磷脂酶D的細胞信號轉導作用cropped

1、把 磷 脂 酶 分 為 5 類(圖 1)，即磷脂酶 a1(pla1)、磷磷脂酶d的細胞信號轉導作用鐘秀麗1，崔德才2*，李玉中1( 1 中國農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 10 00 81 ；2 山東農業(yè)大學生命科學學院，泰安 27 10 18 )摘要：磷脂酶 d (pld)是一類重要的跨膜信號轉導酶類。分別由一個基因家族的不同成員編碼。植物pld的 總體域結構相似，只是不同類型之間在某些單元上有重 要差異。它們各具獨特的生物化學特性。不同的pld在 不同的脅迫類型啟動的特定的細胞過程中執(zhí)行獨特的細 胞信號轉導功能。pld 與其它磷脂酶及 ca2+ 信使之間 有交互作用，形成復雜的

2、信號轉導網絡。這一網絡在不 同植物種類、器官、組織和細胞類型中表現(xiàn)出特異性。 文章最后討論了pld 研究中有待揭示的問題并展望了 今后的發(fā)展方向。揭示出pld 信號轉導途徑與plc 和pla2 信號轉導途徑同樣重要。本文對這些最新進展進行綜述。同時著重分析不同的細胞過程中 pld 的功能以及pld 與其它信使物質之間的關系，了解包含 pld的信號轉導網絡的特異性。關注這一問題將有助 于揭示對各種刺激均做出反應的共同信號物質如何 精確轉導復雜胞外信號的機制。關鍵詞：細胞信號；磷脂信號；磷脂酶 d ；特異性中圖分類號：q7 1磷脂不僅僅是生物膜的骨架成分，而且能通過水解后產生的產物來參與多種生理過

3、程以及環(huán)境 刺激引起的細胞反應。磷脂酶是催化磷脂水解的 第一步的關鍵酶，根據水解磷脂的部位不同可以脂酶 a2(pla2)、磷脂酶 b(plb)、磷脂酶 c(plc)和磷脂酶 d(pld)。關于 pla1 和 plb 的研究報告至今仍很少，pla2 和 plc 的細胞信號轉導功能發(fā)現(xiàn)較早，研究信息已經積累了很多，主要集中在動物方面。pld 于上世紀 40 年代就在植物中被發(fā) 現(xiàn)(hanahan 和 chaicoff 1948)，但是半個多世紀以 來，人們只關注它在植物衰老和機械損傷時催化 膜脂降解的這一功能。直到近年才發(fā)現(xiàn)，各種環(huán) 境刺激，包括低溫、水分脅迫、病原菌激發(fā)和 激素刺激均會迅速激活p

4、ld (ryu和wang 1996; fan 等 1997; lee 等 1997)。在 aba 的信號轉導中，抑 制pld 活性會導致信號傳遞全部或部分受阻(受阻 程度因細胞類型而異) (j acob 等 1 99 9; ritchie 和 gilroy 1998)。基于這些發(fā)現(xiàn)，pld 才被確認為重 要的跨膜信號轉導酶。由于 pld 的細胞信號轉導 作用的發(fā)現(xiàn)，這個“古老”的酶又引起新的關 注。近幾年來，關于 pl d 的結構、生物化學特 性與細胞信號轉導功能方面的研究報告迅速增加，圖 1 不同磷脂酶水解結構磷脂的部位fig.1 sites of hydrolytic cleavage o

5、f phospholipids by pla1, pla2, plb, plc, pldmodification from wang (2002).1pld 的結構與生物化學特性1.1pld 的域結構特征迄今為止，已經從蓖麻、擬南芥、豇豆、 甘藍、煙草、水稻和玉米等多種植物中克隆到pld 基因，僅擬南芥中就已經確認了 12 個基因。根據這些基因的結構和它們編碼的 pld 的序列相2004- 11- 22 收到，2005- 07- 11 接受。國家自然科學基金項目( n o . 304701 65) 資助。* 通訊作者( e-ma i l: cd ca i s d au .e du. cn; t

6、 e l: 05 38 -8 2 4 2 6 5 6 -8308) 。 綜 述 review 似性、域結構、生化特性以及 cd n a 克隆的順序，把這些基因分成 5 類，即 pl d 、pl d 、 pld 、pld 和 pld 。在動物細胞中克隆到兩 個 pld 基因，pld1 和 pld2。在酵母中報告了兩 個 pl d 基因，但只有一個得到鑒定。植物 pld 的總體域結構是相似的，但是有些 單元有重要差異。除了 pld 外的植物 pld 都包含有 c2 域，這是植物 pld 所特有的結構，在動物和酵母中都沒有發(fā)現(xiàn)。c2 域是一個 ca2+ 與磷脂 結合的折疊域，該結構域中二分環(huán)(bip

