核酸與核苷類藥物課件

1、第第 12 章章 核酸與核苷類藥物核酸與核苷類藥物 第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 一、核酸與核苷類藥物一、核酸與核苷類藥物 核酸與核苷類藥物是指具有藥用價(jià)值的核酸、核核酸與核苷類藥物是指具有藥用價(jià)值的核酸、核 苷酸、核苷或者堿基苷酸、核苷或者堿基 天然的、類似物、衍生物及其聚合物天然的、類似物、衍生物及其聚合物 作用：作用： 影響生物的蛋白質(zhì)合成和脂肪、糖類的代謝影響生物的蛋白質(zhì)合成和脂肪、糖類的代謝 恢復(fù)正常代謝或干擾某些異常代謝恢復(fù)正常代謝或干擾某些異常代謝 用途：放射病、血小板減少癥、白細(xì)胞減少癥、用途：放射病、血小板減少癥、白細(xì)胞減少癥、 急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎縮、腫瘤、病急慢性肝炎

2、、心血管疾病和肌肉萎縮、腫瘤、病 毒病毒病 核酸類物質(zhì)藥物一般可分為兩大類：核酸類物質(zhì)藥物一般可分為兩大類： 一類具天然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)，一類具天然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)， 另一類是自然結(jié)構(gòu)堿基、核苷、核苷酸的結(jié)另一類是自然結(jié)構(gòu)堿基、核苷、核苷酸的結(jié) 構(gòu)類似物或聚合物。構(gòu)類似物或聚合物。 前者是生物體合成原料或蛋白質(zhì)、脂肪、糖生物合成前者是生物體合成原料或蛋白質(zhì)、脂肪、糖生物合成 與降解以及能量代謝的輔酶，這一類藥物有助于改善機(jī)體與降解以及能量代謝的輔酶，這一類藥物有助于改善機(jī)體 的物質(zhì)代謝和能量平衡，加速受損組織的修復(fù)，促使缺氧的物質(zhì)代謝和能量平衡，加速受損組織的修復(fù)，促使缺氧 組織恢復(fù)正常生理機(jī)

3、能，臨床上已廣泛使用于放射病、血組織恢復(fù)正常生理機(jī)能，臨床上已廣泛使用于放射病、血 小板減少癥、白細(xì)胞減少癥、急慢性肝炎、心血管疾病、小板減少癥、白細(xì)胞減少癥、急慢性肝炎、心血管疾病、 肌肉萎縮等病癥的治療，包括肌苷、輔酶肌肉萎縮等病癥的治療，包括肌苷、輔酶A、GTP、CTP、 UTP、ATP、腺苷、輔酶、腺苷、輔酶I、輔酶、輔酶等，多數(shù)是生物體自等，多數(shù)是生物體自 身能夠合成的物質(zhì)，具有一定臨床功能，毒副作用小，基身能夠合成的物質(zhì)，具有一定臨床功能，毒副作用小，基 本都可經(jīng)微生物發(fā)酵或從生物資源中提取。本都可經(jīng)微生物發(fā)酵或從生物資源中提取。 后一類藥物是治療病毒感染性疾病、腫瘤的后一類藥物是

4、治療病毒感染性疾病、腫瘤的 重要手段，也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制的臨重要手段，也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制的臨 床藥物。床藥物。 正式用于臨床的抗病毒核苷類藥物有三氮唑正式用于臨床的抗病毒核苷類藥物有三氮唑 核苷、疊氮胸苷、阿糖腺苷等。核苷、疊氮胸苷、阿糖腺苷等。 珍奧核酸珍奧核酸 DNA藥物藥物 核苷類藥物核苷類藥物 恩替卡韋 二、核酸與核苷的一般理化性質(zhì)二、核酸與核苷的一般理化性質(zhì) 第二節(jié)第二節(jié) 制備的一般過(guò)程與原理制備的一般過(guò)程與原理 一、一、RNARNA的提取與制備的提取與制備 l 工業(yè)用工業(yè)用RNARNA的提取的提取 （1 1）RNARNA及其工業(yè)來(lái)源：及其工業(yè)來(lái)源：從微生物中提取從微生物

5、中提取RNARNA 是工業(yè)上最實(shí)際和有效的方法。一些最常見(jiàn)是工業(yè)上最實(shí)際和有效的方法。一些最常見(jiàn) 的菌體含有豐富的核酸資源，如酵母、白地的菌體含有豐富的核酸資源，如酵母、白地 霉、多種抗菌素的菌絲體霉、多種抗菌素的菌絲體青霉素，制霉青霉素，制霉 菌素等菌體。菌素等菌體。 通常在細(xì)菌中通常在細(xì)菌中RNARNA占占5 52525，在酵母，在酵母 中占中占2.72.71515，在霉菌中占，在霉菌中占0.7%0.7%2828。 在菌體內(nèi)RNA含量的變化受培養(yǎng)基組成影響，其中關(guān)鍵是 銨離子濃度和磷酸鹽濃度銨離子濃度和磷酸鹽濃度。培養(yǎng)酵母菌體收率高，易于提取 RNA。 很顯然在許多酵母中，早期細(xì)胞中的早期

