生物技術在園林植物遺傳改良上的應用

1、1.基因工程（基因工程（Gene Engineering） 2.細胞工程（細胞工程（Cell Engineering ） 3.酶工程（酶工程（Enzyme Engineering ） 4.發(fā)酵工程（發(fā)酵工程（Fermentation Engineering ） 5.蛋白質工程（蛋白質工程（Protein Engineering ） 細胞工程就是在細細胞工程就是在細 胞水平研究開發(fā)、胞水平研究開發(fā)、 利用各類細胞的工利用各類細胞的工 程。亦即人們根據程。亦即人們根據 科學設計改變細胞科學設計改變細胞 的遺傳基礎，通過的遺傳基礎，通過 無菌操作，大量培無菌操作，大量培 養(yǎng)細胞、組織乃至養(yǎng)細胞、組織

2、乃至 完整個體的技術。完整個體的技術。 1.分離基因的技術；分離基因的技術； 2.擴增基因的技術；擴增基因的技術； 3.將單一細胞擴增成細胞群體的技術；將單一細胞擴增成細胞群體的技術； 4.將一個生命體復制成一個與之完全相同將一個生命體復制成一個與之完全相同 的新個體的過程；的新個體的過程； 5.將單一個體擴增成一個遺傳上完全相同將單一個體擴增成一個遺傳上完全相同 的群體。的群體。 6.一個遺傳上來源完全相同的生物群體一個遺傳上來源完全相同的生物群體。 l植物組織培養(yǎng)技術是現代植物生植物組織培養(yǎng)技術是現代植物生 物技術的基本技術。物技術的基本技術。 l植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng) (plant t

3、issue (plant tissue culture)culture)：是指在無菌條件下，將離：是指在無菌條件下，將離 體的植物材料（器官、組織、細胞以體的植物材料（器官、組織、細胞以 及原生質體等）培養(yǎng)在人工配制的培及原生質體等）培養(yǎng)在人工配制的培 養(yǎng)基上，在適宜的光照和溫度條件下，養(yǎng)基上，在適宜的光照和溫度條件下， 使其再生，形成完整植株或生產具有使其再生，形成完整植株或生產具有 經濟價值的其他生物產品的一種技術。經濟價值的其他生物產品的一種技術。 l廣義的植物組織培養(yǎng)即植物離體培廣義的植物組織培養(yǎng)即植物離體培 養(yǎng)養(yǎng)(plant in vitro culture)(plant in vi

4、tro culture)，不，不 僅包括分生組織、輸導組織、薄壁僅包括分生組織、輸導組織、薄壁 組織等離體組織的培養(yǎng)，而且包括組織等離體組織的培養(yǎng)，而且包括 原生質體，懸浮細胞，根、莖、葉、原生質體，懸浮細胞，根、莖、葉、 花、果實，以及成熟和未成熟的胚花、果實，以及成熟和未成熟的胚 胎及至完整植株等的離體培養(yǎng)。胎及至完整植株等的離體培養(yǎng)。 l外植體外植體(explant)(explant)：由植物體：由植物體 上切下來用于離體培養(yǎng)的離體上切下來用于離體培養(yǎng)的離體 材料，包括任何植物的任何一材料，包括任何植物的任何一 部分活的組織，包括細胞、組部分活的組織，包括細胞、組 織和器官?？椇推鞴?。

5、l繼代培養(yǎng)（繼代培養(yǎng)（subculturesubculture）：由）：由 最初的外植體上新增殖的組織，最初的外植體上新增殖的組織， 繼續(xù)轉入新的培養(yǎng)基上進行培繼續(xù)轉入新的培養(yǎng)基上進行培 養(yǎng)的過程。養(yǎng)的過程。 l單細胞無性系：指在細胞培養(yǎng)單細胞無性系：指在細胞培養(yǎng) 中，由單細胞形成的無性系。中，由單細胞形成的無性系。 l愈傷組織（愈傷組織（calluscallus）：在組）：在組 織培養(yǎng)過程中，由外植體形織培養(yǎng)過程中，由外植體形 成的一團無特定結構和功能成的一團無特定結構和功能 的細胞團。的細胞團。 l胚狀體（胚狀體（embryoembryo）：在組織）：在組織 培養(yǎng)過程中，由外植體或愈培養(yǎng)過

6、程中，由外植體或愈 傷組織產生的，與正常受精傷組織產生的，與正常受精 卵發(fā)育方式類似的胚胎結構卵發(fā)育方式類似的胚胎結構 體。體。 根據培養(yǎng)材料的來源、特性及其應根據培養(yǎng)材料的來源、特性及其應 用，植物組織培養(yǎng)主要包括以下幾用，植物組織培養(yǎng)主要包括以下幾 個方面：個方面： l植株培養(yǎng)植株培養(yǎng) 離體器官培養(yǎng)離體器官培養(yǎng) l莖尖培養(yǎng)莖尖培養(yǎng) 胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng) l胚培養(yǎng)胚培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng) l胚珠和子房培養(yǎng)胚珠和子房培養(yǎng) 原生質體培養(yǎng)原生質體培養(yǎng) l花藥與花粉培養(yǎng)花藥與花粉培養(yǎng) 離體授粉受精離體授粉受精 l指對指對幼苗幼苗和和較大的完整植株較大的完整植株的培的培 養(yǎng)，主要用于提供適合接種的外養(yǎng)，主

