免疫學(xué)基礎(chǔ)：第五章 噬菌體展示技術(shù)及其應(yīng)用

1、2021-7-171 Phage display 噬菌體展示技術(shù)及其應(yīng)用 2021-7-172 噬菌體展示技術(shù)是將 各種多肽或蛋白質(zhì)以融合 蛋白的形式表達(dá)并展示在 噬菌體表面，同時(shí)將其遺 傳密碼包含于噬菌體內(nèi)部， 這使得蛋白質(zhì)的功能與其 基因密碼有機(jī)的連結(jié)在一 起。 2021-7-173 非展示系統(tǒng) 展示系統(tǒng) 2021-7-174 The expression of exogenous peptides on the surface of filamentous bacteriophage was initially described by Smith in 1985. Since his

2、first study, different molecules such as small peptides and antibodies have been displayed on coat proteins of phage, greatly expanding the applications of the technology. The past decade has seen considerable progress in the techniques and applications of phage libraries. In addition, different scr

3、eening methods have allowed isolation and characterization of peptides binding to several molecules in vitro, in the context of living cells, in animals and in humans. 2021-7-175 - In vivo use of phage libraries. Initially the phage library is injected in the circulation. Next, phage is allowed to c

4、irculate for minutes or hours (in this case when internalized phages are to be recovered). Finally, after deep anesthesia, mice are euthanized and the organs are dissected for phage recovery and peptide sequencing. 2021-7-176 Phage structure. PIII, pVI, pVII, pVIII and pXIX represent phage proteins.

5、 Exogenous peptides are expressed or “displayed” usually on pIII or pVIII. 2021-7-177 三三 絲狀噬菌體的生物學(xué)絲狀噬菌體的生物學(xué) 形態(tài)：長桿狀，長度約形態(tài)：長桿狀，長度約1 um，管直徑約，管直徑約6nm。 基因組：約基因組：約6400核苷酸大小的單鏈線狀核苷酸大小的單鏈線狀DNA， 結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：2700個(gè)主要蛋白（個(gè)主要蛋白（PVIII）分子螺旋狀排列形成長管，）分子螺旋狀排列形成長管， 一頭一頭5個(gè)拷貝的次要?dú)さ鞍讉€(gè)拷貝的次要?dú)さ鞍譖III和和PVI， 另一頭則由次要?dú)さ鞍琢硪活^則由次要?dú)さ鞍譖VII和和

6、PIX。 生理：生理：F菌毛結(jié)合的序列是菌毛結(jié)合的序列是PIII蛋白蛋白N端的端的200個(gè)氨基酸。個(gè)氨基酸。 一個(gè)分裂周期中可生產(chǎn)幾百個(gè)子代，一個(gè)分裂周期中可生產(chǎn)幾百個(gè)子代， 其產(chǎn)量可達(dá)到其產(chǎn)量可達(dá)到0.3mg/ml。 2021-7-178 外源蛋白的展示部位外源蛋白的展示部位 2021-7-179 噬菌體展示技術(shù)所展示外源多肽和及文庫噬菌體展示技術(shù)所展示外源多肽和及文庫 1. 隨機(jī)肽庫隨機(jī)肽庫 l 隨機(jī)肽庫通常較短（隨機(jī)肽庫通常較短（436氨基酸氨基酸8,9長度）長度） l 編碼它們的核酸由化學(xué)法合成而得編碼它們的核酸由化學(xué)法合成而得 l 其展示方式包括其展示方式包括3，33，3+3，8，8

7、8，8+8等等 2. 基因文庫基因文庫 l 基因組文庫如基因組文庫如DNA staphylococcus aurous l cDNA文庫文庫 l 抗體庫抗體庫 l 病毒病毒cDNA 3. 各種自然蛋白及蛋白片段等各種自然蛋白及蛋白片段等 其中包括其中包括 - -半乳糖苷酶等蛋白片段；酶類如堿性磷酸酶，胰酶等；激素半乳糖苷酶等蛋白片段；酶類如堿性磷酸酶，胰酶等；激素 類如人生長素，血管緊張激素等；酶抑制劑如牛胰蛋白酶抑制劑等；毒類如人生長素，血管緊張激素等；酶抑制劑如牛胰蛋白酶抑制劑等；毒 素如蓖麻毒蛋白素如蓖麻毒蛋白B B鏈等；受體如鏈等；受體如IgEIgE受體受體 亞單位、亞單位、T T細(xì)胞

