遺傳實驗人外周血培養(yǎng)與染

1、1.學習外周血淋巴細胞懸浮培養(yǎng)的原理和方法；學習外周血淋巴細胞懸浮培養(yǎng)的原理和方法； 2.利用培養(yǎng)后進行分裂的細胞制備人類染色體標本；利用培養(yǎng)后進行分裂的細胞制備人類染色體標本； 3.利用人類染色體核型分析軟件進行核型分析。利用人類染色體核型分析軟件進行核型分析。 一、一、 實驗目的：實驗目的： 二、實驗原理：二、實驗原理： 1、植物血凝素的作用、植物血凝素的作用 外周血中的淋巴細胞幾乎都是處在外周血中的淋巴細胞幾乎都是處在G0或或G1期，期， 一般情況下是不分裂的。當在培養(yǎng)基中加入一般情況下是不分裂的。當在培養(yǎng)基中加入植物植物 血凝素血凝素(PHA)時，這種小淋巴細胞受到刺激后轉化時，這種小

2、淋巴細胞受到刺激后轉化 為淋巴母細胞，進而開始進行有絲分裂。為淋巴母細胞，進而開始進行有絲分裂。 2、秋水仙素的作用：、秋水仙素的作用： 秋水仙素秋水仙素(colchicine)可以抑制細胞紡錘體可以抑制細胞紡錘體 的形成，使處在分裂的細胞停留在中期。因此利的形成，使處在分裂的細胞停留在中期。因此利 用秋水仙素處理可以獲得許多同步的中期分裂細用秋水仙素處理可以獲得許多同步的中期分裂細 胞。胞。 使用秋水仙素處理會引起染色體在一定程度使用秋水仙素處理會引起染色體在一定程度 上的收縮，因此在處理時間和濃度上要合適。上的收縮，因此在處理時間和濃度上要合適。 3、低滲的原理：、低滲的原理： 徐道覺徐道

3、覺(T.C.Hsu)等于等于1952年發(fā)現(xiàn)在固定年發(fā)現(xiàn)在固定 細胞之前使用低滲液進行處理，可以使細胞之前使用低滲液進行處理，可以使細胞的核細胞的核 膜吸水膨脹，滴片后細胞破裂膜吸水膨脹，滴片后細胞破裂，染色體分散開來，染色體分散開來， 在顯微鏡下易于觀察和統(tǒng)計，染色效果也明顯提在顯微鏡下易于觀察和統(tǒng)計，染色效果也明顯提 高。高。 4、核型和帶型：、核型和帶型： n核型核型(karyotype)： 是指染色體組在有絲分裂中期的表型是指染色體組在有絲分裂中期的表型這種技術這種技術 被廣泛采用后，使人類染色體分析技術得到了發(fā)展。被廣泛采用后，使人類染色體分析技術得到了發(fā)展。 , 是染色體數(shù)目、大小、

4、形態(tài)特征的總和。是染色體數(shù)目、大小、形態(tài)特征的總和。 在對染色體進行測量計算的基礎上在對染色體進行測量計算的基礎上, 進行分組、進行分組、 排隊、配對排隊、配對, 并進行形態(tài)分析的過程叫并進行形態(tài)分析的過程叫核型分析核型分析。 將一個染色體組的全部染色體逐條按其特征畫將一個染色體組的全部染色體逐條按其特征畫 下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖稱為下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖稱為 核型模式圖核型模式圖，它代表一個物種的核型模式。，它代表一個物種的核型模式。 n帶型帶型（banding pattern） 即染色體帶型。借助細胞學的特殊處理程序，即染色體帶型。借助細胞學的特殊處理程序，

5、 使染色體顯現(xiàn)出深淺不同的染色帶。染色帶的數(shù)使染色體顯現(xiàn)出深淺不同的染色帶。染色帶的數(shù) 目、部位、寬窄和著色深淺均具有相對穩(wěn)定性，目、部位、寬窄和著色深淺均具有相對穩(wěn)定性， 所以每一條染色體都有固定的分帶模式，即稱帶所以每一條染色體都有固定的分帶模式，即稱帶 型。型。 常用的顯帶技術所顯示的帶有常用的顯帶技術所顯示的帶有Q帶、帶、G帶、帶、C 帶、帶、R帶、帶、T帶帶等。就每一種分帶技術而言，每一等。就每一種分帶技術而言，每一 染色體的帶型是高度專一和恒定的。染色體的帶型是高度專一和恒定的。 三、實驗用具及試劑：三、實驗用具及試劑： 1.實驗儀器及用具：實驗儀器及用具： 恒溫培養(yǎng)箱、離心機、恒