7、要用于提供適合接種的外 植體或是研究植株在某些培養(yǎng)基植體或是研究植株在某些培養(yǎng)基 上的反應等。上的反應等。 l通常可分為：通?？煞譃椋呵げ迕缗囵B(yǎng)扦插苗培養(yǎng)和和種子種子 苗培養(yǎng)苗培養(yǎng)等類型。等類型。 l指對植物莖尖分生組織或更大的指對植物莖尖分生組織或更大的 芽在離體條件下進行培養(yǎng)，進而芽在離體條件下進行培養(yǎng)，進而 獲得完整植株的過程。獲得完整植株的過程。 l根據培養(yǎng)目的和外植體的取材大根據培養(yǎng)目的和外植體的取材大 小，分為小，分為普通莖尖培養(yǎng)普通莖尖培養(yǎng)（shoot shoot cultureculture）和）和莖尖分生組織培養(yǎng)莖尖分生組織培養(yǎng) （apical meristem cultur

8、eapical meristem culture）。）。 l指將受精后形成的指將受精后形成的胚胚從胚珠或種從胚珠或種 子中剝離出來，置于一定的培養(yǎng)子中剝離出來，置于一定的培養(yǎng) 基上生長發(fā)育成完整植株的過程?；仙L發(fā)育成完整植株的過程。 l它包括它包括未成熟胚未成熟胚、成熟胚成熟胚以及以及雜雜 種胚種胚的離體培養(yǎng)。的離體培養(yǎng)。 l將植物的將植物的離體胚珠離體胚珠或或子房子房接種到接種到 一定的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，最終一定的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，最終 獲得成熟種子或完整植株的過程。獲得成熟種子或完整植株的過程。 l根據授粉情況，可分為根據授粉情況，可分為已授粉胚已授粉胚 珠與子房的培養(yǎng)珠與子房的培養(yǎng)和

9、和未授粉胚珠與未授粉胚珠與 子房的培養(yǎng)子房的培養(yǎng)。 l在離體條件下，對處于一定發(fā)育在離體條件下，對處于一定發(fā)育 時期的時期的花藥花藥或或花粉花粉進行培養(yǎng)，使進行培養(yǎng)，使 其改變正常的發(fā)育方向而形成其改變正常的發(fā)育方向而形成單單 倍體植株倍體植株的過程。的過程。 l指以植物的指以植物的某一器官的全部或部某一器官的全部或部 分或器官原基分或器官原基作為外植體的離體作為外植體的離體 培養(yǎng)技術。培養(yǎng)技術。 l其材料包括：其材料包括：根尖、莖尖、莖段、根尖、莖尖、莖段、 莖的切塊、葉片、花瓣、花蕾、莖的切塊、葉片、花瓣、花蕾、 花托、子房、子葉、以及未成熟花托、子房、子葉、以及未成熟 的果實的果實等。等

10、。 l可培育出三倍體。可培育出三倍體。 l指以能保持較好分散性的單細胞 或很小的細胞團作為外植體的離 體培養(yǎng)技術。 l根據培養(yǎng)方式可分為懸浮培養(yǎng)、 平板培養(yǎng)、看護培養(yǎng)、微室培養(yǎng)、 微滴培養(yǎng)等類型。 l指對利用酶或物理方法去掉指對利用酶或物理方法去掉 細胞壁而獲得的細胞壁而獲得的原生質體原生質體作作 為外植體的離體培養(yǎng)技術。為外植體的離體培養(yǎng)技術。 l指在無菌條件下培養(yǎng)離體的未受指在無菌條件下培養(yǎng)離體的未受 精雌性器官并授以無菌花粉，花精雌性器官并授以無菌花粉，花 粉萌發(fā)后花粉管進入胚珠完成受粉萌發(fā)后花粉管進入胚珠完成受 精過程，進而獲得有生活力種子精過程，進而獲得有生活力種子 的技術。的技術。

11、 根據培養(yǎng)器官母本組織的保留情根據培養(yǎng)器官母本組織的保留情 況，分為：況，分為： l離體胚珠授粉離體胚珠授粉 l離體胎座授粉離體胎座授粉 l離體柱頭授粉離體柱頭授粉 l1 1、利用莖尖等培養(yǎng)進行園林植物的、利用莖尖等培養(yǎng)進行園林植物的 快速繁殖和工廠化育苗快速繁殖和工廠化育苗 通過莖尖、莖段培養(yǎng)，對于一些通過莖尖、莖段培養(yǎng)，對于一些 名優(yōu)特新品種（種類）、優(yōu)良自交名優(yōu)特新品種（種類）、優(yōu)良自交 不親和系、雄性不育系以及常規(guī)無不親和系、雄性不育系以及常規(guī)無 性繁殖困難的種類，均可快速形成性繁殖困難的種類，均可快速形成 無性繁殖系。無性繁殖系。 l2 2、利用微莖尖培養(yǎng)獲得無病毒植株、利用微莖尖培