6、細(xì)胞中的RNARNA含量高含量高，其確切 數(shù)值取決于碳、氮比例碳、氮比例和培養(yǎng)基組成等。 （2 2）高）高RNARNA含量酵母菌株的篩選含量酵母菌株的篩選 可以從自然界篩選篩選到RNA含量高的酵母菌株，也可用誘變誘變 育種育種的方法提高酵母菌的RNA含量。 稀堿法：稀堿法：是用氫氧化鈉溶液（氫氧化鈉溶液（1%1%），使細(xì)胞壁變性），使細(xì)胞壁變性，使核核 酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。需用酸中和PH7PH7。然后除去菌體除去菌體，將pH 調(diào)至RNA的等電點(diǎn)等電點(diǎn)（pH2.5pH2.5），使RNARNA沉淀沉淀出來(lái)。上法的缺點(diǎn)是 制得的RNA M Mr r較低較低,(磷酸單脂酶、磷酸二脂酶

7、降解磷酸單脂酶、磷酸二脂酶降解RNARNA，90 90 保持保持3 34h4h破壞酶破壞酶)。 濃鹽法：濃鹽法：是用高濃度鹽溶液（高濃度鹽溶液（6%6%8%8%）處理，同時(shí)加熱加熱， 以改變細(xì)胞壁的通透性改變細(xì)胞壁的通透性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。 要避免分子降解分子降解，可采用苯酚法苯酚法制備RNARNA。用苯酚處理生 物材料，使蛋白質(zhì)變性，然后離心，上層水溶液內(nèi)含有全部全部 RNARNA，可用乙醇沉淀乙醇沉淀出來(lái)。脫氧核糖核蛋白脫氧核糖核蛋白溶于濃鹽溶液濃鹽溶液 1mol/L1mol/L,不溶于0.14mol/0.14mol/L,而核糖核蛋白核糖核蛋白溶于0.14mo

8、l/L0.14mol/L鹽溶 液。 （3 3）RNARNA的提取實(shí)例：的提取實(shí)例： 啤酒酵母是提取RNA的很好的資源。取100g壓榨啤酒 酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH NaOH 3g的水，20以 下緩慢攪拌30分鐘。用6molL HCl調(diào)至pH7，攪拌15分鐘， 離心得清液255m1。冷至1010以下，6molL HCl調(diào)pH2.5pH2.5， 置冷過(guò)夜，離心得RNA l.8g（純度80）。 RNARNA提取實(shí)例：提取實(shí)例： 提取提取 中和中和 HCl 酸化、沉淀酸化、沉淀HCl 酵母酵母 提取液提取液 上清液上清液 RNA NaOH、水、水 pH 7、離心、離心 pH 2.

9、5、離心、離心 二、二、DNADNA的提取與制備的提取與制備 l 工業(yè)用工業(yè)用DNADNA的提取的提取 取新鮮冷凍魚(yú)精20kg，用絞肉機(jī)粉碎2次成漿狀，加入等 體積水，攪拌均勻，傾入反應(yīng)鍋內(nèi)，緩慢攪拌，升溫至100100， 保溫保溫1515分鐘，迅速冷卻至分鐘，迅速冷卻至20202525，離心除去魚(yú)精蛋白等沉淀 物，獲得35L35L含熱變性含熱變性DNADNA的溶液，經(jīng)精確測(cè)定DNA含量后直接 可用于酶法降解酶法降解生產(chǎn)脫氧核苷酸。如要制成固體狀DNA，在熱 變性DNA溶液中逐漸加入等體積9595乙醇乙醇，離心可獲得纖維狀 DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗滌沉淀用乙醇、丙酮洗滌，減壓低溫干燥得DNA

10、粗品，產(chǎn)品 含熱變性含熱變性DNA50DNA506060。 工業(yè)用工業(yè)用DNADNA的提取的提取 提取提取 熱變性熱變性 沉淀沉淀乙醇乙醇 魚(yú)精魚(yú)精 提取液提取液 纖維狀纖維狀DNA 水、水、100 冷卻、離心冷卻、離心 70%-80% （無(wú)生物活性）（無(wú)生物活性） 15min 干燥干燥 粗品粗品DNA（熱變性后無(wú)活性）（熱變性后無(wú)活性） l 具有生物活性具有生物活性DNADNA的制備的制備 動(dòng)物內(nèi)臟（肝、脾、胸腺）加4 4倍重量生理鹽水倍重量生理鹽水經(jīng)組織搗組織搗 碎機(jī)碎機(jī)搗碎1分鐘，勻漿于2500rpm離心30分鐘，沉淀用同樣體 積的生理鹽水洗滌3次，每次洗后離心，將沉淀懸浮于20倍重 量