6、溫水浴箱恒溫培養(yǎng)箱、離心機、恒溫水浴箱 、冰、冰 箱箱 、顯微鏡、顯微數(shù)碼攝像系統(tǒng)、染色體分析、顯微鏡、顯微數(shù)碼攝像系統(tǒng)、染色體分析 儀；儀； 培養(yǎng)瓶、注射器、微量移液器、槍頭、吸管、培養(yǎng)瓶、注射器、微量移液器、槍頭、吸管、 離心管離心管(10ml)、載玻片、燒杯、量筒。、載玻片、燒杯、量筒。 . 2. 實驗試劑：實驗試劑： 外周血淋巴細胞培養(yǎng)基外周血淋巴細胞培養(yǎng)基 2%碘酒碘酒 75%酒精酒精 20g/ml秋水仙素秋水仙素 0.075 mol/L KCl溶液溶液 甲醇甲醇 冰醋酸冰醋酸 Giemsa原液原液 1/15 mol/L磷酸緩沖液磷酸緩沖液 四、實驗步驟：四、實驗步驟： 1、采血：采

7、血：將皮膚常規(guī)消毒后靜脈采血約將皮膚常規(guī)消毒后靜脈采血約 0.5 ml。 2、種血及培養(yǎng)：種血及培養(yǎng)：將采到的血樣立即接種到培養(yǎng)瓶內，將采到的血樣立即接種到培養(yǎng)瓶內， 每個培養(yǎng)瓶接每個培養(yǎng)瓶接2528滴（約滴（約0.5ml），輕輕搖勻后），輕輕搖勻后 將培養(yǎng)瓶放在將培養(yǎng)瓶放在37溫箱中培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)過程小時。培養(yǎng)過程 中，每天應輕輕搖動兩次培養(yǎng)瓶。中，每天應輕輕搖動兩次培養(yǎng)瓶。 3、秋水仙素處理：秋水仙素處理：在終止培養(yǎng)前在終止培養(yǎng)前3-4小時，向培養(yǎng)小時，向培養(yǎng) 瓶中加瓶中加 20g/ml的秋水仙素的秋水仙素20l，輕輕搖勻后繼，輕輕搖勻后繼 續(xù)培養(yǎng)到續(xù)培養(yǎng)到72小時。小時。

8、4、制片：、制片： （1）離心：離心：從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，用吸管將培養(yǎng)液轉從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，用吸管將培養(yǎng)液轉 入入10ml的刻度離心管內。的刻度離心管內。2000轉轉/分，離心分，離心10分鐘。分鐘。 （2）低滲：低滲：棄去上清液。加入棄去上清液。加入37預熱的預熱的0.075 mol/L KCl 低滲液低滲液6-8ml，用吸管輕輕吹打均勻，用吸管輕輕吹打均勻， 放在放在37恒溫水浴中恒溫水浴中40分鐘。分鐘。 (此時配固定液：甲醇此時配固定液：甲醇225ml+冰醋酸冰醋酸75ml ) （3）預固定：預固定：在離心管中加入現(xiàn)配的預溫的甲醇在離心管中加入現(xiàn)配的預溫的甲醇-冰冰 醋酸醋酸(3:1

9、)固定液約固定液約1ml，輕輕混勻，輕輕混勻，37固定固定15分分 鐘。鐘。 （4）再次離心再次離心：2000轉轉/分離心分離心10分鐘。分鐘。 （5）第一次固定第一次固定：棄上清液，加入固定液約：棄上清液，加入固定液約7ml， 立即用吸管吹打使之成細胞懸液，室溫固定立即用吸管吹打使之成細胞懸液，室溫固定20分鐘。分鐘。 2000轉轉/分離心分離心10分鐘。分鐘。 （6）第二次固定第二次固定：同第一次固定。：同第一次固定。 （7）棄上清液棄上清液，根據(jù)沉淀量的多少，加入適量固，根據(jù)沉淀量的多少，加入適量固 定液定液68滴，用吸管吹打使均勻后制成細胞懸液。滴，用吸管吹打使均勻后制成細胞懸液。 （