12、養(yǎng)獲得無病毒植株 很多植物都帶有病毒，如果利用微很多植物都帶有病毒，如果利用微 莖尖培養(yǎng)，有可能獲得脫毒的試管莖尖培養(yǎng)，有可能獲得脫毒的試管 苗。苗。 l3 3、結合細胞和組織培養(yǎng)進行突變體、結合細胞和組織培養(yǎng)進行突變體 的誘導和篩選的誘導和篩選 培養(yǎng)組織或細胞處在不斷地分裂分培養(yǎng)組織或細胞處在不斷地分裂分 化狀態(tài)，易受培養(yǎng)條件和外加壓力化狀態(tài)，易受培養(yǎng)條件和外加壓力 （如射線、化學物質）的影響而產（如射線、化學物質）的影響而產 生突變。生突變。 如今，通過這一途徑已篩選到抗病、如今，通過這一途徑已篩選到抗病、 抗除草劑、抗鹽堿、高蛋白、高賴抗除草劑、抗鹽堿、高蛋白、高賴 氨酸等突變體，有些已

13、用于生產。氨酸等突變體，有些已用于生產。 l4 4、利用花藥與花粉培養(yǎng)等進行單倍、利用花藥與花粉培養(yǎng)等進行單倍 體育種體育種 將處于一定發(fā)育時期的花藥與花粉將處于一定發(fā)育時期的花藥與花粉 或未授粉的胚珠和子房進行離體培養(yǎng)，或未授粉的胚珠和子房進行離體培養(yǎng)， 可誘導雌、雄配子細胞發(fā)育成完整的可誘導雌、雄配子細胞發(fā)育成完整的 單倍體植株，再使優(yōu)良的單倍體植株單倍體植株，再使優(yōu)良的單倍體植株 染色體加倍，便可獲得純合穩(wěn)定的二染色體加倍，便可獲得純合穩(wěn)定的二 倍體植株。倍體植株。 l5 5、利用胚乳培養(yǎng)等獲得三倍體、利用胚乳培養(yǎng)等獲得三倍體 植株。植株。 l6 6、利用胚胎培養(yǎng)和體細胞雜交等克服、利用

14、胚胎培養(yǎng)和體細胞雜交等克服 遠緣雜交障礙遠緣雜交障礙 利用胚珠和子房培養(yǎng)進行試管授粉利用胚珠和子房培養(yǎng)進行試管授粉 和受精，可以克服由于柱頭或花柱等和受精，可以克服由于柱頭或花柱等 障礙所造成的雜交或自交不親和性。障礙所造成的雜交或自交不親和性。 通過原生質體融合途徑或以部分克服通過原生質體融合途徑或以部分克服 有性雜交種間的障礙，獲得體細胞雜有性雜交種間的障礙，獲得體細胞雜 種，給實現種間或屬間甚至科間廣泛種，給實現種間或屬間甚至科間廣泛 雜交以極大的促進作用。雜交以極大的促進作用。 l7 7、利用離體培養(yǎng)進行種質資源的、利用離體培養(yǎng)進行種質資源的 長期保存和遠距離運輸長期保存和遠距離運輸

15、利用莖尖及細胞培養(yǎng)結合低溫或利用莖尖及細胞培養(yǎng)結合低溫或 超低溫冷凍貯藏，不僅節(jié)約空間，超低溫冷凍貯藏，不僅節(jié)約空間， 又可以減少病蟲危害，也便于運又可以減少病蟲危害，也便于運 輸和交換種質資源。輸和交換種質資源。 l8 8、通過組織培養(yǎng)提供生物技術、通過組織培養(yǎng)提供生物技術 育種的中間材料。育種的中間材料。 l另外，利用植物組織、細胞及原另外，利用植物組織、細胞及原 生質體作為受體，通過某種途徑生質體作為受體，通過某種途徑 和技術將外源目的基因導入植物和技術將外源目的基因導入植物 細胞，使其再生成完整植株，可細胞，使其再生成完整植株，可 獲得能使外源目的基因穩(wěn)定表達獲得能使外源目的基因穩(wěn)定表

16、達 的轉基因植株。的轉基因植株。 l一、植物細胞具有全能性一、植物細胞具有全能性 l二、植物細胞可以進行脫分化二、植物細胞可以進行脫分化 l三、植物細胞可以進行再分化三、植物細胞可以進行再分化 l四、植物分化的激素調節(jié)四、植物分化的激素調節(jié) l植物細胞全能性（植物細胞全能性（totipotencytotipotency）：指）：指 植物的每個細胞都包含著該物種的全部植物的每個細胞都包含著該物種的全部 遺傳信息遺傳信息，從而具備發(fā)育成完整植株的，從而具備發(fā)育成完整植株的 遺傳能力。在適宜條件下，任何一個細遺傳能力。在適宜條件下，任何一個細 胞都可以發(fā)育成一個新個體。植物細胞胞都可以發(fā)育成一個新個