8、受體等；觸體如細(xì)胞受體等；觸體如P P 物質(zhì)、神經(jīng)激肽物質(zhì)、神經(jīng)激肽A A和和B B等；抗原及抗原表位；等；抗原及抗原表位；DNADNA和和RNARNA結(jié)合蛋白如鋅指蛋結(jié)合蛋白如鋅指蛋 白等；酶底物如蛋白酶底物等；細(xì)胞素如白等；酶底物如蛋白酶底物等；細(xì)胞素如IL3IL3，IL6IL6等。等。 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 博士論文答辯 2021-7-1710 抗體庫技術(shù)簡單流程 2021-7-1711 獲得抗體基因 2021-7-1712 插入載體 2021-7-1713 2021-7-1714 表達(dá) 2021-7-1715 篩選 2021-7-1716 2021-7-1717 噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展簡史 1

9、985年Smith 證實(shí)噬菌體fd基因組能通過基 因工程的手段進(jìn)行改造1。 1988年P(guān)armley 將已知抗原決定簇與噬菌體 P N端融合呈現(xiàn)在其表面2。 1990年McCafferty 用噬菌體展示技術(shù)篩選溶 菌酶的單鏈抗體成功使噬菌體展示技術(shù)進(jìn)入一 個(gè)廣泛應(yīng)用的時(shí)代3。 一系列噬菌體文庫的構(gòu)建噬菌體展示技術(shù)煥 發(fā)出了新的生命力。 2021-7-1718 噬菌體定義：噬菌體定義：是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體 等微生物的病毒。 噬菌體宿主菌形態(tài)核酸 T1-T7、N4大腸埃希菌蝌蚪形dsDNA，線狀 P1志賀菌蝌蚪形dsDNA，線狀 P22沙門菌蝌蚪形dsDNA，線狀 SP01、SP82枯

10、草芽胞桿菌蝌蚪形dsDNA，線狀 29解淀粉芽胞桿菌蝌蚪形dsDNA，線狀 PM2假單胞菌微球形，有包膜dsDNA，線狀 X174、S13、 M12、G4 大腸埃希菌微球形ssDNA，線狀 f1、fd、M13大腸埃希菌絲形ssDNA，線狀 MS2、f2、fr、Q大腸埃希菌微球形ssRNA，線狀 6假單胞菌微球形，有包膜 dsRNA，線狀，分 成3節(jié)段 噬菌體分類：噬菌體分類： 2021-7-1719 絲狀噬菌體絲狀噬菌體 蝌蚪形噬菌體蝌蚪形噬菌體 噬菌體、噬菌體、T4噬菌體、噬菌體、T7噬菌體噬菌體M13噬菌體噬菌體 2021-7-1720 T7與M13相比優(yōu)勢明顯 T7SelectT7Sel

11、ect的優(yōu)勢的優(yōu)勢解釋 是在細(xì)胞質(zhì)中表是在細(xì)胞質(zhì)中表 達(dá)的裂解性噬菌達(dá)的裂解性噬菌 體體 與M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白無需分泌。 C-C-端融合端融合插入序列被克隆到T7Select載體基因10 的C-端，可以使帶有終止密碼子的 插入子得以表達(dá)和展示。 載體克隆容量大載體克隆容量大T7載體比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1 kbp的片段都不穩(wěn)定。 插入片段穩(wěn)定插入片段穩(wěn)定 T7重組子很穩(wěn)定，而M13重組子 尤其是1 kb的很不穩(wěn)定 洗提條件靈活洗提條件靈活M13穩(wěn)定性尚可，但是洗提條件頗受限制，SDS、鹽、離液劑等，都能造成 不穩(wěn)定。而T7在1% SDS，5 M Na

12、Cl，4 M尿素，2 M鹽酸胍，10 mM EDTA, 100 mM DTT，pH 4-10等條件下穩(wěn)定。 生長迅速生長迅速( (小于小于3 3 小時(shí)小時(shí)) )，噬斑大，噬斑大 明顯縮短富集過程，每輪親和淘洗之間時(shí)間少，2天內(nèi)即可完成標(biāo)準(zhǔn)淘洗 包裝效率極高包裝效率極高 (10(109 9 pfu/ug) pfu/ug) 操作很簡便，只需將DNA加到抽提物中，放置并鋪板。 克隆效率高克隆效率高M(jìn)13要用電轉(zhuǎn)化方能獲得高效克隆，而T7Select制備大文庫則容易得多 2021-7-1721 噬菌體cDNA展示技術(shù) 以改構(gòu)的噬菌體為載體， cDNA基因片段定向插入 噬菌體外殼蛋白基因區(qū)， 使外源蛋白