10、8）滴片：滴片：在在30-40cm高處將細胞懸液滴在預冷的高處將細胞懸液滴在預冷的 載玻片上，注意動作應迅速，避免載片升溫。載玻片上，注意動作應迅速，避免載片升溫。 （9）染色：染色：用用10%吉姆薩染液扣染吉姆薩染液扣染30分鐘，染色結分鐘，染色結 束后用清水將浮色沖去，干燥后即可進行鏡檢。束后用清水將浮色沖去，干燥后即可進行鏡檢。 （10）照相：照相：在顯微鏡下尋找分散較好的分裂相在顯微鏡下尋找分散較好的分裂相(核核 型型)，再置于顯微照相儀下拍攝照片，并保存。，再置于顯微照相儀下拍攝照片，并保存。 （11）核型分析：核型分析：應用核型分析軟件，進行染色體應用核型分析軟件，進行染色體 核型

11、分析。核型分析。 核型分析儀及核型分析核型分析儀及核型分析 五、注意事項五、注意事項: 1、秋水仙素處理時間過長，分裂細胞多，染色體、秋水仙素處理時間過長，分裂細胞多，染色體 短小；反之，則少而細長。都不宜觀察形態(tài)及計數(shù)。短?。环粗?，則少而細長。都不宜觀察形態(tài)及計數(shù)。 故秋水仙素的濃度及時間要準確掌握。故秋水仙素的濃度及時間要準確掌握。 2、低滲使紅細胞膜破裂，淋巴細胞膨脹，低滲處、低滲使紅細胞膜破裂，淋巴細胞膨脹，低滲處 理濃度及時間要適當。且低滲后混勻細胞一定要輕，理濃度及時間要適當。且低滲后混勻細胞一定要輕， 否則引起膜破裂、染色體散失。否則引起膜破裂、染色體散失。 3、離心前配平，離心

12、速度過高，細胞團不易打散；、離心前配平，離心速度過高，細胞團不易打散； 反之，細胞易丟失。反之，細胞易丟失。 4、固定液應在使用前臨時配制。、固定液應在使用前臨時配制。 5、載玻片一定要潔凈，否則染色體分散不好。、載玻片一定要潔凈，否則染色體分散不好。 六、實驗結果與分析：六、實驗結果與分析： 染色體核型分析：人類每個體細胞有染色體核型分析：人類每個體細胞有 46條染色體，條染色體，22對常染色體和一對性染色對常染色體和一對性染色 體，男性為體，男性為46，XY；女性為；女性為46，XX。 A組（組（No.1 3）：是最大的一組染色體，它們的）：是最大的一組染色體，它們的 著絲粒在中部或幾乎在

13、中部，為中部著絲粒染色著絲粒在中部或幾乎在中部，為中部著絲粒染色 體；體； B組（組（N0.45）：為兩對大的亞中部著絲粒染色）：為兩對大的亞中部著絲粒染色 體，它們有明顯的長臂和短臂；體，它們有明顯的長臂和短臂； C組（組（N0.612+X）：為中等大小的亞中部著絲）：為中等大小的亞中部著絲 粒染色體，它們大小相差不多，粒染色體，它們大小相差不多，X染色體大小介染色體大小介 于期間，一般難以區(qū)分；于期間，一般難以區(qū)分； D組（組（N0.1315）：為中等大小的近端著絲粒染）：為中等大小的近端著絲粒染 色體，它們的一個重要形態(tài)特征是隨體，隨體是色體，它們的一個重要形態(tài)特征是隨體，隨體是 一對著

14、色很深的小球，處于短臂的末斷，隨體與一對著色很深的小球，處于短臂的末斷，隨體與 短臂之間的區(qū)域很少著色；短臂之間的區(qū)域很少著色； 人類染色體分組人類染色體分組 E組（組（N0.1618）：包括一對中著絲粒染色體）：包括一對中著絲粒染色體 （16）和兩對亞中著絲粒染色體（）和兩對亞中著絲粒染色體（17、18）；）； F組（組（N0.1920）：為兩對小的中部著絲粒染色）：為兩對小的中部著絲粒染色 體；體； G組（組（N0.2122+Y）：為最小的一組近端著絲粒）：為最小的一組近端著絲粒 染色體，在染色體，在N0.2122的短臂上可見隨體。的短臂上可見隨體。Y染染 色體常呈現(xiàn)異固縮狀態(tài)，著色更深，

