成氫鍵，肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵氫鍵 的取向幾乎與軸平行的取向幾乎與軸平行。 第一個氨基酸殘基的酰胺第一個氨基酸殘基的酰胺 基團的基團的-CO基與第四個氨基與第四個氨 基酸殘基酰胺基團的基酸殘基酰胺基團的-NH 基形成氫鍵。基形成氫鍵。 蛋白質(zhì)分子大多為蛋白質(zhì)分子大多為 右手右手 -螺旋。螺旋。 親水基團位于螺旋親水基團位于螺旋 的外側(cè)，疏水基團位的外側(cè)，疏水基團位 于螺旋的于螺旋的 內(nèi)側(cè)。內(nèi)側(cè)。 左手和右手螺旋左手和右手螺旋 影響影響- 螺旋穩(wěn)定的因素螺旋穩(wěn)定的因素 蛋白質(zhì)的氨基酸組成是蛋白質(zhì)的氨基酸組成是 主要的影響因素：主

10、要的影響因素： Pro 同種電荷同種電荷 （2） -折疊折疊(-pleated sheet) 結(jié)構(gòu)特點：結(jié)構(gòu)特點： 肽鏈伸展，肽鏈伸展， 按層排列按層排列, 在肽鏈的不在肽鏈的不 同區(qū)段或不同區(qū)段或不 同肽鏈間形同肽鏈間形 成氫鍵成氫鍵,維維 持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)持結(jié)構(gòu)的穩(wěn) 定性。定性。 -折疊折疊 -折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的 肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成 的。肽鏈的主鏈呈鋸齒樁折疊構(gòu)象。的。肽鏈的主鏈呈鋸齒樁折疊構(gòu)象。 在在 -折疊中，折疊中， -碳原子總是處于折疊的角碳原子總是處于折疊的角 上，氨基酸的上，氨基酸

11、的R基團處于折疊的棱角上并與基團處于折疊的棱角上并與 棱角垂直，兩個氨基酸之間的軸心距為棱角垂直，兩個氨基酸之間的軸心距為 0.35nm. -折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間 形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間 形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)， 氫鍵與鏈的長軸接近垂直。氫鍵與鏈的長軸接近垂直。 -折疊有兩種類型。一種為平行式，即所折疊有兩種類型。一種為平行式，即所 有肽鏈的有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行端都在同一邊。另一種為反平行 式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反

12、。式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。 -折疊有兩種類型 平行：平行：所有肽鏈的所有肽鏈的N端處于同一端，氫鍵端處于同一端，氫鍵 不與肽鏈走向垂直。如：不與肽鏈走向垂直。如： - 角蛋白。角蛋白。 反平行：反平行： 肽鏈的肽鏈的N端不處于同一端，氫鍵與肽鏈走端不處于同一端，氫鍵與肽鏈走 向垂直。如：絲心蛋白。向垂直。如：絲心蛋白。 反平行式反平行式 平行式 （3）- 轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角(- turn) 鏈內(nèi)形成氫鍵鏈內(nèi)形成氫鍵，多多 肽鏈出現(xiàn)肽鏈出現(xiàn)180的的 回折。此回折角稱回折。此回折角稱 - 轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。 此結(jié)構(gòu)廣泛存在球此結(jié)構(gòu)廣泛存在球 狀蛋白中。狀蛋白中。 - 轉(zhuǎn)角 （4）自由回轉(zhuǎn)）自由回轉(zhuǎn)

13、(random coil) 亦稱無規(guī)則卷曲、亦稱無規(guī)則卷曲、 自由繞曲自由繞曲 指無規(guī)律的松散肽指無規(guī)律的松散肽 鏈結(jié)構(gòu)鏈結(jié)構(gòu)。通常酶通常酶 蛋白的功能部位在蛋白的功能部位在 此。此。 超二級結(jié)構(gòu)超二級結(jié)構(gòu)(supersecondary structures) 指若干相鄰二級結(jié)構(gòu)單元組合彼此相互作用，形指若干相鄰二級結(jié)構(gòu)單元組合彼此相互作用，形 成有規(guī)則的在空間上能辨認的二級結(jié)構(gòu)組合體。成有規(guī)則的在空間上能辨認的二級結(jié)構(gòu)組合體。 此為二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)間的一種過渡構(gòu)象。此為二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)間的一種過渡構(gòu)象。 如：如：，；等。；等。 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域(domains)： 多肽鏈在超二級結(jié)多肽鏈在超

14、二級結(jié) 構(gòu)基礎(chǔ)上進一步繞構(gòu)基礎(chǔ)上進一步繞 曲折疊而成的相對曲折疊而成的相對 獨立的三維實體稱獨立的三維實體稱 結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域。 具有部分生物學功具有部分生物學功 能。能。 The subunits are shown in gray and light blue; the subunits in pink and dark blue. Note that the heme groups (red) are relatively far apart. 幾種常見的結(jié)構(gòu)域幾種常見的結(jié)構(gòu)域 蚯蚓血紅蛋白蚯蚓血紅蛋白 的結(jié)構(gòu)域四個的結(jié)構(gòu)域四個 螺旋。螺旋。 免疫球蛋白免疫球蛋白VL的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域 丙糖