13、表達(dá)并展示 于噬菌體表面， 通過親和富集法篩選 表達(dá)有特異蛋白質(zhì)的噬菌體。 2021-7-1722 噬菌體展示系統(tǒng)的類型 產(chǎn)品概況產(chǎn)品概況 載體用途展示拷貝數(shù)/噬菌體展示大小(氨基酸)宿主 T7Select415-1多肽41540 50 aaBL21 T7Select1-1 *蛋白或多肽11200aaBLT5403 或 5615 T7Select1-2 a, b & c蛋白或多肽1900aaBLT5403 或5615 T7Select10-3b*蛋白或多肽約為10564 * (上限待定)BLT5403 或5615 2021-7-1723 噬菌體cDNA展示技術(shù)的應(yīng)用 1 用于模擬表位的研究。

14、2 用于DNA、RNA結(jié)合蛋白的研究。 3 用于蛋白-蛋白相互作用的研究。 4 用于非蛋白小分子與蛋白相互作用的研 究。 5 細(xì)胞與蛋白相互作用的研究。 6 酶作用底物的分析、先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)、 定位信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等。 2021-7-1724 2021-7-1725 問題 1. 沒有一個(gè)系統(tǒng)能夠表達(dá)所有的真核細(xì) 胞蛋白。 2. 在外源cDNA插入噬菌體載體時(shí)存在雙 向插入，可能導(dǎo)致表達(dá)減少或者逆向表 達(dá)。 2021-7-1726 展望 噬菌體cDNA展示技術(shù)有效地實(shí)現(xiàn)了 基因型和表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)換，在分子克隆的 基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)構(gòu)想的體外控制， 從而可獲得具有生物學(xué)活性的表達(dá)產(chǎn)物。 若將其與蛋白質(zhì)三

15、維結(jié)構(gòu)預(yù)測、分子模 擬技術(shù)完美融合，對(duì)分子相互作用、分 子識(shí)別、受體識(shí)別、酶學(xué)機(jī)制等研究進(jìn) 程將起到極大的推動(dòng)作用。 2021-7-1727 應(yīng)用舉例： 以下是我做過的部分工作。 2021-7-1728 一、半合成噬菌體抗體庫的構(gòu)建 構(gòu)建一個(gè)半合成抗體庫，不經(jīng)免疫制備人源抗Tie2 Fab抗體。通過RT-PCR方法，從人臍帶血淋巴細(xì)胞總 RNA 擴(kuò)增輕鏈基因及重鏈VH段基因，將輕鏈基因插 入pCOMb3載體中，得人輕鏈質(zhì)粒庫；從乙肝表面抗 體（HBsAb）的Fd段基因制備含有不同長度隨機(jī)化 CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后將VH段基因與隨 機(jī)化的CDR3融合，得到Fd基因片段，

16、再將其插入輕鏈 質(zhì)粒庫中，得半合成人Fab質(zhì)粒庫。 2021-7-1729 材料和方法 人臍帶血淋巴細(xì)胞 Ficollpaque plus購自Pharmacia公司。 Trizol試劑購自Invitrogen 公司。 pComb3噬菌體抗體表達(dá)載體：4029bp，含有可插入輕 鏈和重鏈基因的克隆位點(diǎn)。 大腸桿菌XLl-blue 輔助病毒VCSM13 2021-7-1730 cDNA制備 引物設(shè)計(jì) 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備 輔助噬菌體的制備 抗體庫制備 2021-7-1731 結(jié)果 PCR擴(kuò)增人抗體基因擴(kuò)增人抗體基因 圖3.1 鏈PCR擴(kuò)增結(jié)果 1-6泳道：VL1, VL2, VL3, VL4, VL

17、5, VL6 M：Marker DL2,000 圖3.2 鏈PCR擴(kuò)增結(jié)果 11-3泳道：VK1, VK2, VK3 M：Marker DL2,000 2021-7-1732 圖3.3 重鏈分段PCR擴(kuò)增結(jié)果 13泳道：H135，H2，H4(約290bp) 47泳道：CDR3-5, CDR3-8, CDR3-10, CDR3-12(約400bp) M：Marker DL2,000 2021-7-1733 圖3.4 重鏈重疊PCR擴(kuò)增結(jié)果 13泳道： CDR3-5+(H135，H2，H4) 融合結(jié)果 46泳道： CDR3-8+(H135，H2，H4) 融合結(jié)果 79泳道： CDR3-10+(H1