11、的冷生理鹽水中，再搗碎3分鐘，加入加入2 2倍量倍量5 5的（用的（用45%45%乙乙 醇作溶劑）十二烷基磺酸鈉醇作溶劑）十二烷基磺酸鈉，并攪拌23小時(shí)，在02500r pm離心，在上層液中加入等體積的冷冷9595乙醇乙醇，離心即可得到 纖維狀DNA，再用冷乙醇和丙酮洗滌，減壓低溫干燥得粗品DNA。 粗品DNA溶于適量蒸餾水，加入5 5十二烷基磺酸鈉十二烷基磺酸鈉達(dá)110體 積，攪拌攪拌1 1小時(shí)小時(shí)，經(jīng)5000rpm離心1小時(shí)，清液中加入加入NaClNaCl達(dá)達(dá) 1mol1molL L，再緩慢加入冷冷95%95%乙醇乙醇，DNA析出，經(jīng)乙醇、丙酮洗 滌，真空干燥得具有生物活性的DNA（活性（

12、活性DNADNA制備需在制備需在0 033 操作）。操作）。 l生物活性生物活性DNADNA的制備的制備 提取提取 洗滌洗滌3次次 5%SDS 動(dòng)物內(nèi)臟動(dòng)物內(nèi)臟 沉淀沉淀 沉淀沉淀 上層液上層液 （肝、脾）（肝、脾）生理鹽水生理鹽水 生理鹽水生理鹽水 再搗碎再搗碎 離心、離心、30min 沉淀沉淀 洗滌、干燥洗滌、干燥 提取提取 纖維狀纖維狀DNA 粗品粗品DNA 上清液上清液 95%乙醇乙醇 冷乙醇、丙酮冷乙醇、丙酮 水、水、5%SDS 離心離心 沉淀沉淀 洗滌、干燥洗滌、干燥 DNA沉淀沉淀 活性活性DNA NaCL、95%乙醇乙醇 乙醇、丙酮乙醇、丙酮 三、用酶解法、發(fā)酵法和半合成法制備

13、核苷酸三、用酶解法、發(fā)酵法和半合成法制備核苷酸 1 1、酶解法及堿水解法制備核苷酸、酶解法及堿水解法制備核苷酸 l 酶解法制備脫氧核苷酸酶解法制備脫氧核苷酸 桔青霉桔青霉產(chǎn)生5-5-磷酸二脂酶磷酸二脂酶 紅酵母紅酵母產(chǎn)生3-3-磷酸二脂酶磷酸二脂酶 l 酶解法制備戊糖核苷酸酶解法制備戊糖核苷酸 我國(guó)從60年代開(kāi)始使用核酸酶核酸酶P1P1降解核糖核酸生 產(chǎn)單核苷酸，日本年產(chǎn)呈味核苷酸呈味核苷酸（肌苷酸和鳥(niǎo)苷肌苷酸和鳥(niǎo)苷 酸酸）3000噸，其中60%是使用酶解法生產(chǎn)的。 酶解法生產(chǎn)酶解法生產(chǎn)55單核苷酸工藝流程單核苷酸工藝流程 l雙酶法生產(chǎn)肌苷酸和鳥(niǎo)苷酸（雙酶法生產(chǎn)肌苷酸和鳥(niǎo)苷酸（I IG G）

14、呈味核苷酸呈味核苷酸的主要品種是肌苷酸鈉和鳥(niǎo)苷酸鈉肌苷酸鈉和鳥(niǎo)苷酸鈉， 商品名簡(jiǎn)稱為（I IG G），用核酸酶核酸酶PlPl降解RNA可獲得 GMPGMP和和AMPAMP，其中AMP經(jīng)脫氨脫氨生成IMP。雙酶法生產(chǎn)（I 十G）工藝 。 l菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸 磷酸二酯酶磷酸二酯酶在合適的條件下降解細(xì)胞內(nèi)的RNA可產(chǎn)生5-5- 核苷酸核苷酸。在國(guó)內(nèi)用谷氨酸產(chǎn)生菌體自溶法生產(chǎn)5-核苷酸。 （1 1）菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸工藝流程：）菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸工藝流程： l 堿水解法生產(chǎn)堿水解法生產(chǎn)2 2，3 3- -混合核苷酸混合核苷酸 RNARNA結(jié)構(gòu)中的磷酸二酯鍵對(duì)于堿性條件不穩(wěn)定