15、異構(gòu)酶丙糖異構(gòu)酶 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu) 概念：概念：蛋白質(zhì)的三級結(jié)蛋白質(zhì)的三級結(jié) 構(gòu)是指多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)構(gòu)是指多肽鏈在二級結(jié)構(gòu) 的基礎(chǔ)上進一步盤旋、折的基礎(chǔ)上進一步盤旋、折 疊，從而生成特定的空間疊，從而生成特定的空間 結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。 包括主鏈和側(cè)鏈的所有原包括主鏈和側(cè)鏈的所有原 子的空間排布一般非極子的空間排布一般非極 性側(cè)鏈埋在分子內(nèi)部，形性側(cè)鏈埋在分子內(nèi)部，形 成疏水核，極性側(cè)鏈在分成疏水核，極性側(cè)鏈在分 子表面子表面 較小蛋白質(zhì)分子：多為單較小蛋白質(zhì)分子：多為單 結(jié)構(gòu)域，即三級結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)域，即三級結(jié)構(gòu)； 較大蛋白質(zhì)分子：由較大蛋白質(zhì)分子：由2或或2 個以上結(jié)構(gòu)域結(jié)合成三級個以上結(jié)

16、構(gòu)域結(jié)合成三級 結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。 肌紅蛋白肌紅蛋白 三級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu) 亞基：幾條肽鏈以非共亞基：幾條肽鏈以非共 價鍵聯(lián)結(jié)成一穩(wěn)定的價鍵聯(lián)結(jié)成一穩(wěn)定的 活性單位，這種肽鏈活性單位，這種肽鏈 稱該蛋白質(zhì)的亞基稱該蛋白質(zhì)的亞基 (subunit)。 四級結(jié)構(gòu)：亞基間通過四級結(jié)構(gòu)：亞基間通過 非共價鍵聚合而成的非共價鍵聚合而成的 特定構(gòu)象。特定構(gòu)象。 亞基單獨存在不具活性亞基單獨存在不具活性 血紅蛋白血紅蛋白:2個個亞基和亞基和 2個個亞基。亞基。 蛋蛋 白白 質(zhì)質(zhì) 的的 四四 種種 結(jié)結(jié) 構(gòu)構(gòu) 層層 次次 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順

17、序。蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序。 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) 一級結(jié)構(gòu)卷曲、折疊而成。通常分為二一級結(jié)構(gòu)卷曲、折疊而成。通常分為二 級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、三級結(jié) 構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)。構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)。 一級結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)。一級結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)。 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系 (一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與生物功能一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與生物功能 1、一級結(jié)構(gòu)不同、一級結(jié)構(gòu)不同,蛋白質(zhì)功能不同蛋白質(zhì)功能不同 2、一級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分相同，功能相

18、同一級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分相同，功能相同 不同來源的胰島素都由不同來源的胰島素都由A、B鏈，鏈，51個個aa組成，組成， 但一級結(jié)構(gòu)的但一級結(jié)構(gòu)的aa種類并不完全相同。種類并不完全相同。 3、一級結(jié)構(gòu)改變引起的分子?。?、一級結(jié)構(gòu)改變引起的分子病： 如：鐮刀型貧血病血紅蛋白僅一級結(jié)構(gòu)：如：鐮刀型貧血病血紅蛋白僅一級結(jié)構(gòu)： 6Glu換成換成6Val 由此引起三級結(jié)構(gòu)多由此引起三級結(jié)構(gòu)多 一疏水鍵，四級結(jié)構(gòu)發(fā)生線性締合，導致紅一疏水鍵，四級結(jié)構(gòu)發(fā)生線性締合，導致紅 細胞發(fā)生溶血。細胞發(fā)生溶血。 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定于其一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定于其一級結(jié)構(gòu) 和周圍環(huán)境的影響和周圍環(huán)境的影響 如：瘋牛病如

19、：瘋牛病 prion的發(fā)現(xiàn)，的發(fā)現(xiàn)， 提示人們，提示人們， 一級結(jié)構(gòu)和一級結(jié)構(gòu)和 環(huán)境因素影環(huán)境因素影 響蛋白質(zhì)的響蛋白質(zhì)的 構(gòu)象。構(gòu)象。 （二）蛋白質(zhì)構(gòu)象與功（二）蛋白質(zhì)構(gòu)象與功 能的關(guān)系能的關(guān)系 蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)構(gòu)象改變， 活性喪失。活性喪失。 用化學方法修改用化學方法修改Pr或多肽化合物的結(jié)構(gòu)，或多肽化合物的結(jié)構(gòu)， 可提高活性；可提高活性； 了解了解Pr結(jié)構(gòu)中的活性必需片段，可人工結(jié)構(gòu)中的活性必需片段，可人工 合成合成Pr。 蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的性質(zhì) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)與其分子大小、結(jié)構(gòu)及其蛋白質(zhì)的性質(zhì)與其分子大小、結(jié)構(gòu)及其 組成組成aa的性質(zhì)密切相關(guān)。的性質(zhì)密切相關(guān)。 (一）分子量一）

