第四章 電泳法

1、電泳電泳是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電荷相反的電是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電荷相反的電 極移動(dòng)的現(xiàn)象。極移動(dòng)的現(xiàn)象。三大要素：帶電顆粒、電場(chǎng)、溶液。三大要素：帶電顆粒、電場(chǎng)、溶液。 18091809年俄國(guó)物理學(xué)家年俄國(guó)物理學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。他在濕粘土首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。他在濕粘土 中插上帶玻璃管的正負(fù)兩個(gè)電極，加電壓后發(fā)現(xiàn)正極玻璃管中原中插上帶玻璃管的正負(fù)兩個(gè)電極，加電壓后發(fā)現(xiàn)正極玻璃管中原 有的水層變混濁，即帶負(fù)電荷的粘土顆粒向正極移動(dòng)，這就是電有的水層變混濁，即帶負(fù)電荷的粘土顆粒向正極移動(dòng)，這就是電 泳現(xiàn)象。泳現(xiàn)象。 19091909年年MichaelisMichaelis首次

2、將膠體離子在電場(chǎng)中的移動(dòng)稱為電泳。他用首次將膠體離子在電場(chǎng)中的移動(dòng)稱為電泳。他用 不同不同pHpH的溶液在的溶液在U U形管中測(cè)定了轉(zhuǎn)化酶和過(guò)氧化氫酶的電泳移動(dòng)和形管中測(cè)定了轉(zhuǎn)化酶和過(guò)氧化氫酶的電泳移動(dòng)和 等電點(diǎn)。等電點(diǎn)。 19371937年瑞典年瑞典UppsalaUppsala大學(xué)的大學(xué)的TiseliusTiselius對(duì)電泳儀器作了改進(jìn)，創(chuàng)造對(duì)電泳儀器作了改進(jìn)，創(chuàng)造 了了TiseliusTiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動(dòng)界面電泳方法，并電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動(dòng)界面電泳方法，并 首次證明了血清是由白蛋白及首次證明了血清是由白蛋白及、球蛋白組成的，由于球蛋白組成的，由于 Ti

3、seliusTiselius在電泳技術(shù)方面作出的開(kāi)拓性貢獻(xiàn)而獲得了在電泳技術(shù)方面作出的開(kāi)拓性貢獻(xiàn)而獲得了19481948年的諾年的諾 貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 19481948年年WielandWieland和和FischerFischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的 電泳方法，對(duì)氨基酸的分離進(jìn)行過(guò)研究。電泳方法，對(duì)氨基酸的分離進(jìn)行過(guò)研究。 從本世紀(jì)從本世紀(jì)5050年代起，特別是年代起，特別是19501950年年DurrumDurrum用紙電泳進(jìn)行了各用紙電泳進(jìn)行了各 種蛋白質(zhì)的分離以后，開(kāi)創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾種蛋白質(zhì)的分離以后，開(kāi)創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)

4、（如各種濾 紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介 質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。 顯微電泳顯微電泳 自由界面電泳自由界面電泳 區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳 它通過(guò)顯微鏡直接觀察分散于液相介質(zhì)中的微粒它通過(guò)顯微鏡直接觀察分散于液相介質(zhì)中的微粒 在電場(chǎng)中的移動(dòng)方向和速度，驗(yàn)證微粒表面電荷在電場(chǎng)中的移動(dòng)方向和速度，驗(yàn)證微粒表面電荷 的符號(hào)和密度，進(jìn)而推測(cè)它們的組成和特點(diǎn)。的符號(hào)和密度，進(jìn)而推測(cè)它們的組成和特點(diǎn)。 在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域中，顯微電泳技術(shù)常用于觀察細(xì)胞，這時(shí)的在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域中，顯微電泳技術(shù)常用于觀察細(xì)胞，這時(shí)的 顯微電泳稱為細(xì)

5、胞電泳。根據(jù)細(xì)胞表面的電荷密度，推測(cè)其構(gòu)造顯微電泳稱為細(xì)胞電泳。根據(jù)細(xì)胞表面的電荷密度，推測(cè)其構(gòu)造 和功能、大分子物質(zhì)在細(xì)胞表面的吸附，以及在細(xì)胞表面進(jìn)行的和功能、大分子物質(zhì)在細(xì)胞表面的吸附，以及在細(xì)胞表面進(jìn)行的 免疫反應(yīng)等等。免疫反應(yīng)等等。目前此法已用于研究膜結(jié)構(gòu)以及癌細(xì)胞和正常細(xì)目前此法已用于研究膜結(jié)構(gòu)以及癌細(xì)胞和正常細(xì) 胞的差異性等方面。胞的差異性等方面。 是膠體溶液的溶質(zhì)顆粒經(jīng)過(guò)電泳后，在膠體溶液和溶是膠體溶液的溶質(zhì)顆粒經(jīng)過(guò)電泳后，在膠體溶液和溶 劑之間形成界面的電泳過(guò)程。劑之間形成界面的電泳過(guò)程。 最簡(jiǎn)單的界面電泳是在一最簡(jiǎn)單的界面電泳是在一“U”U”形管中裝入一定量的帶形管中裝入一