15、，很容易結(jié)構(gòu)中的磷酸二酯鍵對(duì)于堿性條件不穩(wěn)定，很容易 生成生成22，3 3 - -環(huán)狀磷酸酯，此環(huán)狀磷酸酯對(duì)堿更不穩(wěn)定，環(huán)狀磷酸酯，此環(huán)狀磷酸酯對(duì)堿更不穩(wěn)定， 很易加水分解生成很易加水分解生成2 2，3 3- -混合核苷酸。混合核苷酸。取RNA配成3 3 3.5%3.5%的水溶液，加氫氧化鈉達(dá)0.3mol0.3molL L濃度，升溫至3838， 保溫保溫16162020小時(shí)小時(shí)，用6mol6molL L鹽酸中和至鹽酸中和至pH7.0pH7.0，從RNARNA水解成水解成 22，3 3- -核苷酸的降解率達(dá)核苷酸的降解率達(dá)9595以上以上，將22，3 3- -混合核混合核 苷酸制成每片含苷酸制成

16、每片含5050100mg100mg的片劑的片劑，經(jīng)臨床使用，對(duì)非特異性 血小板減少癥、對(duì)白血球減少癥、癌腫的化療和放療后的升 白血球均有較好療效。 l發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸 1 1、發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸（、發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸（IMPIMP） 肌苷酸鈉是一種高效增鮮劑，在谷氨酸鈉（味精）中肌苷酸鈉是一種高效增鮮劑，在谷氨酸鈉（味精）中 加加2%2%，鮮度可增加，鮮度可增加3 3倍。因此，在味精中添加肌苷酸鈉（或倍。因此，在味精中添加肌苷酸鈉（或 鳥(niǎo)苷酸鈉）后成為第二代特鮮味精。鳥(niǎo)苷酸鈉）后成為第二代特鮮味精。 產(chǎn)氨短桿菌嘌呤核苷酸生物合成途徑、代謝調(diào)控和肌產(chǎn)氨短桿菌嘌呤核苷酸生物合成途徑、代

17、謝調(diào)控和肌 苷酸發(fā)酵機(jī)制苷酸發(fā)酵機(jī)制: : 積累積累IMPIMP的主要前提：的主要前提： （1 1）阻斷）阻斷SAMPSAMP合成酶合成酶: : 即選育缺該酶的菌株（嘌呤缺陷型），發(fā)酵前期提供即選育缺該酶的菌株（嘌呤缺陷型），發(fā)酵前期提供 適量腺嘌呤，以滿足菌體生長(zhǎng)；適量腺嘌呤，以滿足菌體生長(zhǎng)； （2 2）保持）保持 PRA PRA 合成暢通，即后期沒(méi)有多余腺嘌呤阻遏該步合成暢通，即后期沒(méi)有多余腺嘌呤阻遏該步 反應(yīng)；反應(yīng)； （3 3）要使）要使IMPIMP滲出胞外，選育對(duì)滲出胞外，選育對(duì)MnMn+ +不敏感菌株；不敏感菌株； （4 4）生成的）生成的IMPIMP不被降解，恰好原菌株該酶活力低。

18、不被降解，恰好原菌株該酶活力低。 2 2、混合培養(yǎng)法發(fā)酵生產(chǎn)鳥(niǎo)苷酸（、混合培養(yǎng)法發(fā)酵生產(chǎn)鳥(niǎo)苷酸（GMPGMP）: : 直接發(fā)酵法生產(chǎn)直接發(fā)酵法生產(chǎn)GMPGMP必需滿足以下條件必需滿足以下條件 （1 1）解除）解除GMPGMP的反饋抑制（與的反饋抑制（與GMPGMP積累相勃）積累相勃）; ; （2 2）改變細(xì)胞對(duì)）改變細(xì)胞對(duì)GMPGMP的透性的透性; ; （3 3）不分解生成）不分解生成GMPGMP 只能先合成只能先合成XMPXMP，后轉(zhuǎn)化為，后轉(zhuǎn)化為GMPGMP： 方法如下：方法如下： 選育鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤缺陷型菌株，同時(shí)解除選育鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤缺陷型菌株，同時(shí)解除PRPPPRPP轉(zhuǎn)酰轉(zhuǎn)酰 胺酶及

19、胺酶及XMPXMP合成酶的阻遏，積累大量合成酶的阻遏，積累大量XMP(GMPXMP(GMP合成酶及合成酶及SAMPSAMP 合成酶缺失）。合成酶缺失）。 XMPXMP轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)化為GMPGMP菌株的條件菌株的條件: : (1)GMP (1)GMP不被分解不被分解 (2)GMP(2)GMP合成酶活力要強(qiáng)化合成酶活力要強(qiáng)化( (抗生素激動(dòng)劑抗生素激動(dòng)劑) ) (3) (3)增加細(xì)胞通透性增加細(xì)胞通透性 l 半合成法制備核苷酸半合成法制備核苷酸 由于發(fā)酵法生產(chǎn)核苷發(fā)酵法生產(chǎn)核苷的產(chǎn)率很高，核苷懸浮于磷酸三甲酯核苷懸浮于磷酸三甲酯 或磷酸三乙酯中，在冷卻條件下加入氯化氧磷，進(jìn)行磷酸化，或磷酸三乙酯中，在