17、體。植物細胞 全能性是植物組織培養(yǎng)的理論基礎。全能性是植物組織培養(yǎng)的理論基礎。 l已分化的細胞在一定因素作用下已分化的細胞在一定因素作用下 重新恢復分裂能力，并改變原來重新恢復分裂能力，并改變原來 的發(fā)展方向而沿著一條新的途徑的發(fā)展方向而沿著一條新的途徑 發(fā)育的過程。發(fā)育的過程。 l脫分化的細胞團或組織經重新分脫分化的細胞團或組織經重新分 化而產生出新的具有特定結構和化而產生出新的具有特定結構和 功能的組織或器官的一種現象功能的組織或器官的一種現象 （如由愈傷組織形成根、芽或胚（如由愈傷組織形成根、芽或胚 狀體等）。狀體等）。 l激素是培養(yǎng)基中不可缺少的組成激素是培養(yǎng)基中不可缺少的組成 部分，

18、它對愈傷組織的誘導和器部分，它對愈傷組織的誘導和器 官分化都有直接的影響。包括：官分化都有直接的影響。包括： 細胞分裂素細胞分裂素 生長素生長素 lKT（激動素）（激動素） lZT（zeatin，玉米素），玉米素） l6BA（6芐基腺嘌呤）芐基腺嘌呤） l2ip（異戊烯基腺嘌呤）（異戊烯基腺嘌呤） l 促進細胞的分裂和器官分化、誘導胚促進細胞的分裂和器官分化、誘導胚 狀體狀體(embryoid)(embryoid)和不定芽的形成、延和不定芽的形成、延 遲組織的衰老并增強蛋白質的合成。遲組織的衰老并增強蛋白質的合成。 l2，4D（2，4二氯苯氧乙酸）二氯苯氧乙酸） lNAA（萘乙酸）（萘乙酸）

19、lIAA（吲哚乙酸）（吲哚乙酸） lIBA（吲哚丁酸）（吲哚丁酸） l2，4，5T l 促進細胞伸長生長和細胞分裂、誘導產促進細胞伸長生長和細胞分裂、誘導產 生愈傷組織、促進根的分化生愈傷組織、促進根的分化 l離體培養(yǎng)的關鍵之一是要保證無離體培養(yǎng)的關鍵之一是要保證無 菌，以免污染。菌，以免污染。 l因此，必須對實驗材料、各種用因此，必須對實驗材料、各種用 具進行嚴格的消毒。具進行嚴格的消毒。 l清洗玻璃器皿的設備：水槽、水清洗玻璃器皿的設備：水槽、水 桶、各種大小的試管刷、洗滌架、桶、各種大小的試管刷、洗滌架、 適用的工作臺等。還要有干燥箱。適用的工作臺等。還要有干燥箱。 l常用的洗滌劑：肥皂

20、、洗衣粉、常用的洗滌劑：肥皂、洗衣粉、 洗液（即鉻酸洗液（即鉻酸硫酸混合液）。硫酸混合液）。 l1、引起污染的因素：器皿與用具，、引起污染的因素：器皿與用具， 培養(yǎng)基，培養(yǎng)材料，操作時的空氣，培養(yǎng)基，培養(yǎng)材料，操作時的空氣， 工作人員的衣物等。工作人員的衣物等。 l2、對于器皿、衣物和培養(yǎng)基等可用、對于器皿、衣物和培養(yǎng)基等可用 熱壓滅菌鍋進行消毒，即高溫高壓熱壓滅菌鍋進行消毒，即高溫高壓 消毒。消毒。 l3、刀、剪、鑷子等用具，在使用前、刀、剪、鑷子等用具，在使用前 可插于可插于70的乙醇中，用時再在酒的乙醇中，用時再在酒 精燈的火焰上消毒，待冷卻后應用。精燈的火焰上消毒，待冷卻后應用。 也可

21、將它們裝在金屬盒內，放在也可將它們裝在金屬盒內，放在 150下的電熱烘箱內下的電熱烘箱內40分鐘或分鐘或 120下兩小時進行消毒。下兩小時進行消毒。 l4、接種室（箱）內的空間及地面和 墻壁，可用甲醛薰蒸滅菌或用紫外 燈照射。接種前也可用70的酒精 噴霧，使空間的灰塵降落及擦拭操 作臺表面。 5、接種材料的消毒 l消毒的原則：既要殺死材料上附著 的微生物，又不能傷及材料。 l常用的表面消毒的消毒劑：次氯酸 鈉，過氧化氫，低濃度的氯化汞等。 l包括接種室、接種箱、超凈工作包括接種室、接種箱、超凈工作 臺以及各種接種時的刀、鑷、剪臺以及各種接種時的刀、鑷、剪 之類的用具。之類的用具。 l接種室外最

22、好設有準備室，使工接種室外最好設有準備室，使工 作人員進入接種室前有一個過渡作人員進入接種室前有一個過渡 以減少將室外雜菌帶入室內。準以減少將室外雜菌帶入室內。準 備室可放置工作服、拖鞋中、帽備室可放置工作服、拖鞋中、帽 子等，并用紫外燈隨時進行滅菌。子等，并用紫外燈隨時進行滅菌。 l用于無菌操作的工具有：酒精燈、用于無菌操作的工具有：酒精燈、 貯存酒精（貯存酒精（70）棉球的廣口瓶）棉球的廣口瓶 及各種鑷子、接種針、接種鉤及各種鑷子、接種針、接種鉤 （或鏟）、剪子等。（或鏟）、剪子等。 l1、試管、試管 l2、L形管和形管和T形管形管 l3、長方形扁瓶及圓形扁瓶、長方形扁瓶及圓形扁瓶 l4、

