雙向電泳步驟--標(biāo)準(zhǔn)操作完整版

1、雙向電泳步驟-標(biāo)準(zhǔn)操作完整版 導(dǎo)讀：就愛閱讀網(wǎng)友為您分享以下“雙向電泳步驟-標(biāo)準(zhǔn)操作完整版”的資訊，希望對(duì)您有所幫助，感謝您對(duì)的支持!雙向電泳 一、 儲(chǔ)備液的配制： 水化儲(chǔ)液： 尿素(MW 60.06) 7M 10.5g 硫脲(MW 76.12) 2M 3.8g CHAPS(MW614.89) 2% 0.5g 加超純水定容至25mL后經(jīng)0.22m一次性濾膜過濾，過濾后分裝成50小管，每小管500uL，-20冰箱保存。 1%溴酚藍(lán)儲(chǔ)液 溴酚藍(lán) 1% 1g Tris-Base 50mM 0.6g 加超純水至100mL。 30%T,2.6%C聚丙烯酰胺貯液：（凝膠厚度1.5mm） 丙烯酰胺146g

2、甲叉雙丙烯酰胺4g 用超純水定容至500mL，經(jīng)0.22m濾紙過濾后，使用棕色瓶于4冰箱保存。 丙烯酰胺的計(jì)算： T=（丙烯酰胺質(zhì)量+甲叉丙烯酰胺質(zhì)量）/總質(zhì)量100%=（丙烯酰胺克數(shù)+交聯(lián)劑克數(shù)）/總體積（ml）100% C=甲叉丙烯酰胺質(zhì)量/（丙烯酰胺質(zhì)量+甲叉丙烯酰胺質(zhì)量）100%=交聯(lián)劑克數(shù)/（丙烯酰胺克數(shù)+交聯(lián)劑克數(shù)）100% C值高，孔徑小，凝膠較硬；C值低，孔徑大，適合跑蛋白質(zhì)。 1.5MTris-BasepH8.8 ： Tris-Base（MW 121.1）90.75g 加超純水至400mL 用濃鹽酸調(diào)pH至8.8（大約加入8ml），加超純水定容至500mL。4冰箱保存。 10

3、% SDS ： SDS 10g 加超純水至100mL，混勻后過濾，室溫保存。 電泳緩沖液： Tris-Base（FW 121.1）25mM12g 甘氨酸（FW 75.07）192mM57.6g SDS(FW 288.38)0.1%4g 加入超純水4L 平衡儲(chǔ)液： 1.5M Tris-CL（pH8.8）50mM 16.75mL 尿素(MW 60.06) 6M 180.18g 甘油 30%（V/V） 150mL SDS(FW 288.38)2%（W/V） 10g 溴酚藍(lán)儲(chǔ)液（1%） 0.002%（W/V） 1mL 加超純水至500mL，40mL分裝，-20保存。 二、臨用前配置溶液 水化液： 水化

4、儲(chǔ)液 500uL DTT 20mM3.5uL IPG 0.5% 2.5uL 1%溴酚藍(lán)儲(chǔ)液 0.002% 1uL 膠條平衡緩沖液A： 平衡儲(chǔ)液 20mL DTT 1% 0.2g 充分混勻。 膠條平衡緩沖液B： 平衡儲(chǔ)液 20mL 碘乙酰胺 2.5% 0.5g 充分混勻，避光配制。 低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液： 低熔點(diǎn)瓊脂糖 0.5% 0.05g 電泳緩沖液 10mL 溴酚藍(lán) 0.001%10?L（1%溴酚藍(lán)） 加熱溶解至澄清，室溫保存。 10% 過硫酸銨： 過硫酸銨 0.1g 超純水 1mL 三、操作步驟 （一）第一向等電聚焦 一向電泳的準(zhǔn)備工作： 1、使用清水沖洗膠條槽，并用牙刷認(rèn)真刷洗膠條槽內(nèi)槽以

5、及正負(fù)兩個(gè)電極，并使用Strip HoLderCLeaningSoLution清洗膠條槽，之后用二級(jí)純水沖洗干凈，自然晾干，膠槽的蓋子同樣使用Strip HoLderCLeaningSoLution清洗自然晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。 2、從冰箱中取-20冷凍保存的水化儲(chǔ)液或用吹風(fēng)機(jī)吹干，置室溫溶解，配制水化液。 3、使用brandford法測(cè)量蛋白樣品的相對(duì)上樣濃度，計(jì)算上樣量（每種蛋白樣品上樣量為150ug）。將每種蛋白溶液的體積用水化液補(bǔ)充至250uL。震蕩混勻樣品后，以13200rpm4離心30min。 4、使用酒精擦拭IPGphor的平板電極,以去除表面被氧化的部分,待酒精揮發(fā)完全之后備用。

6、 5、從冰箱取出-20冷凍保存的干膠條，于室溫放置平衡10分鐘。 6、膠條槽平行的放在IPGphor的平板電極上，將處理好的樣品均勻的加入到膠條槽中，取室溫平衡的膠條，用鑷子輕輕的去除預(yù)制干膠條的保護(hù)膜，分清膠條的正負(fù)極，膠面向下放入膠條槽中，膠條吸脹15min-30min。 7、在每根膠條上加入1mL覆蓋油，可繼續(xù)吸脹30min，加入覆蓋油的作用是防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)。細(xì)胞裂解（蛋白質(zhì)提取） 一、試劑配置： PBS配方 氯化鈉(MW 58.44) 130mM 8g 氯化鉀(MW 74.5) 2.7mM 0.2g 十二水和磷酸氫二鈉(MW 358) 10 mM3.63g 磷酸二氫鉀(MW 136) 2 mM0.24g 加水至1L配好后進(jìn)行高壓滅菌。 Washing buffer（500mL）配方 Tris（M