20、冷卻條件下加入氯化氧磷，進(jìn)行磷酸化， 從核苷生成從核苷生成5-5-核苷酸收率可達(dá)核苷酸收率可達(dá)90%90%。 例一：肌苷例一：肌苷2mmol2mmolL L懸浮于懸浮于5ml5ml磷酸三乙酯中，溫度控制磷酸三乙酯中，溫度控制00， 添加氯化氧磷添加氯化氧磷6mmol6mmolL L，水，水2mmol2mmolL L，反應(yīng)，反應(yīng)2h2h，5 5-IMP-IMP摩爾摩爾 產(chǎn)率達(dá)產(chǎn)率達(dá)9191。 例二：鳥(niǎo)苷例二：鳥(niǎo)苷2mmol2mmolL L懸浮于懸浮于5ml5ml磷酸三甲酯中，溫度控制磷酸三甲酯中，溫度控制00， 添加氯化氧磷添加氯化氧磷6mmol6mmolL L，水，水2mmo/L2mmo/L，

21、反應(yīng)，反應(yīng)6h6h，5 5-GMP-GMP摩爾產(chǎn)摩爾產(chǎn) 率達(dá)率達(dá)90%90%。 四、核苷的制備四、核苷的制備 核苷是多種核苷類藥物的原料，在核酸類藥物中占主導(dǎo)地位。核苷是多種核苷類藥物的原料，在核酸類藥物中占主導(dǎo)地位。 （1 1）以核苷及其結(jié)構(gòu)類似物、衍生物為主藥物多達(dá)幾十種；）以核苷及其結(jié)構(gòu)類似物、衍生物為主藥物多達(dá)幾十種； （2 2）核苷類藥物在抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫方面占重要地位；）核苷類藥物在抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫方面占重要地位； （3 3）核苷的發(fā)酵水平大大高于核苷酸，所以常做后者的前體物）核苷的發(fā)酵水平大大高于核苷酸，所以常做后者的前體物 質(zhì)。質(zhì)。 1 1、RNARNA化學(xué)水解

22、法制備核苷化學(xué)水解法制備核苷： 2 2、發(fā)酵法生產(chǎn)核苷、發(fā)酵法生產(chǎn)核苷 產(chǎn)率高、周期短、控制容易、產(chǎn)量大。產(chǎn)率高、周期短、控制容易、產(chǎn)量大。 共同特點(diǎn)：共同特點(diǎn)： （1 1）使用磷酸單酯酶活力很強(qiáng)的枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿）使用磷酸單酯酶活力很強(qiáng)的枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿 菌為誘變出發(fā)菌株；菌為誘變出發(fā)菌株； （2 2）具有特定標(biāo)記的有變株；）具有特定標(biāo)記的有變株； （3 3）發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)需提供限量生長(zhǎng)因素。）發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)需提供限量生長(zhǎng)因素。 原菌株：原菌株： （1 1）AMPAMP強(qiáng)烈抑制強(qiáng)烈抑制PRPPPRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的活性，控制總代謝途徑；轉(zhuǎn)酰胺酶的活性，控制總代謝途徑； （2 2）AMPA

23、MP抑制抑制SAMPSAMP合成酶；合成酶； （3 3）GMPGMP抑制抑制IMPIMP脫氫酶脫氫酶 生產(chǎn)菌株：生產(chǎn)菌株： （1 1）酶）酶6 6、7 7缺失（為腺嘌呤缺陷型）積累缺失（為腺嘌呤缺陷型）積累IMP-IMP-肌肌 苷（肝炎輔助藥）；苷（肝炎輔助藥）； （2 2）酶）酶4 4缺失（為鳥(niǎo)嘌呤缺陷型）積累缺失（為鳥(niǎo)嘌呤缺陷型）積累XMP-XMP-黃苷；黃苷； （3 3）酶）酶5 5缺失積累鳥(niǎo)苷。缺失積累鳥(niǎo)苷。 發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷 （1 1）肌苷生產(chǎn)工藝）肌苷生產(chǎn)工藝 （2 2）發(fā)酵工藝條件：）發(fā)酵工藝條件： 碳源為葡萄糖碳源為葡萄糖 保證充足的氮源保證充足的氮源 磷酸鹽的影響