20、分子量 Mr：道爾頓：道爾頓 Pr為高分子有機物，分子量幾千為高分子有機物，分子量幾千幾千幾千 萬。萬。 分子量測定方法：滲透壓法；分子量測定方法：滲透壓法； 超速離心法；超速離心法； 凝膠過濾法凝膠過濾法(分子篩）；分子篩）； SDS-聚丙烯酰胺電泳法聚丙烯酰胺電泳法(SDS-PAGE)等。等。 滲透壓法滲透壓法 分子量測定分子量測定 PAGE 分子篩分子篩 電荷效應電荷效應 濃縮效應濃縮效應 SDS- PAGE 分子篩分子篩 濃縮效應濃縮效應 SDS- PAGE 普通蛋白質(zhì)電泳的泳動速率取決于荷質(zhì)比（凈電荷、大普通蛋白質(zhì)電泳的泳動速率取決于荷質(zhì)比（凈電荷、大 小、形狀）小、形狀） 用用SD

21、S和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理 蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與SDS結(jié)合，形成結(jié)合，形成SDS-蛋蛋 白質(zhì)復合物白質(zhì)復合物 不同蛋白質(zhì)分子的均帶負電（不同蛋白質(zhì)分子的均帶負電（SDS帶負電）；且荷質(zhì)比帶負電）；且荷質(zhì)比 相同（蛋白質(zhì)分子大，結(jié)合相同（蛋白質(zhì)分子大，結(jié)合SDS多；分子小，結(jié)合多；分子小，結(jié)合SDS 少）少） 不同蛋白質(zhì)分子具有相似的構(gòu)象不同蛋白質(zhì)分子具有相似的構(gòu)象 用幾種標準蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)值對它們的遷移用幾種標準蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)值對它們的遷移 率作圖率作圖 測出待測樣品的遷移率測出待測樣品的遷移率 從標準曲線上查

22、出樣品的相對分子質(zhì)量從標準曲線上查出樣品的相對分子質(zhì)量 Typical calibration curves obtained with standard proteins separated by nongradient denaturing (SDS) discontinuous gel electrophoresis based on the method of Laemmli (1970). (A) Gel with 7% polyacrylamide. (B) Gel with 11% polyacrylamide. (Redrawn with permission from Sig

23、ma.) Separation of membrane proteins by 5.1% to 20.5% polyacrylamide gradient SDS-PAGE 分子量測定分子量測定 根據(jù)化學成分測定最小相對分子質(zhì)量根據(jù)化學成分測定最小相對分子質(zhì)量 此法首先利用化學分析方法測定蛋白質(zhì)此法首先利用化學分析方法測定蛋白質(zhì) 分子中某一特殊成分的百分含量分子中某一特殊成分的百分含量 然后，假定蛋白質(zhì)分子中該成分只有一然后，假定蛋白質(zhì)分子中該成分只有一 個，據(jù)其百分含量可計算出最低相對分個，據(jù)其百分含量可計算出最低相對分 子質(zhì)量：子質(zhì)量： 最小相對分子質(zhì)量（已知成分的相對最小相對分子質(zhì)量（已

24、知成分的相對 分子、原子質(zhì)量）分子、原子質(zhì)量）/已知成分的百分含量已知成分的百分含量 如果蛋白質(zhì)分子中所含已知成分不是一如果蛋白質(zhì)分子中所含已知成分不是一 個單位，則真實相對分子質(zhì)量等于最小個單位，則真實相對分子質(zhì)量等于最小 相對分子質(zhì)量的倍數(shù)。相對分子質(zhì)量的倍數(shù)。 分子量測定分子量測定超速離心法超速離心法 在在60 00080 000r/min的高速離心力作用下，蛋白質(zhì)的高速離心力作用下，蛋白質(zhì) 分子會沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動分子會沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動 用光學方法測定界面移動的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降用光學方法測定界面移動的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降 速度速度 蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和

25、形狀有關(guān)蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān) 沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場中的沉降速度，用沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場中的沉降速度，用S 表示。表示。 一個一個S單位，為單位，為110-13秒秒 相對分子質(zhì)量越大，相對分子質(zhì)量越大，S值越大值越大 蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：1200S 由沉降系數(shù)由沉降系數(shù)S可根據(jù)斯維得貝格可根據(jù)斯維得貝格Svedberg方程方程 計算蛋白質(zhì)分子的相對分子質(zhì)量：計算蛋白質(zhì)分子的相對分子質(zhì)量： M=RST/D1i R：氣體常數(shù)：氣體常數(shù) T：絕對溫度：絕對溫度 D：擴散系數(shù)：擴散系數(shù) ：溶劑的密度：溶劑的密度 分子量測定分子量測定超速離心法超速離心法