7、artite loop) 上的 4 5 個氨基酸的性質與 ca 2+ 的結合有關 (ponting 和 parker 1996)。pld 和 pld 二分環(huán)上 保留了所有的酸性氨基酸(qin 等 1997)，而 pld的二分環(huán)上則有兩個被堿性或中性氨基酸殘基取代，因而減弱了 pld 對ca2+ 的親和性。多數pld 都有兩個 pip2 結合位點，一個是近 n- 末端的 c2 域，一個是近 c- 末端的催化域附近的多磷脂酰肌醇 (ppi)結合單元。不同 pld 之間的這個 ppi 結合單元 也有差異。pld 上包含結合單元rxxxxkxrr (即 精氨酸 xxxx 賴氨酸 x 精氨酸精氨酸)和一

8、個反轉序 列單元rkxrxxxxr(qin 等 1997)。在 pld 中這4 個保守的氨基酸殘基中保存 3 個，而 pld 中保 守性最低(有的被酸性殘基取代)。pld 中有一個 十四?；?myristoylation)保守序列。這是 pld 和 pld 所不具備的(qin 等 1997)。在擬南芥中， ca2+ 結合到 pld1 和 pld1 的 c2 域，引起酶的 構象變化，從而增強 c2 域對磷脂酰膽堿(pc)的親 和力(zheng 等 2000)。pld1 被磷脂酰肌醇 4, 5-物 pld 更為接近。pld 特殊的域結構說明它的激活特性可能不同于其它 pld 。1.2pld 的生

9、物化學特性pld 結構的多樣性正是它們各自擁有獨特的 生物化學特性的基礎。植物 pld 的 c2 域的存在說 明了 pld 以一種特定的方式被 ca2+ 激活。由于 c2域和 pip2 結合單元在不同 pld 之間有重要差異，這些 pld 的激活對 ca2+ 和 pip 的需求不同。pld2在以單獨一種磷脂作為底物的離體實驗中需要毫摩爾水平的 ca2+ 激活(qin 等 1997)。最近的研究中發(fā)現(xiàn)，在酸性(ph4.55.0)下，pip 存在時，在 ca2+2濃度接近其生理濃度時檢測到了 pl d 活性(pappan 和 wang 1999)。pld 和 pld 則需要 ca2+2+和 pip

10、2 協(xié)同激活，在微摩爾的 ca 水平下最活躍(qin 等 1997)。pld 不含有 c2 域，但是含有 px和 ph 域，它的激活不需要 ca 。而像 pld 和pld 一樣需要 pip2(qin 和 wang 2002)。pld 的 特征是其激活依賴于油酸，其它不飽和脂肪酸即 亞油酸和亞麻酸的激活程度差一些，而飽和脂肪酸如硬脂酸和棕櫚酸則沒有激活作用(katagiri 等2001)。另一方面，實驗中還發(fā)現(xiàn)溶血磷脂酰乙醇 胺(lysope)(ryu 等 1997)和 n- ?；掖及?nae)(austin-brown 和 chapman 2002)是 pld 的負調節(jié) 因子。2+值得注意的

11、是，這些 pld 的調節(jié)因子(ca2+、pip 、游離脂肪酸、溶血磷脂等) 大多還是 pl a22和 plc 的底物、產物或下游靶物。plc 的功能之一是產生三磷酸肌醇(ip3 )，它能引起細胞質中的2+2+2 磷酸(pip2)和 ca 協(xié)同激活，pip2 分別在 c2 域和催化區(qū)與 pld1 結合，但是這種結合受到 ca2+ 濃ca 水平的增加(staxen 等 1999)。pip2 是一種含量很低的植物脂類，是 plc 的底物。游離脂肪酸和度的調節(jié)。在無 ca2+ 或 ca2+ 濃度較低時，pip 結溶血磷脂則是 pla 的產物。pld 的負調節(jié)因子2合在 pld 1 的 c2 域。相反當

12、 ca 2+ 濃度較高時，在 c2 域的結合受到抑制，促使 pip2 結合在 pld1 的催化區(qū)，這種結合進一步促進 pld1 與 pc 結 合(zheng 等 2000, 2002)。還有一類特殊的 pld，被命名 pld。它們 的特征是有 px(phox homology)域和 ph(pleckstrinhomology)域，但是沒有 c2 域。ph 域由約 120 個氨基酸構成，能夠與多種磷脂酰肌醇結合，但是 可能具專一性(lemmon 和 ferguson 2000)。動物 pld 也包含px和ph域，但是不包含c2域(frohman 等 1999)。所以，pld 的域結構和序列特性與

13、動2nae 則是pld 或pld水解n- ?；字Ｒ掖及?nape)的產物。另一方面，plc 的底物 pip2 的合 成也受 pld 的影響，在動物體系中發(fā)現(xiàn)，pld 催 化反應的產物磷脂酸(phosphatidic acid, pa)能夠激 活 pi-5 激酶(jenkins 等 1994)，它是 pip2 合成的關 鍵酶。因此有學者提出動物細胞 pld 和 pip-5 激 酶的激活形成一個正反饋作用環(huán)，使 pa 和 pip2 迅速產生，這種作用進而增強 plc 的活性與功能。在植物中，pa 能夠與植物pi-4 激酶結合(stevenson等 1998)，但是 pld 在植物的多磷酸肌醇形