23、三角瓶、三角瓶 l5、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)皿 l6、平型有角試管和無角試管、平型有角試管和無角試管 l7、細胞微室培養(yǎng)的器皿、細胞微室培養(yǎng)的器皿 l一、培養(yǎng)基的成分一、培養(yǎng)基的成分 l培養(yǎng)基的組成有大量元素、微量元素、培養(yǎng)基的組成有大量元素、微量元素、 碳水化合物、及各種有機附加物，如碳水化合物、及各種有機附加物，如 維生素、氨基酸、植物生長調節(jié)物質維生素、氨基酸、植物生長調節(jié)物質 及其他天然產物，如椰乳、酵母提取及其他天然產物，如椰乳、酵母提取 液、肌醇。用固體培養(yǎng)基時，還要加液、肌醇。用固體培養(yǎng)基時，還要加 入瓊脂。入瓊脂。 大量元素：大量元素： 一般是指濃度大于一般是指濃度大于 0.5mmol/

24、L.氮氮(N) 、磷、磷(P) 、鉀、鉀(K) 、鈣、鈣 (Ca) 、鎂、鎂(Mg) 、硫、硫(S) 。 微量元素：微量元素： 包括鐵包括鐵(Fe) 、銅、銅(Cu) 、鉬、鉬 (Mo) 、鋅、鋅(Zn) 、鈉、鈉(Na) 、錳、錳(Mn) 、 鈷鈷(Co) 、硼、硼(B) 、碘、碘(I)。 l蔗糖和葡萄糖等蔗糖和葡萄糖等 維生素、肌醇、氨基酸、有機添維生素、肌醇、氨基酸、有機添 加物。加物。 生長素生長素：2，4 - D、奈乙酸、奈乙酸(NAA)、吲、吲 哚丁酸（哚丁酸（IBA）、吲哚乙酸）、吲哚乙酸(IAA) 。 細胞分裂素細胞分裂素：激動素（：激動素（KT）、）、6-芐基芐基 氨基嘌呤（

25、氨基嘌呤（6BA） 、玉米素（、玉米素（ZT）。）。 赤霉素赤霉素（GA） 、脫落酸（、脫落酸（ABA） 、 乙烯利（乙烯利（CEDP）。）。 l固體培養(yǎng)基用固體培養(yǎng)基用 l如麥芽提取液、椰乳、鮮果汁、酵如麥芽提取液、椰乳、鮮果汁、酵 母提取液、番茄汁等。它們對愈傷母提取液、番茄汁等。它們對愈傷 組織的誘導和維持均是有益的。組織的誘導和維持均是有益的。 l1、重蒸鎦水的制備、重蒸鎦水的制備 l2、配制母液、配制母液 l配制培養(yǎng)基最方便的方法是先制配制培養(yǎng)基最方便的方法是先制 備一系列的母液。備一系列的母液。 3、培養(yǎng)基的配制和滅菌、培養(yǎng)基的配制和滅菌 l配制培養(yǎng)基時，可將大量元素和微量元素，配

26、制培養(yǎng)基時，可將大量元素和微量元素， 根據母液濃度稀釋至配方所需的濃度，再加根據母液濃度稀釋至配方所需的濃度，再加 上附加物質和蔗糖，待全部溶解后定容。隨上附加物質和蔗糖，待全部溶解后定容。隨 后用后用KOH或或NaOH及及HCl調正到需要的調正到需要的PH 值。再加入瓊脂，一般用量為值。再加入瓊脂，一般用量為0.50.9， 加熱全溶后再裝于培養(yǎng)瓶內。加熱全溶后再裝于培養(yǎng)瓶內。 l培養(yǎng)基要進行高壓滅菌。培養(yǎng)基要進行高壓滅菌。 l制備的培養(yǎng)基應在消毒后二星期內應用。制備的培養(yǎng)基應在消毒后二星期內應用。 l1、MS培養(yǎng)基培養(yǎng)基(Murashige和和Skoog,1962) l2、米勒培養(yǎng)基（、米勒

27、培養(yǎng)基（Miller,1963） l3、H培養(yǎng)基培養(yǎng)基(Bourgin和和Nitsch,1967) l4、改良懷特培養(yǎng)基、改良懷特培養(yǎng)基(White,1963) l5、B5培養(yǎng)基培養(yǎng)基(Gamborg等等,1968) l6、尼奇培養(yǎng)基、尼奇培養(yǎng)基(Nitsch,1951) l7、N6培養(yǎng)基（北京植物研究所，黑龍江農培養(yǎng)基（北京植物研究所，黑龍江農 業(yè)科學院，業(yè)科學院，1974） 植物組織培養(yǎng)經歷的五個階段：植物組織培養(yǎng)經歷的五個階段： （1）預備階段預備階段 外植體的獲得；外植體的獲得； 接種材料的消毒處理；接種材料的消毒處理； 配制適宜的培養(yǎng)基；配制適宜的培養(yǎng)基； （2）誘導去分化階段誘導去