26、 分子量測定分子量測定凝膠過濾法凝膠過濾法 凝膠過濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠過濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 一定型號的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應大小的分子一定型號的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應大小的分子 進入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外進入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外 洗脫時大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積洗脫時大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積 ??；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長，后洗??；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長，后洗 脫下來，洗脫體積大脫下來，洗脫體積大 測定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖，商品名：測定蛋白質(zhì)分子量一

27、般用葡聚糖，商品名：Sephadex 測得幾種標準蛋白質(zhì)的洗脫體積測得幾種標準蛋白質(zhì)的洗脫體積Ve 以相對分子質(zhì)量對數(shù)（以相對分子質(zhì)量對數(shù)（logM）對）對Ve作圖，得標準曲線作圖，得標準曲線 再測出未知樣品洗脫體積再測出未知樣品洗脫體積Ve 從標準曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量從標準曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量 分子量測定凝膠過濾法 分子篩分子篩 凝膠過濾法凝膠過濾法 （二）兩性電離與等電點（二）兩性電離與等電點 應用電泳法：應用電泳法： 分離各種蛋白質(zhì)；鑒定蛋白質(zhì)的純度。分離各種蛋白質(zhì)；鑒定蛋白質(zhì)的純度。 此多用于科研、生產(chǎn)、臨床診斷等。此多用于科研、生產(chǎn)、臨床診斷等。 （三

28、）膠體性質(zhì)（三）膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)水溶液蛋白質(zhì)水溶液 為親水膠體。為親水膠體。 不能通過半透不能通過半透 膜；膜； 分子周圍有分子周圍有同同 種電荷和水化種電荷和水化 膜膜，有利于穩(wěn)，有利于穩(wěn) 定定pr膠體系統(tǒng)。膠體系統(tǒng)。 水化膜、同種水化膜、同種 電荷電荷 超濾 透析 （四）呈色反應（四）呈色反應 反應反應 試劑試劑 顏色顏色 反應基團反應基團 雙縮脲反應雙縮脲反應 NaOH,稀稀CuSO4 紫或粉紫或粉 2個以上肽鏈個以上肽鏈 Millon反應反應 Millon,硝酸，亞硝酸硝酸，亞硝酸 紅色紅色 酚基酚基 黃色反應黃色反應 HNO3及及NH3 黃、橘黃黃、橘黃 苯環(huán)苯環(huán) 乙醛酸反應乙醛酸反

29、應 乙醛酸乙醛酸H2SO4 紫紅紫紅 吲哚吲哚 坂口反應坂口反應 次氯酸鈉次氯酸鈉,萘酚，萘酚，NaOH 紅色紅色 胍基胍基 Folin酚試劑反應酚試劑反應 CuSO4磷鎢酸磷鎢酸-鉬酸鉬酸 蘭色蘭色 酚基酚基 茚三酮反應茚三酮反應 茚三酮茚三酮 紫蘭色紫蘭色 游離氨羧基游離氨羧基 雙縮脲反應雙縮脲反應 兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色的兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色的 復合物復合物 含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣 的反應的反應 肽鍵的反應，肽鍵越多顏色越深肽鍵的反應，肽鍵越多顏色越深 受蛋白質(zhì)特異性影響小受蛋白質(zhì)特異性影

30、響小 蛋白質(zhì)定量測定；測定蛋白質(zhì)水解程度蛋白質(zhì)定量測定；測定蛋白質(zhì)水解程度 米倫氏反應米倫氏反應 酪氨酸的顯色反應（酚羥基反應）酪氨酸的顯色反應（酚羥基反應） 米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物 蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉淀，加熱變成紅色蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉淀，加熱變成紅色 乙醛酸反應乙醛酸反應 在蛋白質(zhì)溶液中加入在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，將濃硫酸沿管壁緩慢加入， 不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成 色氨酸的反應（吲哚環(huán)的反應）色氨酸

31、的反應（吲哚環(huán)的反應） 鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸 明膠中不含色氨酸明膠中不含色氨酸 坂口反應坂口反應 精氨酸的反應（胍基的反應）精氨酸的反應（胍基的反應） 精氨酸與精氨酸與-萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴酸鈉）溶液中發(fā)生萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴酸鈉）溶液中發(fā)生 反應，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物反應，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物 鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸 定量測定精氨酸定量測定精氨酸 福林試劑反應福林試劑反應 酪氨酸、色氨酸的反應（還原反應）酪氨酸、色氨酸的反應（還原反應） 福林試劑：磷鉬酸福林試劑：磷鉬酸-磷鎢酸磷鎢酸 與雙縮脲法結(jié)合與雙縮脲法結(jié)合-Lowry法法 在堿

32、性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍和磷鎢藍銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍和磷鎢藍 混合物混合物 靈敏度提高靈敏度提高100倍倍 黃蛋白反應黃蛋白反應 濃硝酸與酪氨酸、色氨酸的反應濃硝酸與酪氨酸、色氨酸的反應 生成黃色化合物生成黃色化合物 指甲、皮膚、毛發(fā)指甲、皮膚、毛發(fā) 考馬斯亮藍考馬斯亮藍G-250 本身為紅色，與蛋白質(zhì)反應呈藍色本身為紅色，與蛋白質(zhì)反應呈藍色 與蛋白的親和力強，靈敏度高與蛋白的親和力強，靈敏度高 1-1000微克微克/毫升毫升 Sanger FDNB DNP-aa 測定蛋白質(zhì)測定蛋白