14、成中的 作用目前還不清楚。另外，pld 的產物 pa 能夠激活 pla2?？梢姡琾ld 與其它磷脂酶之間以及不同的 pl d 類型之間可能有復雜的激活與抑制關系。 除了受上述調節(jié)因子的影響，pld 還受到 ph 的影響。pld 和 pld 只在中性 ph 下活性最強， 在酸性 ph 下沒有活性。在接近生理 ca2+ 濃度的情 況下，pl d 在酸性 ph 下有活性(qi n 和 wan g2002)。說明細胞內 ph 的變化對不同的 pld 類型的影響不同。另外，ritchie 和 gilroy (2000)還發(fā) 現(xiàn)，pld 受三聚 g 蛋白的調節(jié)。植物中這種調節(jié) 機制還不清楚。在動物中小 g

15、 蛋白如 adp 核糖基 化因子(arf)和rho對pld 的調節(jié)機制則已經清楚 了。不同 pld 的調節(jié)機制各有不同之處，說明它們可能各自執(zhí)行不同的信號轉導功能。不同的 pld 的底物專一性不同。pld 以一 種以上的磷脂作底物，通常的結構磷脂如磷脂酰 膽堿(pc)，磷脂酰乙醇胺(pe)，磷脂酰甘油(pg) 都是很好的底物，但是它幾乎不能水解磷脂酰肌 醇(pi)、磷脂酰絲氨酸(ps)、n- ?；字Ｒ掖?胺(n ap e ) 、心磷脂和縮醛磷脂( ab ousa l ha m 等19 97 ) 。pl d 和 pl d 不但能夠水解 pc 、pe 、pg，還能夠水解 ps 和 nape。p

16、ld 和 pld 水 解同樣的底物，但是 pld 優(yōu)先選擇 pe 和 nape， 而 pld 則不然。不依賴于 ca2+ 的 pld 表現(xiàn)出獨 特的底物專一性，它水解的是 p i ( w issi n g 等199 6) ，而 pl d 、pl d 、pl d 都不水解 pi 。所以，激活不同的pld 可以導致不同種類和數量的 磷脂被水解，因而產生的 pa 的分子種(molecular speci es)的組成會有差異。圖 2 pa 與其它磷脂信號物質之間的相互轉化fig.2 interconversions of pa and other lipid signal messengers lp

17、 ps: lipid phosph ate phosphatases; dagk: dag kin ase; pa k : pa k i na s e ; pc: pho s p h a t i d y l c h o l i n e ; pe: ph osphatidylethan olamin e; pg: phosph atidylglycerol; pla: phospholipase a; plc: phospholipase c; pld: phospholipased; pip 2 : p hosphatidylinosito l 4, 5 -bisph osph at e; d

18、 ag : diacylglycerol; pa: phosphatidic acid; dgpp: diacylglycerol pyrophosphate; ffa: free fatty acid; pl: phospholipid; lysopl:lysophospholipid; lysopa: lysophosphatidic acid.1998)，dgpp 也可以在磷脂磷酸酶的作用下脫磷酸化形成 pa (munnik 等 2000)。 值得注意的是，pa 及其進一步代謝產生的dag、lysopl 和 ffa 等信使物質除了 pld 途徑 以外，還可以由其它磷脂酶途徑產生，進一步說

19、 明磷脂酶之間存在復雜的相互作用。如pa 和dag 兩種可以相互轉化的信使物質，都具有 pl d 和 plc 兩條產生途徑。從目前的研究結果看，動物中可能使用 pa 和 dag 兩種信使物質。已經發(fā)現(xiàn)pa 能夠激活多種信號蛋白，dag 能夠激活pkc超 級家族成員。然而，植物缺少 pk c ，dag 可能 在 dag 激酶的作用下迅速轉化成 pa，作為信使 物質將信號向下游轉導，所以植物可能主要以 pa 作為信使物質(laxalt 和 munnik 2002)。pa 在 pa 激酶的作用下產生的 dgpp，是新發(fā)現(xiàn)的一種磷脂。munnik 等(1996)用 g 蛋白活化 劑黃蜂毒素(masto

20、paran)處理衣藻，激活 pld 和 plc 信號轉導途徑后首次檢測到dgpp 的存在。后 來又發(fā)現(xiàn)植物細胞受到干旱、鹽和滲透脅迫、病 原菌激發(fā)等各種刺激后dgpp水平均發(fā)生迅速而短2pld 作用的直接產物 pa 及其下游事件2.1pa 的代謝與轉化不同 pld 特異性地水解各種磷脂，直接產生 pa。pa 本身就是信使物質，能夠激活靶物使它 將信號向下游傳導。同時 pa 還可以進一步代謝生 成其它信使物質(圖 2)。如在磷脂磷酸酶的作用下 脫磷酸化形成二酯酰甘油(dag)，還可以在 pa 激酶的作用下磷酸化形成焦磷酸dag(dgpp)(munnik 等2000)，也可以在plas 的作用下去