18、35，H2，H4) 融合結(jié)果 1012泳道：CDR3-12+(H135，H2，H4) 融合結(jié)果 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 M 2021-7-1734 圖3.5輕鏈和重鏈插入pComb3 流程 H L 2021-7-1735 人源輕鏈抗體文庫的構(gòu)建人源輕鏈抗體文庫的構(gòu)建 經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacI和XbaI 雙酶切的人抗體輕鏈 PCR產(chǎn)物與用相同內(nèi)切酶酶切、去磷酸化的pComb3載 體，16連接，用該連接產(chǎn)物進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，根據(jù)1l和 10l菌液鋪平板所長出來的菌落數(shù)，可推算出人抗體 輕鏈文庫的庫容量。 鏈文庫的容量為5.0310 6,鏈文庫的容量為 6.8106(多次建

19、庫混合后的庫容量)。 從平板上隨機(jī)挑取10個(gè)菌落，涂格，過夜培養(yǎng)，菌 落PCR鑒定。對(duì)于鏈文庫，10個(gè)克隆中有6個(gè)陽性， 鏈文庫的插入率大約為60；鏈文庫10個(gè)克隆中 有7個(gè)是陽性，其插入率大約為70。 2021-7-1736 人源噬菌體人源噬菌體Fab抗體半合成文庫的構(gòu)建抗體半合成文庫的構(gòu)建 將酶切純化的重鏈重疊PCR產(chǎn)物插入經(jīng)酶 切、并切膠回收純化的輕鏈抗體文庫中，轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細(xì)胞，在輔助噬菌體VCSM13的超感染 下，繁殖出表達(dá)人抗體Fab段的噬菌體，即為 抗體組合文庫。1l和10l轉(zhuǎn)化菌鋪平板計(jì)數(shù)， 計(jì)算出Fd（包括CDR3-5到CDR3-12的全部 隨機(jī)化Fd片段）文庫的庫容為5.8

20、9106。隨機(jī) 挑取10個(gè)菌落，涂格，過夜培養(yǎng)后菌落PCR： 其中6個(gè)克隆中有輕鏈也有重鏈。雙鏈插入率 為60左右。 2021-7-1737 以相同的程序構(gòu)建Fd鏈抗體庫，庫容量 為6.55106, 隨機(jī)挑取10個(gè)菌落，涂格，過夜 培養(yǎng)后菌落PCR：其中有5個(gè)克隆擴(kuò)增出輕鏈 和重鏈片段。雙鏈插入率為50左右。 為了提高抗體庫的庫容量，在增加細(xì)菌轉(zhuǎn)化 效率的同時(shí)，進(jìn)行了多次轉(zhuǎn)化，每次轉(zhuǎn)化都計(jì) 算插入率。結(jié)果如表所示。 2021-7-1738 表3.1抗體庫的庫容與抗體片段插入率 ND ：未做 2021-7-1739 混合抗體庫的鑒定混合抗體庫的鑒定 將所構(gòu)建的各種Fab抗體庫混合成為最終 的人源

21、噬菌體抗體庫，理論庫容為1.97107 實(shí) 際的噬菌體抗體庫滴度為3.91014cfu/ml。隨 機(jī)挑取10個(gè)菌落進(jìn)行PCR，.電泳觀察,雙鏈陽 性有5個(gè)(圖3.6),單鏈（輕鏈或者重鏈）陽性有 4個(gè),空載體1個(gè), Fab陽性率為50左右。 2021-7-1740 圖3.6半合成抗體庫Fab重組克隆的PCR鑒定 其中1，2，4，5，8五個(gè)克隆為輕重鏈雙陽性克隆 M 1L 1H 2L 2H 3L 3H 4L 4H M 5L 5H 6L 6H 7L 7H 8L 8H 2021-7-1741 討論 本研究采取構(gòu)建半合成抗體庫的方法，以 胎兒臍帶血為材料，將基因組的VH段與人工合 成的CDR3（共4組