33、質(zhì)N 端氨基酸序列端氨基酸序列 Edman PITC PTH-aa 測定蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)N 端氨基酸序列端氨基酸序列 DNS-Cl DNS-aa測定蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)N 端氨基端氨基 酸序列酸序列 黃綠色熒光黃綠色熒光 （五）沉淀反應（五）沉淀反應 機理：機理： 1）利用）利用pr兩性電離性質(zhì)。兩性電離性質(zhì)。 2）許多化學試劑可減少）許多化學試劑可減少pr與水的親和力與水的親和力 方法：方法：鹽析、醇、鹽析、醇、 酸、重金屬離子、生物堿酸、重金屬離子、生物堿 鹽析（鹽析（Salting-in)Salting-in) l向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽 （NHNH4 4

34、) )2 2SOSO4 4， ，NaNa2 2SOSO4 4， ，使蛋白質(zhì)脫去水，使蛋白質(zhì)脫去水 化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析?；瘜佣奂恋?，這種現(xiàn)象稱為鹽析。 l鹽析作用是由于當鹽濃度較高時，鹽離子鹽析作用是由于當鹽濃度較高時，鹽離子 與水分子作用，使水的活度降低，原來溶與水分子作用，使水的活度降低，原來溶 液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化 水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團與水分子之水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團與水分子之 間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。 鹽析（鹽析（Salting-in)Salting-in)

35、 鹽溶（鹽溶（salting-in) 蛋白質(zhì)溶液中加入低濃度的中性鹽使蛋白質(zhì)溶液中加入低濃度的中性鹽使 蛋白質(zhì)的溶解度增大的現(xiàn)象蛋白質(zhì)的溶解度增大的現(xiàn)象 等電點沉淀等電點沉淀 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其 溶解度與其凈電荷數(shù)量有溶解度與其凈電荷數(shù)量有 關(guān)，隨溶液關(guān)，隨溶液pHpH變化而變化。變化而變化。 在溶液在溶液pHpH值等于蛋白質(zhì)等值等于蛋白質(zhì)等 電點時，蛋白質(zhì)的溶解度電點時，蛋白質(zhì)的溶解度 最小。最小。 不同的蛋白質(zhì)有不同的等不同的蛋白質(zhì)有不同的等 電點，因此通過調(diào)節(jié)溶液電點，因此通過調(diào)節(jié)溶液 pHpH到目的蛋白的等電點，到目的蛋白的等電點， 可使之沉淀而與其它蛋白可使

36、之沉淀而與其它蛋白 質(zhì)分開，從而除去大量雜質(zhì)分開，從而除去大量雜 蛋白。蛋白。 有機溶劑法有機溶劑法 與水互溶的極性有機溶劑如甲醇、乙醇、與水互溶的極性有機溶劑如甲醇、乙醇、 丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著 降低。降低。 有機溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有兩個：有機溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有兩個： v降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子表面降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子表面 可解離基團的離子化程度減弱，水化程可解離基團的離子化程度減弱，水化程 度降低，促進了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。度降低，促進了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。 v是極性有機溶劑與蛋白質(zhì)爭奪水化水，是極性有機溶劑

37、與蛋白質(zhì)爭奪水化水， 而使蛋白質(zhì)分子沉淀。而使蛋白質(zhì)分子沉淀。 室溫下，這些有機溶劑不僅能使蛋白室溫下，這些有機溶劑不僅能使蛋白 質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。若預先將質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。若預先將 有機溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下將有機溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下將 其逐漸加入蛋白質(zhì)溶液中，防止有機其逐漸加入蛋白質(zhì)溶液中，防止有機 溶劑局部濃度過高，則在很大程度上溶劑局部濃度過高，則在很大程度上 解決變性問題。解決變性問題。 不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同，不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同， 發(fā)生沉淀需要的有機溶劑濃度不同，發(fā)生沉淀需要的有機溶劑濃度不同， 因此可利用不同濃度的有機溶劑分離因此可利用不

38、同濃度的有機溶劑分離 不同的蛋白質(zhì)。不同的蛋白質(zhì)。 生物堿法 蛋白質(zhì)溶液中加入苦味酸、三氟醋酸蛋白質(zhì)溶液中加入苦味酸、三氟醋酸 等化合物可使帶正電荷的蛋白質(zhì)發(fā)生等化合物可使帶正電荷的蛋白質(zhì)發(fā)生 沉淀沉淀 （六）蛋白質(zhì)的變性（六）蛋白質(zhì)的變性 （denaturation) 1、概念：許多理化因素能、概念：許多理化因素能 破壞破壞pr分子的高級結(jié)構(gòu)，分子的高級結(jié)構(gòu)， 但一級結(jié)構(gòu)不變，但一級結(jié)構(gòu)不變，pr活性活性 喪失的現(xiàn)象。喪失的現(xiàn)象。 1）分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變：次）分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變：次 級鍵破壞；級鍵破壞； 2）分子表面結(jié)構(gòu)改變：疏）分子表面結(jié)構(gòu)改變：疏 水基團暴露。水基團暴露。 主要標志主要標志：