28、分化階段 （3）繼代增殖階段）繼代增殖階段 （4）生根成芽階段）生根成芽階段 （5）移栽成活階段）移栽成活階段 l根據試驗目的，確定植物種類、根據試驗目的，確定植物種類、 品種并選擇合適的部位作為外植品種并選擇合適的部位作為外植 體，對外植體進行消毒處理。體，對外植體進行消毒處理。 l根據試驗材料，選擇適宜的培養(yǎng)根據試驗材料，選擇適宜的培養(yǎng) 基，配制后高壓滅菌備用。基，配制后高壓滅菌備用。 l將消毒好的外植體在無菌條件下將消毒好的外植體在無菌條件下 切成小塊（約切成小塊（約0.51.0cm），植），植 入培養(yǎng)基。入培養(yǎng)基。 l進行溫控和光控。進行溫控和光控。 l多數情況下，長出愈傷組織后，多數

29、情況下，長出愈傷組織后， 還要往分化培養(yǎng)基里轉移一次。還要往分化培養(yǎng)基里轉移一次。 l本階段的主要目的是提高移栽成本階段的主要目的是提高移栽成 活率。活率。 l經試驗表明：選擇壯苗。適當煉經試驗表明：選擇壯苗。適當煉 苗、控制水分供應、選擇適合的苗、控制水分供應、選擇適合的 移苗季節(jié)和選用合適的移栽土壤移苗季節(jié)和選用合適的移栽土壤 是提高移苗成活率的重要環(huán)節(jié)。是提高移苗成活率的重要環(huán)節(jié)。 1.單倍體的概念及其特點單倍體的概念及其特點 只含有一套染色體組的生物體；只含有一套染色體組的生物體； 被子植物的配子體世代。被子植物的配子體世代。 矮小性；矮小性； 不育性；不育性； 全顯性。全顯性。 1.

30、單倍體植物的直接利用；單倍體植物的直接利用； 2.克服雜種分離，縮短育種年限；克服雜種分離，縮短育種年限； 3.快速獲得異花授粉植物的自交系；快速獲得異花授粉植物的自交系； 4.單倍體植物的誘變育種；單倍體植物的誘變育種； 5.克服遠緣雜種不孕性與不穩(wěn)定的現象；克服遠緣雜種不孕性與不穩(wěn)定的現象； （1）單倍體材料的采集）單倍體材料的采集 單倍體育種的首要問題是如何獲得大最的單單倍體育種的首要問題是如何獲得大最的單 倍體植株。據現有的研究材料，用花藥培養(yǎng)產生倍體植株。據現有的研究材料，用花藥培養(yǎng)產生 單倍體植株有兩個途徑單倍體植株有兩個途徑: 第一是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉經過類似第一是在離體培

31、養(yǎng)的花藥中，花粉經過類似 胚胎發(fā)育的過程直接形成單倍體植物，如煙草、胚胎發(fā)育的過程直接形成單倍體植物，如煙草、 曼陀羅等。曼陀羅等。 第二是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉形成愈第二是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉形成愈 傷組織，再從愈傷組織分化出單倍體植株。傷組織，再從愈傷組織分化出單倍體植株。 （2）花藥的接種）花藥的接種 v接種前的準備工作接種前的準備工作 接種和培養(yǎng)花藥是在無菌條件下進行的，所接種和培養(yǎng)花藥是在無菌條件下進行的，所 用的一切用具必須徹底滅菌。用的一切用具必須徹底滅菌。 v花粉發(fā)育時期的鑒定花粉發(fā)育時期的鑒定 適宜的花粉發(fā)育時期對于提高花粉誘導愈傷適宜的花粉發(fā)育時期對于提高花粉誘導愈傷

32、 組織分化的頻率是很重要的，為此，進行花藥組織分化的頻率是很重要的，為此，進行花藥 培養(yǎng)前，要用顯微鏡進行花粉發(fā)育時期的鑒定。培養(yǎng)前，要用顯微鏡進行花粉發(fā)育時期的鑒定。 經顯微鏡檢查后，把花粉細胞的發(fā)育進期與經顯微鏡檢查后，把花粉細胞的發(fā)育進期與 花藥或花序的外部形態(tài)聯系起來，找出花粉單花藥或花序的外部形態(tài)聯系起來，找出花粉單 核期或單核期的花蕾或花序的外部形態(tài)標志選核期或單核期的花蕾或花序的外部形態(tài)標志選 取花藥進行接種培養(yǎng)。取花藥進行接種培養(yǎng)。 誘導愈傷組織分化出根、莖、葉的方法是在誘導愈傷組織分化出根、莖、葉的方法是在 愈傷組織長到愈傷組織長到1-3毫米大?。ㄈ缧∶状螅r，即毫米大?。ㄈ?/p>