22、）拼接，在體外進(jìn)行V-D- J 重排，構(gòu)建Fd段基因庫，再與來自胎兒臍帶血 的輕鏈基因庫組合?，F(xiàn)已明確人類基因組中有 約50個(gè)VH基因，分7個(gè)亞群，第6和第7個(gè)亞群僅 各有一個(gè)基因。我們設(shè)計(jì)了三種VH基因 5端引 物，其中可擴(kuò)增出第1,3,5亞群，H2擴(kuò)增第2亞 群，H4擴(kuò)增第4亞群，第6,7亞群因基因數(shù)量少 未設(shè)計(jì)專門引物，但也可分別由 H135和H4擴(kuò) 增。 2021-7-1742 在進(jìn)行CDR3隨機(jī)化的過程中，進(jìn)行重疊PCR 時(shí)難免會(huì)有錯(cuò)誤。故在完成Fd鏈的融合后，對(duì) Fd基因進(jìn)行了檢測，將產(chǎn)物克隆到T載體中， 測定了5個(gè)克隆。發(fā)現(xiàn)有2個(gè)克隆在重疊區(qū)提前 出現(xiàn)了終止密碼子或者缺失D區(qū)，另

23、外3個(gè)正常， 分別屬于VH1,VH2,VH4基因家族 2021-7-1743 為了增加抗體基因的豐度，在試驗(yàn)過程 中提取淋巴細(xì)胞總RNA，可以避免提取 mRNA時(shí)容易降解和丟失目的基因。 獲得的抗體基因需要多次酶切、連接、 轉(zhuǎn)化等步驟，所以在這些過程中要盡量 提高連接效率：可采取分步雙酶切，保 證切割完全，檢測連接效率。 2021-7-1744 實(shí)驗(yàn)過程中，克隆的抗體基因在細(xì)菌的培 養(yǎng)過程中會(huì)有丟失現(xiàn)象發(fā)生，雙鏈陽性率會(huì)由 轉(zhuǎn)化時(shí)的60左右變成50左右，與前人報(bào)告 的情況一致?？赡茉蛴校簬в休p重鏈基因的 克隆在細(xì)菌生長過程中發(fā)生缺失突變、帶有抗 體基因的克隆生長緩慢、輔助噬菌體CP-III蛋

24、 白與FabCPIII蛋白競爭進(jìn)入噬菌體過程中部 分噬菌體沒有FabCPIII蛋白包裝在表面。 2021-7-1745 二 從噬菌體抗體庫中篩選抗Tie2抗體 以Tie2為靶標(biāo)，對(duì)已經(jīng)建好的半合 成噬菌體抗體庫進(jìn)行3輪的吸附、洗脫、 擴(kuò)增的篩選，獲得2株能夠同Tie2抗原特 異性反應(yīng)的Fab噬菌體抗體。 2021-7-1746 材料與方法 材料 抗原抗原 Tie2-Fc，Ang1 (購自A &B System公司) 對(duì)照抗原：對(duì)照抗原：BSA 購自Sigma公司 丙型肝炎病毒NS5表面抗原(本室表達(dá)) IgG1標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）。 抗體抗體： HRP標(biāo)記的抗VCSM13多克隆抗體（購自S

25、igma 公司） HRP標(biāo)記的抗人標(biāo)記的抗人IgG Fab 抗體（購自抗體（購自Sigma公司）公司） 2021-7-1747 方法 噬菌體滴度測定 噬菌體抗體庫的淘篩，制備 噬菌體抗體的抗原結(jié)合活性-夾心ELISA試驗(yàn) 噬菌體抗體的特異性鑒定交叉反應(yīng)性 競爭抑制試驗(yàn) 序列測定 2021-7-1748 結(jié)果 4.1半合成抗體庫的篩選：半合成抗體庫的篩選： 將Tie2抗原過夜包被在酶連板中， 對(duì)所得總庫進(jìn)行了三輪淘篩每輪洗脫噬 菌體鋪平板計(jì)數(shù)，分別是：2.8104 ， 2.9105， 2.6106 。經(jīng)過三輪的吸附、 洗脫、擴(kuò)增的篩選，Tie2抗原對(duì)噬菌體 抗體進(jìn)行了特異性富集。從表4.1可以看