39、生物功能的喪失。生物功能的喪失。 2、變性蛋白在性質(zhì)上的變化、變性蛋白在性質(zhì)上的變化 1）溶解度降低；）溶解度降低； 2）二、三級結(jié)構(gòu)破壞，但肽鍵未破壞，故）二、三級結(jié)構(gòu)破壞，但肽鍵未破壞，故 其組成和分子量不變；其組成和分子量不變； 3）化學反應基團增加；）化學反應基團增加； 4）失去螺旋結(jié)構(gòu)，對稱性下降，結(jié)晶能力）失去螺旋結(jié)構(gòu)，對稱性下降，結(jié)晶能力 喪失；喪失； 5）對蛋白酶水解敏感性增加；）對蛋白酶水解敏感性增加； 6）生物活性降低或全部喪失。）生物活性降低或全部喪失。 3、使蛋白質(zhì)變性的理化因素：、使蛋白質(zhì)變性的理化因素： 1）物理因素：）物理因素：加熱、激烈振蕩、超聲波、加熱、激烈振

40、蕩、超聲波、 -射線、紫外線等；射線、紫外線等； 2）化學因素：）化學因素： A 酸堿破壞鹽鍵；酸堿破壞鹽鍵； B 乙醇、丙酮等有機溶劑進入乙醇、丙酮等有機溶劑進入pr間隙與之間隙與之 形成氫鍵，破壞形成氫鍵，破壞pr分子內(nèi)各弱鍵；分子內(nèi)各弱鍵； C 濃脲溶液、鹽酸胍及某些去垢劑濃脲溶液、鹽酸胍及某些去垢劑(SDS)可可 破壞氫鍵，暴露巰基，強化酸堿的破壞作破壞氫鍵，暴露巰基，強化酸堿的破壞作 用。用。 4、可逆變性與不可逆變性、可逆變性與不可逆變性 可逆變性：復性可逆變性：復性 凡變性未超過限度，凡變性未超過限度， pr活性可恢復活性可恢復; 如：胃酶在如：胃酶在80-90， 失活；溫度降至

41、失活；溫度降至37， 恢復?；謴汀?不可逆變性：不可逆變性： 變性不可恢復。變性不可恢復。 如：煮雞蛋。如：煮雞蛋。 (七）蛋白質(zhì)的紫外吸收七）蛋白質(zhì)的紫外吸收 大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、 酪氨酸和色氨酸。酪氨酸和色氨酸。 這三種氨基酸的在這三種氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。附近有最大吸收。 因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm 附近顯示強附近顯示強 的吸收。的吸收。 利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進行定性鑒利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進行定性鑒 定。定。 六蛋白的分類 蛋白質(zhì)可按其分子形狀，組成及其溶解度 分類。 根據(jù)分子組成

42、可分為簡單蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋 白質(zhì)。 簡單蛋白 又稱為單純蛋白質(zhì)；這類蛋白質(zhì)只由氨基酸組成的又稱為單純蛋白質(zhì)；這類蛋白質(zhì)只由氨基酸組成的 肽鏈，不含其它成分。肽鏈，不含其它成分。 清蛋白和球蛋白：清蛋白和球蛋白：albumin and globulin廣泛存在廣泛存在 于動物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，于動物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水， 易溶于稀酸中。易溶于稀酸中。 谷蛋白谷蛋白( (glutelin) )和和醇溶谷蛋白醇溶谷蛋白( (prolamin) )：植物蛋：植物蛋 白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于 70708

43、080乙醇中。乙醇中。 精蛋白和組蛋白：精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質(zhì)，存在于細胞核中。堿性蛋白質(zhì)，存在于細胞核中。 硬蛋白：硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織 中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。 結(jié)合蛋白 由簡單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而由簡單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而 成。成。 色蛋白色蛋白：由簡單蛋白與色素物質(zhì)結(jié)合而成。由簡單蛋白與色素物質(zhì)結(jié)合而成。 如血紅蛋白、葉綠蛋白和細胞色素等。如血紅蛋白、葉綠蛋白和細胞色素等。 糖蛋白糖蛋白：由簡單蛋白與糖類物質(zhì)組成。如由簡單蛋白與糖類物質(zhì)組成。如 細