33、小米大）時，即 可轉移到誘導分化培養(yǎng)基上，促使分化長出植株?？赊D移到誘導分化培養(yǎng)基上，促使分化長出植株。 一般說來，愈傷組織如果先形成芽，隨后根自然一般說來，愈傷組織如果先形成芽，隨后根自然 會發(fā)生，如果先有根，以后不一定會出芽。因此，會發(fā)生，如果先有根，以后不一定會出芽。因此， 掌握芽分化的條件是十分重要的。掌握芽分化的條件是十分重要的。 愈傷組織轉移培養(yǎng)工作是在無菌室或接種愈傷組織轉移培養(yǎng)工作是在無菌室或接種 箱內進行的，轉移后愈傷組織培養(yǎng)在箱內進行的，轉移后愈傷組織培養(yǎng)在23-28恒恒 溫室內，每日光照溫室內，每日光照9-11小時，可用日光燈作輔助小時，可用日光燈作輔助 光，光強度在光，

34、光強度在2000勒克斯以上。勒克斯以上。 在轉移愈傷組織時，應注意其極性，原來在轉移愈傷組織時，應注意其極性，原來 向上的一但轉移后的一但轉移后仍應向上，否則向上的一但轉移后的一但轉移后仍應向上，否則 會影響生長，同時在轉移時，就避免沾帶過多的會影響生長，同時在轉移時，就避免沾帶過多的 培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。 處理方式：處理方式： l試管內進行；試管內進行； l花粉植株定植后進行；花粉植株定植后進行； 藥劑處理；藥劑處理； 植株鑒定。植株鑒定。 l常規(guī)雜交育種由于物種間難以逾越常規(guī)雜交育種由于物種間難以逾越 的天然屏障而舉步維艱。的天然屏障而舉步維艱。 科學家們科學家們 受細胞全能性理論及組織培養(yǎng)成

35、功受細胞全能性理論及組織培養(yǎng)成功 的啟示，逐漸將眼光轉向細胞融合，的啟示，逐漸將眼光轉向細胞融合， 試圖通過這種嶄新的手段沖破自然試圖通過這種嶄新的手段沖破自然 界的禁錮。界的禁錮。 1.原生質體的概念原生質體的概念 植物細胞原生質體是指那些以去除植物細胞原生質體是指那些以去除 全部細胞壁的細胞。全部細胞壁的細胞。 此時，細胞外僅由此時，細胞外僅由 細胞膜包裹，細胞膜包裹， 呈圓形只有在高滲溶液中呈圓形只有在高滲溶液中 才能相對穩(wěn)定。才能相對穩(wěn)定。 原生質體經適當處理，可與其他細原生質體經適當處理，可與其他細 胞融合成新的體細胞。胞融合成新的體細胞。 比完整的細胞更容易獲得外來遺傳物質，比完整

36、的細胞更容易獲得外來遺傳物質， 為實現異源遺傳物質轉化提供了較好的為實現異源遺傳物質轉化提供了較好的 實驗材料。實驗材料。 原生質體在一定條件下可以融合成雜種原生質體在一定條件下可以融合成雜種 細胞，開辟了一條新的育種途徑。細胞，開辟了一條新的育種途徑。 1892， J. A. Klerker 用機械法獲得原生質體；用機械法獲得原生質體； 1960，E.C. Cocking 用酶法首先從番茄根尖中分離出用酶法首先從番茄根尖中分離出 大量有活性的原生質體并通過培養(yǎng)再生出細胞壁大量有活性的原生質體并通過培養(yǎng)再生出細胞壁 形成再生植株形成再生植株; 1960，G. Barski發(fā)現發(fā)現, 題細胞原生

37、質體能融合在一起題細胞原生質體能融合在一起 形成單核的、并能進行分裂的雜種細胞；形成單核的、并能進行分裂的雜種細胞； 1972，P.S.Carlon首次獲得煙草體細胞種間雜種。首次獲得煙草體細胞種間雜種。 80s 此項技術在我國得到發(fā)展。此項技術在我國得到發(fā)展。 4. 原生質體的制備原生質體的制備 （1）取材與滅菌）取材與滅菌 （2）酶解）酶解 (纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶) （3）分離）分離 （沉淀法、漂洗法、滴洗法）（沉淀法、漂洗法、滴洗法） （4）洗滌）洗滌 （5）鑒定（形態(tài)觀測、活性鑒定）鑒定（形態(tài)觀測、活性鑒定） 原生質體的培養(yǎng)：原生質體的培養(yǎng)： 細胞壁

38、再生；細胞壁再生； 細胞分裂；細胞分裂； 植株再生。植株再生。 5. 原生質體的融合原生質體的融合 v化學法誘導融合化學法誘導融合 1)按比例混合雙親原生質體按比例混合雙親原生質體- 2)滴加滴加PEG- 3)滴加高鈣高滴加高鈣高PH值溶液值溶液- 4)洗滌原生質體溶液洗滌原生質體溶液- 5)離心獲得原生質體溶液離心獲得原生質體溶液- 6)篩選雜種細胞篩選雜種細胞- 7)再生雜種細胞。再生雜種細胞。 v物理法誘導融合物理法誘導融合 基本程序：基本程序： l原生質體的獲得；原生質體的獲得； l電擊融合；電擊融合； l篩選雜種細胞；篩選雜種細胞； l雜種細胞再生和完雜種細胞再生和完 整植株的形成。