26、 出在三輪淘洗的過程中，噬菌體確實(shí)出 現(xiàn)了特異性的富集，第三輪淘洗比第一 輪的產(chǎn)率高出近40倍。 2021-7-1749 表4.1 噬菌體抗體庫的富集 2021-7-1750 4.2 噬菌體抗體的鑒定噬菌體抗體的鑒定 4.2.1噬菌體抗體的抗原結(jié)合活性噬菌體抗體的抗原結(jié)合活性ELISA實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 第三輪淘篩后，隨機(jī)挑取60個(gè)克隆，制備單 克隆噬菌體抗體，用間接ELISA法檢測對(duì)Tie2 抗原的結(jié)合活性。A490值超過0.8的有10個(gè)（見 表4.2）。 4.2.2 噬菌體抗體的交叉反應(yīng)性鑒定噬菌體抗體的交叉反應(yīng)性鑒定 和其他抗原的交叉反應(yīng)性：將噬菌體抗體滴 度較高的10個(gè)克隆同其他三種不同的抗原

27、（HCV NS5蛋白，BSA，人IgG，）進(jìn)行 ELISA交叉反應(yīng)，排除交叉反應(yīng)抗體，剩余的 抗體是特異性針對(duì)Tie2 抗原的（表4.2）。 2021-7-1751 表4.2 篩選所得克隆與Tie2的結(jié)合活性 及和其他抗原的交叉反應(yīng)性 2021-7-1752 4.2.3競爭抑制試驗(yàn)結(jié)果：競爭抑制試驗(yàn)結(jié)果： 為進(jìn)一步驗(yàn)證所得噬菌體抗體對(duì)體 Tie2抗原的特異性，用Ang1與陽性噬菌 體抗體克隆做競爭抑制試驗(yàn)，結(jié)果表明： Ang1對(duì)部分噬菌體抗體的Tie2結(jié)合活性 具有抑制作用。如表4.3所示 2021-7-1753 表4.3競爭抑制試驗(yàn)結(jié)果 2021-7-1754 4.2.4所得克隆的酶切與測序

28、：所得克隆的酶切與測序： 選取交叉反應(yīng)小，有競爭抑制活性 的克隆進(jìn)行酶切鑒定(EcoRIXhoI酶切 如圖4.1所示)，片段大小為1.6Kb和 3.7Kb 大小正確。同時(shí)送部分菌株測序。 2021-7-1755 圖 4.1 pComb3-Fab酶切結(jié)果 3 . 7 k b 1 . 6 k b 2000 S12 12 S2 S4 M1 M2 S12,12,S2,S4 Fab陽性克隆 M1 /Ecot14 M2 DL2000 2021-7-1756 序列分析 克隆S12測序結(jié)果與抗體胚系基因數(shù)據(jù)庫（V- BASE）比較，重鏈屬于VH4基因家族，與胚系基因 DP-66同源性最高；D、J分別是D7-2

29、7和JH3a；輕鏈屬 于V1家族，來自胚系基因DP3，J段屬于J2（如 圖4.2）。在重鏈的CDR3區(qū)，符合最初的（NNK）8的隨 機(jī)化設(shè)計(jì)，在CDR3前面共有人工加入的8個(gè)氨基酸，后 面3個(gè)氨基酸是基本固定的。12號(hào)克隆重鏈屬于VH1家 族，與DP-23同源性最高，D、J分別是DP-26和JH4d， CDR3區(qū)，符合最初的（NNK）12隨機(jī)化設(shè)計(jì)；輕鏈屬于 VL2家族，來自胚系基因DPL11，J段屬于JL2/JL3a 。 在測序的克隆中，有兩個(gè)克隆測序發(fā)現(xiàn)D基因缺失。 2021-7-1757 圖4.2 S12號(hào)克隆輕鏈重鏈可變區(qū)DNA及氨基酸序列 2021-7-1758 討論 噬菌體抗體庫展示技術(shù)的發(fā)展為不經(jīng)免疫直接制 備抗體成為可能；利用半合成抗體庫直接獲得人源抗 體，是噬菌體展示技術(shù)中的主要方法之一。我們在本 研究中從半合成抗體庫中成功篩選出抗Tie2人源抗體 Fab抗體，說明這一方法是可行的。但所得的Tie2抗體 是否能在體內(nèi)抑制Ang1配體的結(jié)合，還需進(jìn)一步的試 驗(yàn)。半合成抗體庫的庫容是一個(gè)重要參數(shù)，用組合感 染法可以達(dá)到1010，常規(guī)的電穿孔法很難達(dá)到。我們的 庫容通過多次建庫為1.97107。在所建庫中篩到的有 些克隆VH基因不全，這和王琰的結(jié)論有相似的地方， 在CDR3隨機(jī)化的過程中，由于引物合成和重疊PCR的 錯(cuò)誤等原因，會(huì)產(chǎn)生一些不完整的基因。 20