6、定量的帶 色膠體溶液如黃色硫化砷膠體溶液或血紅蛋白溶液，然色膠體溶液如黃色硫化砷膠體溶液或血紅蛋白溶液，然 后小心地分別在后小心地分別在U U形管兩端注入等量的稀電解質(zhì)溶液形管兩端注入等量的稀電解質(zhì)溶液 (NaCl(NaCl溶液或一定溶液或一定pHpH的緩沖液的緩沖液) )，使其與膠體溶液之間有，使其與膠體溶液之間有 明顯的界面，接著在此管兩端放入鉑電極，通直流電，明顯的界面，接著在此管兩端放入鉑電極，通直流電， 過(guò)一段時(shí)間即可看到過(guò)一段時(shí)間即可看到邊膠體溶液的界面上升，另一邊邊膠體溶液的界面上升，另一邊 則下降。這是膠體顆粒產(chǎn)生泳動(dòng)的結(jié)果。由于該電泳不則下降。這是膠體顆粒產(chǎn)生泳動(dòng)的結(jié)果。由于

7、該電泳不 受支持物的影響，所以分離效果較好，一般適用于膠體受支持物的影響，所以分離效果較好，一般適用于膠體 物質(zhì)的純度鑒定及電泳速度的測(cè)定。物質(zhì)的純度鑒定及電泳速度的測(cè)定。 是樣品物質(zhì)在一惰性支持物上進(jìn)行電泳的過(guò)程。因是樣品物質(zhì)在一惰性支持物上進(jìn)行電泳的過(guò)程。因 電泳后，樣品的不同組分可形成帶狀的區(qū)間，故稱區(qū)帶電泳后，樣品的不同組分可形成帶狀的區(qū)間，故稱區(qū)帶 電泳，亦稱區(qū)域電泳。電泳，亦稱區(qū)域電泳。 采用不同類型的支持物進(jìn)行該電泳時(shí)，能分離鑒定采用不同類型的支持物進(jìn)行該電泳時(shí)，能分離鑒定 小分子物質(zhì)小分子物質(zhì)( (如核苷酸、氨基酸和肽類等如核苷酸、氨基酸和肽類等) )和大分子物和大分子物 質(zhì)質(zhì)

8、( (如核酸、蛋白質(zhì)，以及病毒顆粒等如核酸、蛋白質(zhì)，以及病毒顆粒等) )。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1 1）由于區(qū)帶電泳有支持物存在，能減少了界面）由于區(qū)帶電泳有支持物存在，能減少了界面 之間的擴(kuò)散和異?，F(xiàn)象的干擾發(fā)生，某些支持物具有分之間的擴(kuò)散和異?，F(xiàn)象的干擾發(fā)生，某些支持物具有分 子篩的效能，區(qū)帶電泳的靈敏度和分辨率可以提高。子篩的效能，區(qū)帶電泳的靈敏度和分辨率可以提高。2 2） 區(qū)帶電泳設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，已成為開(kāi)展生物化學(xué)和區(qū)帶電泳設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，已成為開(kāi)展生物化學(xué)和 分子生物學(xué)等研究工作的一種不可缺少的工具。分子生物學(xué)等研究工作的一種不可缺少的工具。 當(dāng)把一個(gè)帶凈電荷當(dāng)把一個(gè)帶凈電荷(q)(