44、胞膜中的糖蛋白等。細胞膜中的糖蛋白等。 脂蛋白脂蛋白：由簡單蛋白與脂類結(jié)合而成。由簡單蛋白與脂類結(jié)合而成。 如如 血清血清 - -， - -脂蛋白等。脂蛋白等。 結(jié)合蛋白 核蛋白核蛋白：由簡單蛋白與核酸結(jié)合而成。由簡單蛋白與核酸結(jié)合而成。 如細胞核中的核糖核蛋白等。如細胞核中的核糖核蛋白等。 黃素蛋白：黃素蛋白：由簡單蛋白與黃素核苷酸由簡單蛋白與黃素核苷酸 結(jié)合而成。如琥珀酸脫氫酶、結(jié)合而成。如琥珀酸脫氫酶、D-D-氨基氨基 酸氧化酶酸氧化酶 金屬蛋白：金屬蛋白：由簡單蛋白與金屬結(jié)合而由簡單蛋白與金屬結(jié)合而 成。如鐵蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶成。如鐵蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶 （硒）、乙醇氧化酶（

45、硒）、乙醇氧化酶 （鋅）（鋅） 蛋白質(zhì)的外形分類 依據(jù)蛋白質(zhì)的外形分類依據(jù)蛋白質(zhì)的外形分類 按照蛋白質(zhì)的外形可分為球狀蛋白質(zhì)和纖按照蛋白質(zhì)的外形可分為球狀蛋白質(zhì)和纖 維狀蛋白質(zhì)。維狀蛋白質(zhì)。 球狀蛋白質(zhì)：球狀蛋白質(zhì)：globular protein globular protein 外形接近外形接近 球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結(jié)晶，球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結(jié)晶， 大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于這一類。大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于這一類。 纖維狀蛋白質(zhì)：纖維狀蛋白質(zhì)：fibrous proteinfibrous protein分子類似分子類似 纖維或細棒。它又可分為纖維或細棒。它又可分為可溶性纖維狀蛋可溶性

46、纖維狀蛋 白質(zhì)和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)白質(zhì)和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)。 七、蛋白質(zhì)的分離純化七、蛋白質(zhì)的分離純化 分離分離pr的各種方法主要根據(jù)的各種方法主要根據(jù)pr的如下性質(zhì)的如下性質(zhì): 1、分子大小、分子大小 2、溶解度；、溶解度； 3、電荷；、電荷； 4、吸附性質(zhì)；、吸附性質(zhì)； 5、對其他分子（配基）的生物學親和力。、對其他分子（配基）的生物學親和力。 （一）分離純化的意義（一）分離純化的意義 從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)，研究其結(jié)構(gòu)從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)，研究其結(jié)構(gòu) 與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生 命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。

47、工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革 等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用 淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿 等。等。 醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。 基因工程的需要基因工程的需要 （二）分離純化的要求（二）分離純化的要求 1 1、純度：、純度：主要取決于研究的目的和應用上的要求。主要取決于研究的目的和應用上的要求。 如作為研究蛋白和一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)如作為研究蛋白和一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié) 構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、

48、工具酶和標準蛋構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標準蛋 白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī) 藥方面應用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達到一定純度即藥方面應用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達到一定純度即 可，不要求均一?？?，不要求均一。 2 2、活性：、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的 生物活性。生物活性。 3 3、收率：、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中希望收率越高越好，但在分離純化過程中 總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大?？傆胁簧贀p失。而且提純步驟越多，損失越大。 三、分離純化的一般程序三、分離純化的

49、一般程序 生物大分子的分離純化一般可分為以下生物大分子的分離純化一般可分為以下 幾個階段：幾個階段： 材料的選擇和預處理材料的選擇和預處理 破碎細胞及提?。ㄓ袝r還需要進行破碎細胞及提取（有時還需要進行 細胞器的分離）細胞器的分離） 分離純化：包括粗分級分離和細分分離純化：包括粗分級分離和細分 級分離級分離 其中前兩個階段為生物大分子分離純化其中前兩個階段為生物大分子分離純化 的前處理。的前處理。 蛋白質(zhì)分離純化的前處理蛋白質(zhì)分離純化的前處理 一、材料的選擇與預處理一、材料的選擇與預處理 選擇材料主要根據(jù)實驗目的而定。選擇材料主要根據(jù)實驗目的而定。工業(yè)生產(chǎn)上注工業(yè)生產(chǎn)上注 意選擇含量高、來源豐富

50、、易獲得、制備工藝簡意選擇含量高、來源豐富、易獲得、制備工藝簡 單、成本低的動植物組織或微生物做原料?？蒲袉巍⒊杀镜偷膭又参锝M織或微生物做原料?？蒲?選材則無需考慮上述問題，只要能達到實驗目的選材則無需考慮上述問題，只要能達到實驗目的 即可。即可。 實驗材料選定后，常常需要進行預處理實驗材料選定后，常常需要進行預處理.如動物如動物 材料需要除去一些與實驗無關(guān)的結(jié)締組織、脂肪材料需要除去一些與實驗無關(guān)的結(jié)締組織、脂肪 組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與 發(fā)酵液分開。另外，必須盡可能保持材料的新鮮，發(fā)酵液分開。另外，必須盡可能保持材料的新鮮， 盡快