21、?；纬蒮fa 和溶血磷脂酸(lys opa) (m ei jer 等 20 01 )。同樣， dag 也可以在 dag 激酶的作用下磷酸化形成 pa (van der luit 等 2000; den hartog 等 2001; munnik 等暫的變化，在未受刺激的細胞中則很難檢測到，而且 dgpp 的濃度很低，這些都是信號分子的特征。然而，每一種信使物質在受到生理刺激水平升高之后都需要迅速降低它的生理活性水平，以 便細胞對下一個刺激做出反應，同時也避免信使 物質濃度過高影響正常的生理代謝。mu nn ik 等 (1996)認為pa磷酸化生成dgpp的途徑是植物細胞 發(fā)育出的獨特的降低

22、pa 水平的機制。那么， dgpp 的形成只是降低 pa 水平的一種機制，還是 dg pp 作為信號分子起作用呢？有待于進一步證 實。近年來，參與磷脂信使物質之間轉換的脂類 激酶和磷酸酶的研究很受關注。這兩類酶通過對 磷脂信使物質的磷酸化和脫磷酸化作用調節(jié)其功 能，類似于蛋白質激酶和磷酸酶對蛋白質功能的 調節(jié)。植物中 dag 激酶已經被克隆(kat agi ri 等1996)。將 pa 信號轉化成 dgpp 的 pa 激酶的特征 已經清楚(wissing 和 behrbohm 1993)，但是它的 編碼基因還未找到。脂類磷酸酶的研究也取得了 較大的進展。它們存在著結構和催化特性不同的 兩個主要

23、類型(waggoner 等 1999)。類型 i (pap-1)需要 mg 2+ 激活，在三酰甘油酯合成中有重要作用；類型 ii (pap-2)不需要 mg2+ 激活，可能參與 信號轉導。pap-2 是能夠水解多種磷脂的磷酸酶家族，所以 pap-2 家族成員又被命名為磷脂磷酸 酶(l pp ) 。lpp 有多種，其中 lp p- 1 、lpp - 2 和 lpp-3 能夠對 pa、lysopa、dgpp、神經酰胺 -1- 磷酸、神經鞘氨醇 -1- 磷酸等多種磷脂進行脫磷酸化。最近，類似于類型 ii 的 pap 基因已經在植 物上克隆(marcel 等 2000)。磷脂信使物質之間能夠相互轉化，

24、每種信使 物質都可以由不同磷脂酶途徑產生，這就引出磷 脂信號轉導所涉及的分子種問題。因為并不是所有的 pa、dag 和 lysopl 都是化學上完全一致的，在它們的 sn-1 和 sn-2 位置上的?；遣煌?，因 而可以有許多不同的分子種。例如，pld 的底物 pc 與 plc 的底物 pip2 的?；M成不同，那么 plc 水解 pip2 產生的pa 與pld 水解pc 產生的pa 就是 不同的分子種，而且產生于不同的亞細胞位置。 pa 的產生是通過plc 途徑還是pld 途徑可以通過 活體32p- 標記技術來定性區(qū)分(munnik 等 1998a)， 也可以通過測定 pa 的脂肪酸組成進

25、行定量測定， 以明確 plc 和 pld 在 pa 形成中的貢獻率。但是 目前還不清楚不同分子種的信使物質之間在它們的作用方面的差異。2.2pa 的下游事件在曾經做過測試的多種植物中均發(fā)現(xiàn)，受到 機械損傷后pa 的增加比lysopl 和ffa (pla2 的產 物)早(lee 等 1997; ryu 和 wang 1998)。在擬南芥中，反義抑制 pl d 活性后，損傷引起的 pa 、游離的不飽和脂肪酸和茉莉酸的產生都減少, 說明pld 激活后產生的 pa 刺激 pla 活性增加。另外還 發(fā)現(xiàn) ja 合成酶脂氧合酶 2(lox2)的基因表達減少(zien 等 2001)，說明 lox2 可能是

26、 pa 的下游靶物，即 pa 通過激活 lox2 促進 ja 的生成。另外，sang等(2001b)在反義抑制擬南芥 pld 后，觀察到擬南芥葉片提取物中的 pa 和過氧化物水平均下降，外施 pa 則促進 pl d 缺失型植株過氧化物的生成，表明 pa 參與調節(jié)過氧化物的產生。大豆懸 浮培養(yǎng)細胞中，pa 引起一個被機械損傷激活的促 有絲分裂蛋白激酶(mapk)的活性增加。用1- 丁醇 處理減少 pa 的形成，則抑制機械損傷對這種激酶 的激活(lee 等 2003)。在大腸桿菌中表達的一種胡 蘿卜的鈣依賴蛋白激酶在離體條件下能夠被pa和 ca2+ 激活(farmer 和 choi 1999)。p

27、a 還影響離子通 道蛋白活性，如用 pa 處理保衛(wèi)細胞原生質體，則 抑制內向性k通道蛋白活性(lee等1996; staxen等1999)。對植物中 pa 的下游反應或過程了解還很 少，這是限制揭示 pld 細胞調節(jié)功能機制的主要 障礙。盡管動物 pld 的作用只在 10 多年前才被認 識，動物上 pa 下游事件的研究已經遠遠領先于植 物。已經明確，pa 能夠激活多種蛋白激酶，包 括蛋白激酶 c (pkc)、mapk 和raf 激酶(cockcroft19 97 )。另外還發(fā)現(xiàn)，pa 能夠激活 pip-5 激酶和 plc，這些都與磷脂信號轉導有關。最近 waite 等 (1997)報告，nad