9、q)的顆粒放入電場(chǎng)時(shí)，便有一個(gè)力的顆粒放入電場(chǎng)時(shí)，便有一個(gè)力 (F)(F)作用于其上。作用于其上。F F的大小取決于顆粒凈電荷量及其所的大小取決于顆粒凈電荷量及其所 處的電場(chǎng)強(qiáng)度處的電場(chǎng)強(qiáng)度(E)(E)，它們之間的關(guān)系可用下式表示：，它們之間的關(guān)系可用下式表示： F FEqEq 由于由于F F的作用，使帶電顆粒在電場(chǎng)中向一定方向泳動(dòng)。的作用，使帶電顆粒在電場(chǎng)中向一定方向泳動(dòng)。 泳動(dòng)過(guò)程中還受到一個(gè)相反方向的摩擦力（泳動(dòng)過(guò)程中還受到一個(gè)相反方向的摩擦力（fv)fv)阻擋，阻擋， 當(dāng)這兩種力相等時(shí)，顆粒則以速度當(dāng)這兩種力相等時(shí)，顆粒則以速度(v)(v)向前流動(dòng)。向前流動(dòng)。 v=F/f=Eq/fv=

10、F/f=Eq/f 式中式中f f為摩擦系數(shù)。根據(jù)為摩擦系數(shù)。根據(jù)StokeStoke公式，阻力大小取決于公式，阻力大小取決于 帶電顆粒的大小、形狀以及所處介質(zhì)的粘度，即帶電顆粒的大小、形狀以及所處介質(zhì)的粘度，即 f f 6r 6r 式中式中r r為顆粒半徑，為顆粒半徑，(Eta)(Eta)為介質(zhì)粘度。該公為介質(zhì)粘度。該公 式系指球形顆粒所受的阻力。把式系指球形顆粒所受的阻力。把f f公式代入公式代入v v公式得：公式得： V= Eq/6rV= Eq/6r 從公式可知，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度與電場(chǎng)強(qiáng)度從公式可知，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度與電場(chǎng)強(qiáng)度 和帶電顆粒的凈電荷量成正比，而與顆粒半徑和

11、介質(zhì)粘和帶電顆粒的凈電荷量成正比，而與顆粒半徑和介質(zhì)粘 度成反比。若顆粒是具有兩性電介質(zhì)性質(zhì)的蛋白質(zhì)分子度成反比。若顆粒是具有兩性電介質(zhì)性質(zhì)的蛋白質(zhì)分子 時(shí)，它在一定時(shí)，它在一定pHpH溶液中的電荷性質(zhì)是獨(dú)持的。這種物溶液中的電荷性質(zhì)是獨(dú)持的。這種物 質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)一段時(shí)間后，便會(huì)集中到確定的位置上質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)一段時(shí)間后，便會(huì)集中到確定的位置上 呈一條致密區(qū)帶。若樣品為混合的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，由于呈一條致密區(qū)帶。若樣品為混合的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，由于 不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量是不同的，因此經(jīng)電泳后，不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量是不同的，因此經(jīng)電泳后， 就形成了泳動(dòng)度不同的區(qū)帶。利用此性質(zhì)，便可把混合就

12、形成了泳動(dòng)度不同的區(qū)帶。利用此性質(zhì)，便可把混合 液中不同的蛋白質(zhì)液中不同的蛋白質(zhì)( (或其它物質(zhì)或其它物質(zhì)) )分離開(kāi)，也可用其對(duì)樣分離開(kāi)，也可用其對(duì)樣 品的純度進(jìn)行鑒定。品的純度進(jìn)行鑒定。 式中式中d d為帶電顆粒泳動(dòng)的距離為帶電顆粒泳動(dòng)的距離(cm)(cm)；l l為支持物的為支持物的 有效長(zhǎng)度有效長(zhǎng)度(cm)(cm)，t t為通電時(shí)間為通電時(shí)間( (秒秒) )；V V為加在支持為加在支持 物兩端的實(shí)際電壓物兩端的實(shí)際電壓( (伏特伏特) )。在一定的條件下，任。在一定的條件下，任 何帶電顆粒都具有自己的特定泳動(dòng)度。它是膠體何帶電顆粒都具有自己的特定泳動(dòng)度。它是膠體 顆粒的一個(gè)物理常數(shù)，可

13、用其鑒定蛋白質(zhì)等，還顆粒的一個(gè)物理常數(shù)，可用其鑒定蛋白質(zhì)等，還 可用其研究蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的一些化學(xué)性質(zhì)?？捎闷溲芯康鞍踪|(zhì)、核酸等物質(zhì)的一些化學(xué)性質(zhì)。 影響泳動(dòng)速度的因子有顆粒的性質(zhì)、電場(chǎng)強(qiáng)度和影響泳動(dòng)速度的因子有顆粒的性質(zhì)、電場(chǎng)強(qiáng)度和 溶液的性質(zhì)等。溶液的性質(zhì)等。 M = = E = d/t V/l = d l V t l六大因素大因素 1 1顆粒性質(zhì)顆粒性質(zhì) 顆粒直徑、形狀以及所帶的靜電荷量對(duì)泳動(dòng)速度有較大顆粒直徑、形狀以及所帶的靜電荷量對(duì)泳動(dòng)速度有較大 影響。一般來(lái)說(shuō)，顆粒帶凈電荷量越大，或其直徑越小，影響。一般來(lái)說(shuō)，顆粒帶凈電荷量越大，或其直徑越小， 或其形狀越接近球形，在電場(chǎng)中的泳