24、磷酸鹽的影響 Mg+Mg+、Ca+Ca+有促進(jìn)作用有促進(jìn)作用 生長(zhǎng)因子腺嘌呤或酵母粉要亞適量生長(zhǎng)因子腺嘌呤或酵母粉要亞適量 最適發(fā)酵溫度為最適發(fā)酵溫度為30-3430-34，pH6.06.2pH6.06.2 需大風(fēng)量需大風(fēng)量, ,高溶氧和低高溶氧和低COCO2 2 發(fā)酵法生產(chǎn)鳥(niǎo)苷和黃苷發(fā)酵法生產(chǎn)鳥(niǎo)苷和黃苷 鳥(niǎo)苷產(chǎn)生菌的特征：鳥(niǎo)苷產(chǎn)生菌的特征： （1 1）嘌呤核苷酸分解酶活力強(qiáng)；）嘌呤核苷酸分解酶活力強(qiáng)； （2 2）SAMPSAMP合成酶，合成酶，GMPGMP還原酶缺失；還原酶缺失； （3 3）解除）解除AMPAMP、GMPGMP對(duì)對(duì)PRPPPRPP轉(zhuǎn)酰胺酶，肌苷酸脫氫酶轉(zhuǎn)酰胺酶，肌苷酸脫氫酶

25、和和GMPGMP合成酶的反饋抑制；合成酶的反饋抑制； 發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷 以肌苷生產(chǎn)菌（枯草桿菌）為誘變基礎(chǔ)菌株。以肌苷生產(chǎn)菌（枯草桿菌）為誘變基礎(chǔ)菌株。 誘變結(jié)果：誘變結(jié)果： （1 1）腺嘌呤回復(fù)，腺嘌呤酶缺失；）腺嘌呤回復(fù)，腺嘌呤酶缺失； （2 2）黃嘌呤缺陷型，）黃嘌呤缺陷型，GMPGMP還原酶缺失；還原酶缺失； （3 3）抗）抗8 8雜氮黃嘌呤解除對(duì)雜氮黃嘌呤解除對(duì)PRPPPRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的抑制；轉(zhuǎn)酰胺酶的抑制； （4 4）發(fā)酵不穩(wěn)定的原因：黃嘌呤缺陷及腺嘌呤酶缺失與回復(fù)）發(fā)酵不穩(wěn)定的原因：黃嘌呤缺陷及腺嘌呤酶缺失與回復(fù) （菌種傳代中）。（菌種傳代中）。 第三節(jié)第三節(jié) 核酸與

26、核苷類藥物的制備舉例核酸與核苷類藥物的制備舉例 （一）疊氮胸苷（一）疊氮胸苷（AzidothymidineAzidothymidine，AZTAZT） 1 1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與性質(zhì) AZT是1987美國(guó)FDA批準(zhǔn)的治療艾滋病艾滋病的新藥 。AZT的藥 理作用是人體內(nèi)經(jīng)磷酸化磷酸化后生成了3-疊氮-2-脫氧胸腺嘧 啶核苷酸，后者取代了正常的胸腺嘧啶核苷酸參與病毒取代了正常的胸腺嘧啶核苷酸參與病毒DNADNA的的 合成，含有合成，含有AZTAZT成份的成份的DNADNA不能繼續(xù)復(fù)制，從而達(dá)到阻止病毒不能繼續(xù)復(fù)制，從而達(dá)到阻止病毒 增殖的目的增殖的目的。 2 2、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)工藝 此合成路線的起

27、始原料是胸苷原料是胸苷，目前主要是從DNADNA水解水解 法法制備，由于原料來(lái)源少，合成路線較復(fù)雜，成本很高。 已見(jiàn)報(bào)道的胸苷合成方法還有兩條途徑：已見(jiàn)報(bào)道的胸苷合成方法還有兩條途徑： 從2-脫氧胞苷或2-脫氧鳥(niǎo)苷或2-脫氧腺苷與胸腺胸腺 嘧啶嘧啶反應(yīng)，經(jīng)大腸桿菌產(chǎn)生的磷酸化酶磷酸化酶催化生成胸苷胸苷。 從鳥(niǎo)苷（300mmolL）與胸腺嘧啶（300mmolL）反 應(yīng)，在歐文氏菌AJZ992所產(chǎn)生的嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷嘧啶核苷 磷酸化酶磷酸化酶的催化下生成5-甲基尿苷，然后經(jīng)化學(xué)法合成胸苷。 （二）阿糖腺苷（二）阿糖腺苷（Adenine arabinosideAdenine

28、 arabinoside） 1 1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 阿糖腺苷阿糖腺苷的化學(xué)名稱為9-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或 稱腺嘌呤阿拉伯糖苷腺嘌呤阿拉伯糖苷。 早在1960年就在實(shí)驗(yàn)室合成了阿糖腺苷，1969年美國(guó)用 Streptomyces antibioticus NRRL3238菌株，1972年日本用 Streptomyces hebacecus 4334菌株發(fā)酵法分別制備了阿糖發(fā)酵法分別制備了阿糖 腺苷腺苷。 1979年用從EColi中分離得到的尿嘧啶磷酸化酶尿嘧啶磷酸化酶和嘌呤嘌呤 核苷磷酸化酶核苷磷酸化酶，以固相酶固相酶的方法將阿糖脲苷轉(zhuǎn)化為阿糖腺苷將阿糖脲苷轉(zhuǎn)化為阿糖腺苷。 2 2