28、ph 氧化酶的一個亞基 p47-phox 是受 pa 激活的蛋白激酶的底物。植物 nadph 氧 化酶復合體的同族體已經被鑒定，但是植物上的nadph 氧化酶是否受pa直接激活還有待于證實。3pld 作用的特異性pld 家族內部、pld 與其它磷脂酶及 ca2+ 信使之間有交互作用，形成復雜的信號轉導網絡。這一網絡在不同植物種類、器官、組織和細胞類型中表現(xiàn)出特異性，在不同胞外脅迫類型引起的細胞信號轉導過程中也有差異。pld 作用的特異 性包含在網絡特異性中，如不同細胞信號轉導過 程涉及的信號轉導網絡中，pld 的類型及其與其 它磷脂酶以及 ca2+ 信使之間的關系可能不同。3.1 各種 pld

29、 功能的特異性近年來，人們通過反義抑制法成功地篩選到 擬南芥 pld 的基因缺失突變體，使得幾個 pld 類型在逆境脅迫、激素反應、防御反應等方面的重 要功能不斷被揭示。fan 等(1997)用aba 或乙烯處 理 pld 活性受了反義抑制的擬南芥葉片，看到 激素誘導的衰老過程被明顯延遲，說明 pld 介 導 aba 和乙烯信號轉導過程。如果不經aba 或乙烯處理，pl d 活性被反義抑制并沒有影響植物的生長發(fā)育，說明 pld 可能只介導脅迫誘導的 衰老過程，而不介導正常發(fā)育的程序化衰老。然 而，在 pld 的細胞信號轉導功能發(fā)現(xiàn)以前，人們 長期關注著 pld 在植物的衰老、老化與機械損傷 時

30、的磷脂降解功能。那么，是哪一種 pld 介導了程序化衰老過程中的磷脂降解，尚需進一步研究。sang 等(2001a)觀察到擬南芥 pld 缺失株的 抗旱力較野生型的低。welti 等(2002)的實驗則證 明，pl d 缺失株的抗霜力較野生型明顯地高。 一種 pld 類型在兩種脅迫條件下表現(xiàn)出截然相反 的作用，與 aba 等逆境信號因子的作用不同。這 主要源于兩種脅迫條件下pld的作用機理方面的 差異。pl d 活性被反義抑制后，擬南芥葉片對 aba 的敏感性下降，阻礙了水分缺失誘導的氣孔 關閉，從而導致植株抗旱力下降。霜凍處理后， pl d 缺失株與野生型的膜脂組成變化不同， pld 缺失株

31、的膜脂中 pc 含量的減少幅度僅是野 生型的一半，pa 的增加幅度也僅是野生型的一 半。pc 是對膜脂雙分子層起穩(wěn)定作用的磷脂，而pa 的積 累則促進低溫脅迫下六角形 i i 相位 ( hax gonal ii pha se) 的形成，從而破壞膜脂的結 構。所以，缺失型膜脂組成的這種變化有利于膜 脂雙分子層的穩(wěn)定，可能是植物抗寒力提高的主要機制?？梢姡谒獌雒{迫下 pld 的作用機理可能較其它脅迫類型更為復雜和獨特，因為在霜凍 脅迫下它的信號轉導功能和磷脂降解功能同時發(fā)揮 作用。有趣的是，與 pld 在擬南芥的抗凍性上 的作用相反，pld 基因被敲除后，擬南芥抗凍性下降，pld 的超表達則提高

32、了擬南芥的抗凍性，而且比 pld 被反義抑制提高的效果更顯著 (li 等2004)。pld 的功能也被發(fā)現(xiàn)。劉斌等(2002) 將 pld 反義基因轉入三倍體毛白楊后，轉化株的 耐鹽堿能力明顯提高，在含鹽量達 0.5% 的土壤環(huán) 境中仍可快速生長。pld 被反義抑制后 pld 和 pld 的活性并 沒有顯著下降，但是 pld 的缺失不能被 pld 和pld 補償。van der luit 等(2000)用普通激發(fā)子鞭 毛蛋白、殼四糖和木聚糖酶處理32p- 標記的番茄懸 浮培養(yǎng)細胞，發(fā)現(xiàn) 3 種激發(fā)子都能夠激活 plc 途 徑，而且該途徑是 pa 形成的主要貢獻因子。但 是，這 3 種激發(fā)子中卻

33、只有木聚糖酶能夠激活pld，殼四糖和鞭毛蛋白則不能。在已經克隆的5 種番茄 pld 中，只有 pld1 能夠被木聚糖酶激 活(laxalt 等 2001)。在番茄懸浮培養(yǎng)細胞中使該基 因沉默會導致木聚糖酶 -pld 反應的喪失(lax al t 等，個人通訊) ，說明是 pld 1 對木聚糖酶處理 做出的反應。在動物界中只鑒定出兩個類型，即pld1 和 pld2，pld2 基因的超表達引起細胞骨架重組，而pld1 的表達卻不會引起細胞形態(tài)學上的 任何改變(colley 等 1997)。waksman 等(1997)在酵母中也鑒定出兩個類型，即 pld1 和 pld2，并觀察到 pld1 參與減