14、動(dòng)速度就越快。反或其形狀越接近球形，在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度就越快。反 之，則越慢。之，則越慢。 2 2電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)泳動(dòng)速度起著十分重要的作用。電場(chǎng)強(qiáng)度越電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)泳動(dòng)速度起著十分重要的作用。電場(chǎng)強(qiáng)度越 高，帶電顆粒的泳動(dòng)速度越快。反之，則越慢。高，帶電顆粒的泳動(dòng)速度越快。反之，則越慢。 電泳分為：電泳分為：常壓電泳和高壓電泳常壓電泳和高壓電泳。前者電場(chǎng)強(qiáng)度為。前者電場(chǎng)強(qiáng)度為2-102-10 伏特厘米，后者為伏特厘米，后者為70-20070-200伏特厘米。用高壓電泳分伏特厘米。用高壓電泳分 離樣品需要的時(shí)間比常壓電泳短。離樣品需要的時(shí)間比常壓電泳短。 是指電極溶液和蛋白質(zhì)樣品溶液的

15、是指電極溶液和蛋白質(zhì)樣品溶液的pHpH值、離子強(qiáng)度和粘值、離子強(qiáng)度和粘 度等。度等。 （1)pH1)pH值值 溶液溶液pHpH值決定帶電顆粒的解離程度，也即決定其帶凈電值決定帶電顆粒的解離程度，也即決定其帶凈電 荷的量。對(duì)蛋白質(zhì)而言，溶液的荷的量。對(duì)蛋白質(zhì)而言，溶液的pHpH值離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，值離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)， 則其帶凈電荷量就愈大，從而泳動(dòng)速度就越快。反之，則其帶凈電荷量就愈大，從而泳動(dòng)速度就越快。反之， 則越慢則越慢。 (2)(2)離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度 溶液的離子強(qiáng)度一般在溶液的離子強(qiáng)度一般在0.02-0.20.02-0.2之間時(shí)，電泳較合適。之間時(shí)，電泳較合適。 若離子強(qiáng)度過(guò)高，則會(huì)降低顆粒

16、的泳動(dòng)度。其原因是，若離子強(qiáng)度過(guò)高，則會(huì)降低顆粒的泳動(dòng)度。其原因是， 帶電顆粒能把溶液中與其電荷相反的離子吸引在自己周帶電顆粒能把溶液中與其電荷相反的離子吸引在自己周 圍形成圍形成離子擴(kuò)散層離子擴(kuò)散層。這種靜電引力作用的結(jié)果，導(dǎo)致顆。這種靜電引力作用的結(jié)果，導(dǎo)致顆 粒泳動(dòng)度降低；若離子強(qiáng)度過(guò)低，則緩沖能力差，往往粒泳動(dòng)度降低；若離子強(qiáng)度過(guò)低，則緩沖能力差，往往 會(huì)因溶液會(huì)因溶液pHpH值變化而影響泳動(dòng)度的速率。值變化而影響泳動(dòng)度的速率。 l(3)(3)溶液粘度溶液粘度 前面提到泳動(dòng)度與溶液粘度是成反比例關(guān)系，因此前面提到泳動(dòng)度與溶液粘度是成反比例關(guān)系，因此 粘度過(guò)大或過(guò)小，粘度過(guò)大或過(guò)小，必然

17、影響泳動(dòng)度。必然影響泳動(dòng)度。 I=1/2CiZiI=1/2CiZi2 2 式中式中I I為離子強(qiáng)度；為離子強(qiáng)度；C Ci i為離子的克分子濃度；為離子的克分子濃度；Z Zi i為離子為離子 的價(jià)數(shù)。的價(jià)數(shù)。 例例1 1、兩個(gè)單價(jià)離子化合物（如、兩個(gè)單價(jià)離子化合物（如NaClNaCl）的離子強(qiáng)度等于）的離子強(qiáng)度等于 它的克分子濃度。如它的克分子濃度。如0.154mol/L NaCl0.154mol/L NaCl的溶液的離子強(qiáng)的溶液的離子強(qiáng) 度可計(jì)算如下：度可計(jì)算如下： I =1/2I =1/2（0.1540.1541 12 2+0.154+0.1541 12 2）= 0.154= 0.154 當(dāng)