15、可以識別。色體常呈現(xiàn)異固縮狀態(tài)，著色更深，可以識別。 人類染色體核型分析結果人類染色體核型分析結果 重要參數(shù)：重要參數(shù)： （1）染色體的相對長度）染色體的相對長度 （2）臂比率）臂比率 （3）著絲點指數(shù)）著絲點指數(shù) 七、作業(yè)及思考題：七、作業(yè)及思考題： 1、將分散良好的標本進行顯微照相；、將分散良好的標本進行顯微照相； 2、觀察人類染色體的形態(tài)、結構特點；、觀察人類染色體的形態(tài)、結構特點； 3、對比男性和女性的染色體標本，比較異同；、對比男性和女性的染色體標本，比較異同； 4、總結做好本實驗的關鍵因素。、總結做好本實驗的關鍵因素。 八、參考文獻：八、參考文獻： n醫(yī)學遺傳學基礎與臨床醫(yī)學遺傳學

16、基礎與臨床.程在玉，倫玉蘭程在玉，倫玉蘭.山山 東：青島出版社，東：青島出版社，1993. n遺傳學實驗教程遺傳學實驗教程.王建波，方呈祥等編王建波，方呈祥等編. 武武 漢：武漢出版社，漢：武漢出版社，2004. n外周血培養(yǎng)染色體失敗的原因分析外周血培養(yǎng)染色體失敗的原因分析.李慶，李慶， 王秉儀，洪美玲等王秉儀，洪美玲等. 解放軍醫(yī)學高等?？茖W解放軍醫(yī)學高等專科學 校學報，校學報，1999(1)：72. （完）（完） 核型核型 帶型帶型 返回返回 正正 常常 男男 性性 核核 型型 G AB C DE F 返回返回 2、秋水仙素的作用：、秋水仙素的作用： 秋水仙素秋水仙素(colchicin

17、e)可以抑制細胞紡錘體可以抑制細胞紡錘體 的形成，使處在分裂的細胞停留在中期。因此利的形成，使處在分裂的細胞停留在中期。因此利 用秋水仙素處理可以獲得許多同步的中期分裂細用秋水仙素處理可以獲得許多同步的中期分裂細 胞。胞。 使用秋水仙素處理會引起染色體在一定程度使用秋水仙素處理會引起染色體在一定程度 上的收縮，因此在處理時間和濃度上要合適。上的收縮，因此在處理時間和濃度上要合適。 n帶型帶型（banding pattern） 即染色體帶型。借助細胞學的特殊處理程序，即染色體帶型。借助細胞學的特殊處理程序， 使染色體顯現(xiàn)出深淺不同的染色帶。染色帶的數(shù)使染色體顯現(xiàn)出深淺不同的染色帶。染色帶的數(shù) 目

18、、部位、寬窄和著色深淺均具有相對穩(wěn)定性，目、部位、寬窄和著色深淺均具有相對穩(wěn)定性， 所以每一條染色體都有固定的分帶模式，即稱帶所以每一條染色體都有固定的分帶模式，即稱帶 型。型。 常用的顯帶技術所顯示的帶有常用的顯帶技術所顯示的帶有Q帶、帶、G帶、帶、C 帶、帶、R帶、帶、T帶帶等。就每一種分帶技術而言，每一等。就每一種分帶技術而言，每一 染色體的帶型是高度專一和恒定的。染色體的帶型是高度專一和恒定的。 三、實驗用具及試劑：三、實驗用具及試劑： 1.實驗儀器及用具：實驗儀器及用具： 恒溫培養(yǎng)箱、離心機、恒溫水浴箱恒溫培養(yǎng)箱、離心機、恒溫水浴箱 、冰、冰 箱箱 、顯微鏡、顯微數(shù)碼攝像系統(tǒng)、染色體分析、顯微鏡、顯微數(shù)碼攝像系統(tǒng)、染色體分析 儀；儀； 培養(yǎng)瓶、注射器、微量移液器、槍頭、吸管、培養(yǎng)瓶、注射器、微量移液器、槍頭、吸管、 離心管離心管(10ml)、載玻片、燒杯、量筒。、載玻片、燒杯、量筒。 . 2. 實驗試劑：實驗試劑： 外周血淋巴細胞培養(yǎng)基外周血淋巴細胞培養(yǎng)基 2%碘酒碘酒 75%酒精酒精 20g/ml秋水仙素秋水仙素 0.075 mol/L KCl溶液溶