34、數分裂過程, 而 pld2 則不參與。這些均說明，不同的 pld 在特定的細胞信號轉導過程中執(zhí)行獨特的功能，彼此無法取代。 抗旱性強的更蘇植物craterostigma plantagine-um 在經脫水處理幾分鐘就可以檢測到一種pld 的 活性增加(frank 等 2000)。但是外源 aba 處理卻不 能快速激活這一 pld，盡管更蘇植物的許多脫水 反應都能夠被 aba 誘導。脫水處理 2 h 以后，在這種植物中鑒定到的兩種pld中的一個的mrna增加，這種作用能夠被外施 aba 誘導。利用抗旱 性不同的豇豆(vigna unguiculata)品系進行的實驗發(fā) 現(xiàn)，水分脅迫引起 pld

35、 活性顯著增加，尤其是對 干旱敏感的品種比抗旱品種更明顯(el maarouf 等1999)。在這個研究中，沒有檢測到 aba 對 pld表達的影響。保衛(wèi)細胞和大麥糊粉層細胞在 aba信號系統(tǒng)中都通過翻譯后調節(jié)作用激活 pl d(ritchie 和 gilroy 1998；2000；jacob 等 1999)。在離體和活體狀態(tài)下用 aba 處理糊粉層細胞原生質體，發(fā)現(xiàn)只有在處理后 10 min 時出現(xiàn)一個 pld的活性高峰。但是在保衛(wèi)細胞原生質中則有兩個pld 活性高峰，分別在處理 5 min 后和 20 min 后 出現(xiàn)。盡管這些反應中的 pld 還未被鑒定，作用 也不明確，但卻足以說明 p

36、ld 基因的表達在不同 植物種之間、不同細胞類型之間以及胞外信號類 型之間具有特異性。3.2 pld 與 plc 途徑的交互作用及其特異性前面說過，pa 和 dag 兩種信使物質之間可 以相互轉化，但是植物中缺少 da g 下游靶物 pkc，dag 可能在dag 激酶的作用下迅速轉化成 pa，作為信使物質將信號向下游轉導，因而植物 中可能更多地利用 pa 作為信使物質(l ax al t 和 munnik 2002)。pa 產生于 pld 和 plc 兩條途徑。這兩條途徑既可能平行作用，也可能串聯(lián)在同一條途徑上, 還可能單獨作用。 在谷物種子萌發(fā)與幼苗生長初期，胚合成的ga 被釋放到糊粉層，刺

37、激 - 淀粉酶等水解酶的 合成。這些水解酶被分泌到胚乳中后，引起儲藏 的淀粉水解，最終產生植物可以直接吸收利用的單糖或者二糖，供種子萌發(fā)和幼苗生長。谷物糊粉層細胞是細胞信號轉導研究的模式細胞之一。 ritchie 和gilroy(1998，2000)觀察到aba 處理能夠 抵消糊粉層對ga 的反應。在實驗體系中加入1- 丁 醇則可以清除aba 的抑制作用。經微注射ip3 后沒 有檢測到胞內 ca2+ 水平的增加，表明 plc 途徑沒 有介入這一體系。所以，在糊粉層細胞中 aba 只 激活 pld 這一條途徑。另外，由于在外施 aba 后 可以迅速檢測到 pa 生成，外施 pa 能夠誘導這些 a

38、ba 反應，所以 pld 被認為是這個調節(jié)網絡中的 早期作用因素，與 ab a 受體接近。保衛(wèi)細胞也是細胞信號轉導研究的模式細 胞。在蠶豆保衛(wèi)細胞的研究發(fā)現(xiàn)，aba 處理能夠引起氣孔關閉和 k通道蛋白活性下降(j ac o b 等1999)。外施 pa 只能夠誘發(fā) aba 直接處理引起的 反應的 50%。而用 pld 抑制劑 1- 丁醇和 aba 同時 處理蠶豆表皮細胞，也只減少 aba 反應的 50%。 說明在蠶豆保衛(wèi)細胞中 pld 與其它信號轉導途徑 平行地傳遞aba 信號。保衛(wèi)細胞中介入aba 信號轉導的其它因素有 plc (staxen 等 1999)、六磷酸 肌醇(ip6, lemt

39、iri-chlieh 等 2000)和環(huán) adp 核糖 (cadpr, leckie 等 1998)。jacob 等(1999)用 1- 丁 醇與 plc 抑制劑新霉素組合或者與 cadpr 抑制劑煙堿組合進行實驗，結果是當 1- 丁醇與煙堿組合使用時，aba 反應幾乎被完全消除，而 1- 丁醇與新霉素組合使用時，aba 反應仍有對照的 50。推測 pld 與 plc 鏈接在同一途徑，而和與 cadpr有關的信號系統(tǒng)平行作用。 在根瘤菌上也觀察到了類似的現(xiàn)象。根瘤菌分泌的結瘤因子脂殼寡糖刺激根瘤開始在寄主豆類 植物的根上形成。最初可以看到的反應是根毛彎曲變形。den hartog 等(2001