39、整植株的形成。 6. 融合細胞的培養(yǎng)鑒定與篩選融合細胞的培養(yǎng)鑒定與篩選 雜和細胞的顯微鏡鑒別；雜和細胞的顯微鏡鑒別； 互補法鑒定雜和細胞；互補法鑒定雜和細胞； 細胞與分子生物學法；細胞與分子生物學法； 植株形態(tài)的鑒別。植株形態(tài)的鑒別。 人工種子即人為制造的種子，它人工種子即人為制造的種子，它 是一種含有植物胚狀體或芽、營是一種含有植物胚狀體或芽、營 養(yǎng)成分、激素、及其他成分的人養(yǎng)成分、激素、及其他成分的人 工膠囊。其具有種子的功能，可工膠囊。其具有種子的功能，可 直接用于田間播種。直接用于田間播種。 1、人工種子的構成人工種子的構成 人工種皮人工種皮 胚胚 狀狀 體體 人工胚乳人工胚乳 2、人

40、工種子的特點人工種子的特點： （1）可以不受環(huán)境條件的限制，周年進行生產；）可以不受環(huán)境條件的限制，周年進行生產； （2）經人工無性繁殖產生，有利于保存該種系）經人工無性繁殖產生，有利于保存該種系 的優(yōu)良性狀；的優(yōu)良性狀； （3）成本低，適于田間機械化生產；）成本低，適于田間機械化生產； （4）可根據需要調節(jié)胚乳成分。）可根據需要調節(jié)胚乳成分。 3、人工種子的制備人工種子的制備 （1）胚狀體的制備及其同步生長；）胚狀體的制備及其同步生長； （2）人工胚乳的制備；）人工胚乳的制備； （3）配制包埋劑及人工包埋。）配制包埋劑及人工包埋。 人工種子包埋示意圖人工種子包埋示意圖 4%海藻酸鈉 體細胞胚

41、 包埋丸 2% CaCl 人工種子 水 4、人工種子的貯存與萌發(fā)、人工種子的貯存與萌發(fā) 低溫、干燥、潔凈。低溫、干燥、潔凈。 （一）基因工程的含義 按照人們的愿望， 進行嚴密的設 計， 通過體外 DNA重組技術 和DNA 轉移技術，有目的地改造生物種性， 使現有物種在短時間內趣于完善， 創(chuàng) 造出新的生物類型。 致癌農桿菌介導的致癌農桿菌介導的Ti質粒載體轉化法質粒載體轉化法 重組重組DNA的直接轉化法的直接轉化法 微粒散射技術微粒散射技術 (Particle bombardment) （二）基因工程的基本步驟 1、目的基因的克隆與鑒定； 2、植物表達載體的構建； 3、植物的遺傳轉化； 4、轉化

42、細胞的篩選； 5、轉基因植株的鑒定。 基因基因 基因克隆基因克隆基因轉化基因轉化 DNA重組技術重組技術 植物遺傳轉化技術植物遺傳轉化技術 植物組織培養(yǎng)技術植物組織培養(yǎng)技術 1. DNA1. DNA遺傳標記的特點：遺傳標記的特點： v 數量極多；數量極多； v 遺傳上穩(wěn)定；遺傳上穩(wěn)定； v 排除了環(huán)境差異排除了環(huán)境差異. . 2. DNA2. DNA遺傳標記的應用遺傳標記的應用 v構建遺傳圖譜；構建遺傳圖譜； v分析親緣關系；分析親緣關系； v定位農藝性狀；定位農藝性狀； v分子標記輔助選擇；分子標記輔助選擇； v種質資源及雜種后代的鑒定。種質資源及雜種后代的鑒定。 1.RFLP Restri

43、ction fragment length polymorphisms 2.RAPD 3.AFLP 4.SSR 5.SSLP l植物組織培養(yǎng)的概念 l植物組織培養(yǎng)的類型 l植物組織培養(yǎng)在園林植物育種中的應用 l植物組織培養(yǎng)的理論基礎 l植物組織培養(yǎng)實驗室的設備 l培養(yǎng)基 的種類、成分和配制 l植物組織培養(yǎng)的基本程序 l重點內容：重點內容：植物組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)的概念 ， 在園林植物育種中的應用，理論基在園林植物育種中的應用，理論基 礎，培養(yǎng)基礎，培養(yǎng)基 的配制，基本程序。的配制，基本程序。 l難點內容：難點內容：植物組織培養(yǎng)的理論基植物組織培養(yǎng)的理論基 礎礎 ，培養(yǎng)基，培養(yǎng)基 的種類、成分和配制，的種類、成分和配制， 植物組織培養(yǎng)的基本程序植物組織培養(yǎng)的基本程序 。 l概概 念：念：植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng) ，外植體，外植體， 繼代培養(yǎng)，單細胞無性系，愈傷繼代培養(yǎng)，單細胞無性系，愈傷 組織，胚狀體。組織，胚狀體。 l1.植物離體培養(yǎng)的基本原理是什么？離植物離體培養(yǎng)的基本原理是什么？離 體培養(yǎng)技術在園林植物育種中有何應體培養(yǎng)技術在園林植物育種中有何應 用價值？用價值？ l2.植物離體培養(yǎng)一般要有哪些主要步驟，植物離體培養(yǎng)一般要有哪些主要步驟， 各包含哪些主要工作？各包含哪些主要