51、加工處理。若不立即進行實驗或加工，應冷盡快加工處理。若不立即進行實驗或加工，應冷 凍保存。凍保存。 二、細胞的破碎二、細胞的破碎 分離提取某一生物大分子，首先要求生物分離提取某一生物大分子，首先要求生物 大分子從原來的組織或細胞中以溶解的狀大分子從原來的組織或細胞中以溶解的狀 態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不 丟生物活性。因此應選擇適當?shù)姆椒▽⒔M丟生物活性。因此應選擇適當?shù)姆椒▽⒔M 織和細胞破碎。但若材料是體液（如血）織和細胞破碎。但若材料是體液（如血） 或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進 行組織細胞的破碎。行組織細

52、胞的破碎。 組織細胞的破碎方法很多，不同的實驗規(guī)模，組織細胞的破碎方法很多，不同的實驗規(guī)模， 不同的實驗材料和實驗要求，使用的破碎方法不同的實驗材料和實驗要求，使用的破碎方法 和條件也不同。和條件也不同。 v一般動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿一般動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿 器破碎或用超聲波處理破碎。器破碎或用超聲波處理破碎。 v植物組織和細胞由于具有纖維素、半纖維素植物組織和細胞由于具有纖維素、半纖維素 和果膠等物質(zhì)組成的細胞壁，一般常用與石和果膠等物質(zhì)組成的細胞壁，一般常用與石 英砂和適當?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴⑸昂瓦m當?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛?用纖維素酶處理也能達到目

53、的。用纖維素酶處理也能達到目的。 v細菌細胞的破碎比較困難，因為整個細菌細細菌細胞的破碎比較困難，因為整個細菌細 胞壁的骨架實際上是一借共價鍵連接而成的胞壁的骨架實際上是一借共價鍵連接而成的 肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎的方法肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎的方法 常有超聲波震蕩、與石英砂研磨、高壓擠壓常有超聲波震蕩、與石英砂研磨、高壓擠壓 或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。 細胞器的分離細胞器的分離 細胞器包括細胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細胞器包括細胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)， 植物細胞還有葉綠體。植物細胞還有葉綠體。 如果要分離制備分布在這些細胞器中的生

54、物大分如果要分離制備分布在這些細胞器中的生物大分 子，為了防止其他細胞組分中的物質(zhì)對制備物的子，為了防止其他細胞組分中的物質(zhì)對制備物的 干擾或污染，還需先將細胞器分離出來，然后在干擾或污染，還需先將細胞器分離出來，然后在 某一細胞器中分離某一物質(zhì)。某一細胞器中分離某一物質(zhì)。 細胞器的分離一般采用差速離心法，即將破碎后細胞器的分離一般采用差速離心法，即將破碎后 的細胞在適當?shù)慕橘|(zhì)中進行離心，常用的介質(zhì)有的細胞在適當?shù)慕橘|(zhì)中進行離心，常用的介質(zhì)有 蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細胞蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細胞 組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)過不同速度的離心后，組分按質(zhì)量大小的不同，

55、經(jīng)過不同速度的離心后， 沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次分步離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次分步離心后， 即可獲得所需組分。即可獲得所需組分。 四、提取四、提取 組織細胞破碎過程中，大量的胞內(nèi)酶組織細胞破碎過程中，大量的胞內(nèi)酶 及細胞內(nèi)含物被釋放出來，必須立即及細胞內(nèi)含物被釋放出來，必須立即 將其置于一定條件下和溶劑中，讓制將其置于一定條件下和溶劑中，讓制 備物充分溶解，并盡可能保持原來的備物充分溶解，并盡可能保持原來的 天然狀態(tài)，避免因長久放置造成制備天然狀態(tài)，避免因長久放置造成制備 物的分解破壞，這就是提取。物的分解破壞，這就是提取。 蛋白質(zhì)（酶）的提取蛋白質(zhì)（酶）的提取 大多數(shù)蛋白質(zhì)

56、均能溶于水、稀鹽、稀堿或稀大多數(shù)蛋白質(zhì)均能溶于水、稀鹽、稀堿或稀 酸溶液中，故蛋白質(zhì)的提取一般以水溶液提酸溶液中，故蛋白質(zhì)的提取一般以水溶液提 取為主。通常采用取為主。通常采用類似生理條件類似生理條件下的緩沖液，下的緩沖液， 如如20-50m mol/L20-50m mol/L的磷酸鹽緩沖液（的磷酸鹽緩沖液（pH7.0-pH7.0- 7.57.5）或）或0.1mol/L Tris-HCl0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0pH7.5-8.0） 緩沖液作提取液。緩沖液作提取液。 對于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極對于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極 性較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽、稀性較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽、稀 堿、稀酸，常在提取液中加入適量的有機溶堿、稀酸，常在提取液中加入適量的有機溶 劑，如乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。劑，如乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。 分離純化分離純化 從細胞中提取得到的生物大分子往往是從細胞中提取得到的生物大分子往往是 不純凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進一步不純凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進一步 分離純化，這一階段可分為粗分級分離分離純化，這一階段可分為粗分級分離 和細分級分離兩步進行。和細分級分離兩步進行。 蛋白質(zhì)（酶）的分離純化蛋白質(zhì)（酶）的分離純化 蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子