40、)在用32p- 標記的蠶豆 幼苗進行的實驗中看到，結瘤因子迅速刺激 pa 的 形成。munnik 等(1995, 1998a, b)應用轉磷脂?；?化方法和差異標記法研究表明，plc 和 pld 都參 與了 pa 的形成。如果用新霉素或者正丁醇預處理抑制其中一種磷脂酶的活性，根毛變形就受到抑制。用植物中 pld 和 plc 途徑的有效激活因子黃 蜂毒素處理能夠誘導根毛變形和結瘤基因的表達 (den hartog 等 2001)。不活躍的黃蜂毒素類似物 ma s 1 7 既不能誘導根毛變形，又不能引起 pa 形 成。這一結果表明，pld 和 plc 可能連接在同一 條信號轉導途徑上。因為如果是平

41、行作用，抑制其中一條途徑，不會完全抑制根毛變形的發(fā)生。3.3pld 與 ca2+ 的關系pld 和 ca2+ 均介導保衛(wèi)細胞和糊粉層細胞的aba 信號轉導(blatt 2000; schroeder 2001)。然而，aba 處理后，在大量保衛(wèi)細胞中并未檢測到 ca2+的增加，但氣孔對 aba 的反應卻很正常(romano 等 2000)，證明保衛(wèi)細胞中存在不依賴ca2+ 的aba 信號轉導途徑。用 pld 的抑制劑 1- 丁醇處理保衛(wèi) 細胞，也只消除 ab a 對氣孔開放的抑制作用的50% (j acob 等 1999)，說明保衛(wèi)細胞中存在 pld以外的 aba 信號轉導途徑。但是，pld

42、和 ca2+ 是 怎樣的關系呢？romano等(2000)用pa處理保衛(wèi)細 胞，但是并未檢測到胞質 ca2+ 濃度變化。這說明 pld 與 ca2+ 可能不在同一條途徑上，如果在同一途徑上，pld 一定位于 ca2+ 的下游。推測可能存 在 pld 的翻譯后修飾，如 ca2+ 通過調節(jié) cdpk 對 pld 進行磷酸化作用，這還有待于證實。而在谷 物糊粉層細胞中，aba 通過翻譯后調節(jié)作用激活 pld，產生的 pa 能夠激活 aba 誘導的基因，并 通過降低 ca2+ 濃度，抵消ga 誘導的胞質ca2+ 濃度 增加，從而抑制 - 淀粉酶的產生(ritchie 和 gilroy1998)?？梢?，

43、糊粉層細胞和保衛(wèi)細胞都存在保守的 pld 相關的 aba 信號轉導途徑。然而細胞特異性反應出現(xiàn)在 pld 和 ca2+ 信號之間的關系上。在 保衛(wèi)細胞中，pld 介導不依賴 ca2+ 的 aba 信號轉 導途徑。在糊粉層細胞中，pa 通過降低 ca 2+ 濃 度完成信號轉導作用。甚至同一種磷脂酶的不同類型水解作用產生的信使物質，分子種不同，可能對下游靶物產生不同的 作用，目前尚未證實。但是，高度保守的反應 因素完全可能產生較大差異的細胞作用，如鈣調 素(cam)在蛋白質結構方面的微小差異可以導致對 下游調節(jié)作用上的巨大差異。因此，要闡明 pld 的調節(jié)作用的機制，還需要弄清不同分子種的信 使物

44、質之間的作用的差異。隨著研究結果的不斷積累，人們終將通過遺 傳操作、結構分析、基因組分析等方法手段，最 終弄清楚是哪一種 pld 在哪一種細胞中對哪一種 處理做出反應，明確每個 pld 在特定的細胞信號 轉導網絡中的具體位置，不但能夠揭示 pld 的細 胞信號轉導作用及其機制，對于闡明植物生長與 發(fā)育過程中的磷脂信號轉導途徑也十分重要。4問題與展望對 pld 的結構、生化特性與細胞信號轉導功能的研究已經取得較大進展。蛋白質結構中 c2 域、ph 和 px 域的存在，pld 的復雜調控機制， 以及 pld 作用的特異性研究揭示了 pld 在細胞調 節(jié)方面的重要性與復雜性。要進一步了解 pld 和

45、 磷脂信號轉導，還需要攻克以下兩個難題。一個是明確 pld 在特定的細胞與生理過程中的功能。 pld 基因敲除和獲得反義轉基因植物、一種或多 種 pld 功能缺失的突變體等，都是解決這一問題 的有效途徑。另外，隨著各種 pld 的分子生物學 方面的信息的增加，pl d 類型特異性的抗體和 dna/rna 探針將會出現(xiàn)，并成為解決這些問題的 有效工具。另一個難題是揭示 pld 調節(jié)細胞反應 的機制。包含 pld 的磷脂信號轉導網絡存在特異 性，說明 pld 作用機制相當復雜。不同的磷脂信 號轉導網絡中 pa、dag、lysopa 和 ffa 等磷脂 信使物質在生成途徑上有差異，這可能在調節(jié)信 使