29、、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)工藝 l 酶酶- -化學(xué)合成法化學(xué)合成法 最新的阿糖腺苷阿糖腺苷的合成法是酶酶- -化學(xué)合成法化學(xué)合成法：用尿苷用尿苷為原 料經(jīng)氧氯化磷氧氯化磷和二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺反應(yīng)，生成氧橋化合物氧橋化合物，在堿 性水溶液中水解成阿糖尿苷，然后利用阿糖尿苷中的阿拉伯阿拉伯 糖糖經(jīng)酶法酶法轉(zhuǎn)化成阿糖腺苷阿糖腺苷。 經(jīng)選育從阿糖尿苷酶法合成阿糖腺苷的優(yōu)秀菌株是產(chǎn)氣產(chǎn)氣 腸桿菌腸桿菌（Enterbacteraerogens），這株菌能產(chǎn)生尿苷磷酸化尿苷磷酸化 酶酶（Upase）和嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶（Pynpase），用這個(gè)菌株 的休止細(xì)胞休止細(xì)胞作為酶源，從阿糖尿苷和腺嘌呤能

30、高效地合成阿 糖腺苷，菌體也可制成固定化細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)。 l以以5-AMP5-AMP為原料的化學(xué)合成為原料的化學(xué)合成 3 3、作用與用途、作用與用途 阿糖腺苷阿糖腺苷是近年來(lái)引人注目的廣譜廣譜DNADNA病毒抑制劑病毒抑制劑，對(duì)單 純皰疹皰疹、型，帶狀皰疹，巨細(xì)，牛痘等型，帶狀皰疹，巨細(xì)，牛痘等DNADNA病毒，在體內(nèi)病毒，在體內(nèi) 外都有明顯抑制作用外都有明顯抑制作用。目前認(rèn)為，阿糖腺苷是治療單純皰疹 腦炎最好的抗病毒藥物。 阿糖腺苷在體內(nèi)受激酶作用生成的阿糖腺三磷，是脫氧阿糖腺三磷，是脫氧 腺三磷（腺三磷（dATPdATP）的拮抗物）的拮抗物，從而阻抑了以從而阻抑了以dATPdATP為底物

31、的病毒為底物的病毒 DNADNA聚合酶的活力聚合酶的活力。而且阿糖腺三磷對(duì)于病毒DNA聚合酶的親 和性比宿主細(xì)胞的同一個(gè)酶的親和性高。因此這個(gè)藥物對(duì)于 抑制病毒具有較高選擇性。 （三）三氮唑核苷三）三氮唑核苷 1 1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 三氮唑核苷商品名病毒唑病毒唑，對(duì)DNA病毒，RNA病毒都有廣泛 作用。本品為白色結(jié)晶，熔點(diǎn)174176，易溶于水。 這個(gè)化合物經(jīng)X X線解析線解析，它的立體結(jié)構(gòu)與腺苷、鳥(niǎo)苷非常 類似，在體內(nèi)被磷酸化成三氮唑核苷酸在體內(nèi)被磷酸化成三氮唑核苷酸，抑制肌苷酸脫氫酶 阻斷鳥(niǎo)苷酸的生物合成阻斷鳥(niǎo)苷酸的生物合成，從而抑制病毒DNA合成。它的另一特 點(diǎn)是對(duì)病毒作用點(diǎn)多，

32、不易使病毒產(chǎn)生抗藥性。 2 2、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)工藝 酶合成法酶合成法 使用產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌，以（尿苷尿苷）肌苷和肌苷和TCATCA為底 物可以用酶法簡(jiǎn)易地合成三氮唑核苷。 采用前段與后段由兩個(gè)不同的酶催化，即前段使用嘧啶核嘧啶核 苷磷酸化酶苷磷酸化酶，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶。 （四）阿糖胞苷（四）阿糖胞苷（CytarabineCytarabine，Cytosine arabinosideCytosine arabinoside， Arabinosyl CytosineArabinosyl Cytosine，AracytidineAracytidine） 1 1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