46、物質的數量、位置、產生時間以及酰基組成方 面有重要作用(hodgkin 等 1998)。磷脂信使物質的 產生位置是個關鍵因素，因為磷脂在細胞內的移 動十分有限。磷脂信使物質不但分布在不同的 膜，如質膜、內質網膜和核膜等膜上，還被區(qū) 隔在特定膜的某個區(qū)域里(hooper 1999)。磷脂信 使物質產生的時間順序在信號轉導作用中也有其重 要意義。所以，需要明確不同 pld 的時空表達、 細胞與組織定位。然而，目前還只對 pld 了解 了一些這方面的信息。另外，還需要明確 pld 和pa 直接的下游靶物。目前，對于 pa 、pa 衍生 出的信使物質以及磷脂水解產生的膽堿、乙醇胺等游離頭部(free

47、head group)的下游反應或過程(激酶、磷酸酶、離子通道蛋白、結合蛋白以及其 它靶物)了解甚少。在aba 和脅迫信號轉導途徑中 研究 pld 有利于解決這一問題，因為這些過程中 的一些成分已經被鑒定了。此外，不同的磷脂酶參 考 文 獻abousalham a, nari j, teissere m, ferte n, noat g, verger r (1997). study of fatty acid specificity of su n flow er phospholipase d using detergent/phospholipid micelles.eur j bioc

48、hem. 248: 374-379au s t in -b r o w n s , c h a p m a n k d ( 200 2) . in hib it ion o f phospholipase d by n-acylethanolamines. plant physiol,129: 1892-1898blatt mr (2000). ca2+ signalling and control of guard-cell volume in stomatal movements. curr opin plant biol, 3: 196-204cockcroft s (1997). ph

49、ospholipase d: regulation by gtpases and protein kinase c and physiological relevance. proglipid res, 35: 345-370colley wc, sung t, roll r, jenco j, hammond sm, altshuller y , bar-sagi d , m o rr is aj , fr oh m a n m a (1 99 7 ) . ph ospholipase d 2, a distinct ph ospholipase d isoform with novel r

50、egulatory properties that provokes cytoskeletalreorganization. curr biol, 7: 191-201den hartog m, musgrave a, mun nik t (2 001). nod factor- induced phosphatidic acid and diacylglycerol pyrophosphate formation: a role for phospholipase c and d in root hairdeformation. plant j, 25: 55-66el maarouf h

51、, zu ily-fodil y , gareil m, darcy-lam eta a, pham -t h i at (1999 ). e n zym a tic activ ity and gene expression under water stress of phospholipase d in two cultivars of vigna unguiculata l. walp. differing in droughttolerance. plant mol biol, 39: 1257-1265fan l, zhang s, wan g x (1 997 ). an tise

52、nse suppression of ph ospholipase d retards abscisic acid- an d eth ylen e-promoted senescence of postharvest arabid opsis leaves.plant cell, 9: 2183-2196farmer pk, choi jh (1999). calcium and phospholipid activation of a recom b in an t calciu m -dependent protein kinase (dcc pk1 ) from carrot (da

53、ucu s ca rota l.). biochimbiophys acta, 1434: 6-17frank w, munnik t, kerkmann k, salamini f, bartels d (2000).water deficit triggers ph osph olipase d activity in th e resurrection plant craterostigma plantagineum. plant cell,12: 111-124frohm an ma, sung tc, m orris aj (1999 ). m am m alian phosphol

54、ipase d structure and regulation. biochim biophys acta, 1439: 175-186hanahan dj, chaicoff il (1948). on the nature of the phosphorus- containing lipids of cabbage leaves and their relation to ph osph olipid-slitin g-slitin g en zym e con tain ed in th e leaves. j biol chem, 172: 191-198hodgkin mn, p

55、ettitt tr, martin a, michell rh, pemberton aj, wa k e l a m m j ( 1 99 8). d i ac y l g l y c e r ol s and phosphatidates: which molecular species are intracellular messengers? trends biochem sci, 23: 200-204hooper n m(19 99 ). d etergent insoluble glycosphingolipid/ choleste rol-rich m em bra ne do

56、m ain s, lipid rafts an d caveolae. mol membr biol, 16: 145-156jacob t, ritchie s, assmann sm, gilroy s (1999). abscisic acid s ig n a l t r a n s d u c t ion in gu a r d c ells is m e d ia t ed b y phospholipase d activity. proc natl acad sci usa, 96 :12192-12197je n k ins g h , fis et t e p l , an

57、 d e rs o n r a ( 1 994) . type i phosphatidylin ositol 4-phosphate 5-kinase isoform s are specificially stimulated by phosphatidic acid. j biol chem,269: 11547-11554katagiri t, mizoguchi t, shinozaki k (1996). molecular cloning of a cd n a en codin g diacylglycerol kin ase (d gk) inarabidopsis thaliana. plant mol biol, 30: 647-653katagiri t, takahashi s, shinozaki k (2