33、、結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 阿糖胞苷阿糖胞苷又稱胞嘧啶阿拉伯糖苷胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的組成部分是阿拉阿拉 伯糖伯糖。白色或類自色結(jié)晶性粉末，無(wú)臭，易溶于水，略溶于 甲醇、乙醇中，乙醚中極微溶。 阿糖胞苷進(jìn)入體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榘⑻前账?，抑制DNA聚合酶， 阻止胞二磷轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗醢讖亩种谱柚拱邹D(zhuǎn)變?yōu)槊撗醢讖亩种艱NADNA的合成的合成，干擾DNA 病毒繁殖和腫瘤細(xì)胞增殖。只能注射只能注射。 2 2、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)工藝 l以以5 5CMPCMP為原料的合成法為原料的合成法 （1 1）工藝路線：）工藝路線： （2 2）工藝過(guò)程：）工藝過(guò)程： 水解水解：并加入處理好的6.5L 氫氧化鑭凝膠，總體積為7.5L，

34、 升溫至90，在不斷攪拌下，于pH9下進(jìn)行水解。在不同的反 應(yīng)時(shí)間內(nèi)，均勻取出2mL凝膠溶液，離心分離，取上清液5至 10l，pH9.2電泳分析，檢查水解程度。 氧橋化氧橋化：氧橋化后總OD光譜高峰位置移至264nm（pH2） 氨解氨解：使氧橋斷裂3，5-乙?；撀?。 成鹽成鹽： 2鹽酸-甲醇 l 以葡萄糖酸鈣為原料的合成路線以葡萄糖酸鈣為原料的合成路線 （五）聚肌胞苷酸（聚肌胞（五）聚肌胞苷酸（聚肌胞）（）（PoyinosinicPoyinosinic， Polycytidylic AcidPolycytidylic Acid，Poly1Poly1：C C） 1 1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

35、 1967年美國(guó)人Field發(fā)現(xiàn)聚肌胞聚肌胞是干擾素誘導(dǎo)物干擾素誘導(dǎo)物，而且具 有廣譜抗病毒作用。本品是人工合成的干擾素誘導(dǎo)劑人工合成的干擾素誘導(dǎo)劑，系由 多聚肌苷酸和多聚胞苷酸組成的雙股多聚核苷酸。本品可溶溶 于于0.850.85氯化鈉氯化鈉溶液。 2 2、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)工藝 70年代中期我國(guó)開(kāi)始研制聚肌胞，其生產(chǎn)工藝如下： l 底物底物5-5-核苷二磷酸吡啶鹽的制備核苷二磷酸吡啶鹽的制備 （3）固定化多核苷酸磷酸化酶多核苷酸磷酸化酶，將分離純化的酶液滴加入冰 浴中的載體，得到共價(jià)結(jié)合的固定化多核苷酸磷酸化。 3 3、Poly IPoly I：C C制備制備 （1 1）底物預(yù)處理：）底物預(yù)處

36、理：CDPCDP吡啶鹽轉(zhuǎn)成鋰鹽，吡啶鹽轉(zhuǎn)成鋰鹽，IDPIDP轉(zhuǎn)成鈉鹽。轉(zhuǎn)成鈉鹽。 （2 2）酶促反應(yīng)：）酶促反應(yīng)： （每毫升反應(yīng)液含（每毫升反應(yīng)液含molmolL L數(shù)）數(shù)）IDPIDP或或 CDP 15CDP 15；Tris 150Tris 150；MgC1MgC12 26 6；EDTA 1EDTA 1；聚合酶；聚合酶5 5單位，單位， pH9.0pH9.0，3737，3 34 4小時(shí)。用鹽酸調(diào)小時(shí)。用鹽酸調(diào)pH1.5pH1.52.02.0，使，使 PolyIPolyI（或（或Poly CPoly C）沉淀，立即離心。此后在磷酸液沖液）沉淀，立即離心。此后在磷酸液沖液 中溶解，等摩爾中溶解，

37、等摩爾Poly IPoly I與與Poly CPoly C混合，生成產(chǎn)品混合，生成產(chǎn)品 。 3 3、作用與用途、作用與用途 本品具有抗病毒，抗腫瘤，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞免疫功能和抑本品具有抗病毒，抗腫瘤，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞免疫功能和抑 制核酸代謝等作用制核酸代謝等作用。本品注入人體誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素。誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素。 臨床已試用于腫瘤、血液病、病毒性肝炎及痘類毒性感 染等多種疾患。 l 胞二磷膽堿（胞二磷膽堿（CDP-CDP-膽堿）膽堿） 1 1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 胞二磷膽堿其化學(xué)名稱為胞嘧啶核苷-5-二磷酸膽堿 鈉鹽本品為白色無(wú)定形粉末，易吸濕易吸濕，易溶于水，幾不溶于易溶于水，幾不溶于 乙醇、氯仿、丙酮等多數(shù)有機(jī)溶劑乙醇、氯仿、丙酮等多數(shù)有機(jī)溶劑。1水溶液pH2.53.5， 注射液pH7.0。 2 2、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)工藝 l 酶合成法酶合成法 胞二磷膽堿由微生物菌體所提供