18、支持物不是絕對(duì)惰性物質(zhì)時(shí)，常常會(huì)有一些離子基團(tuán)當(dāng)支持物不是絕對(duì)惰性物質(zhì)時(shí)，常常會(huì)有一些離子基團(tuán) 如羧基、磺酸基、羥基等吸附溶液中的正離子，使靠近如羧基、磺酸基、羥基等吸附溶液中的正離子，使靠近 支持物的溶液相對(duì)帶電。在電場(chǎng)作用下，此溶液層會(huì)向支持物的溶液相對(duì)帶電。在電場(chǎng)作用下，此溶液層會(huì)向 負(fù)極移動(dòng)。反之，若支持物的離子基團(tuán)吸附溶液中的負(fù)負(fù)極移動(dòng)。反之，若支持物的離子基團(tuán)吸附溶液中的負(fù) 離子，則溶液層會(huì)向正極移動(dòng)。溶液的泳動(dòng)現(xiàn)象稱為電離子，則溶液層會(huì)向正極移動(dòng)。溶液的泳動(dòng)現(xiàn)象稱為電 滲。因此，當(dāng)顆粒的泳動(dòng)方向與電路方向一致時(shí)，則加滲。因此，當(dāng)顆粒的泳動(dòng)方向與電路方向一致時(shí)，則加 快顆粒的泳動(dòng)速

19、度；當(dāng)顆粒的泳動(dòng)方向與快顆粒的泳動(dòng)速度；當(dāng)顆粒的泳動(dòng)方向與電泳方向相反電泳方向相反 時(shí)，則降低顆粒的泳動(dòng)速度。時(shí)，則降低顆粒的泳動(dòng)速度。 在電泳過(guò)程中，電流強(qiáng)度與釋放的熱量在電泳過(guò)程中，電流強(qiáng)度與釋放的熱量(Q)(Q)之間的關(guān)系可之間的關(guān)系可 列成如下公式列成如下公式: : Q QI I2 2RtRt 式中式中R R為電阻，為電阻，t t為電泳時(shí)間，為電泳時(shí)間，I I為電流強(qiáng)度。公式表明，為電流強(qiáng)度。公式表明， 電泳過(guò)程中釋放出的熱量與電流強(qiáng)度的平方成正比當(dāng)電泳過(guò)程中釋放出的熱量與電流強(qiáng)度的平方成正比當(dāng) 電場(chǎng)強(qiáng)度或電極緩沖液中離子強(qiáng)度增高時(shí)，電流強(qiáng)度會(huì)電場(chǎng)強(qiáng)度或電極緩沖液中離子強(qiáng)度增高時(shí)，電流

20、強(qiáng)度會(huì) 隨著增大。這不僅降低分辨率，而且在嚴(yán)重時(shí)會(huì)燒斷濾隨著增大。這不僅降低分辨率，而且在嚴(yán)重時(shí)會(huì)燒斷濾 紙或熔化瓊脂糖凝膠支持物。紙或熔化瓊脂糖凝膠支持物。 支持物瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠都有大小不等的篩孔，支持物瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠都有大小不等的篩孔， 在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒泳動(dòng)速度快。反之，則泳在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒泳動(dòng)速度快。反之，則泳 動(dòng)速度慢。動(dòng)速度慢。 除上述影響泳動(dòng)速度的因子外，溫度和儀器裝置等因除上述影響泳動(dòng)速度的因子外，溫度和儀器裝置等因 子的影響也應(yīng)考慮子的影響也應(yīng)考慮。 是用濾紙作支持物的一種電泳方法。紙電泳除了以濾紙是用濾紙作支持物的一種電泳方法。紙電泳除了以濾紙

21、 作為支持物外，還可以醋酸纖維素紙作為支持物外，還可以醋酸纖維素紙( (或膜或膜) )作為支持物。作為支持物。 用后一支持物進(jìn)行的電泳稱醋酸纖維素膜電泳，它的操用后一支持物進(jìn)行的電泳稱醋酸纖維素膜電泳，它的操 作與紙電泳有相似的地方，但分辨率比紙電泳高作與紙電泳有相似的地方，但分辨率比紙電泳高。 PAGE(PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis) )是以聚丙是以聚丙 烯酰胺凝膠作為支持物的一種電泳方法。它是在淀粉凝烯酰胺凝膠作為支持物的一種電泳方法。它是在淀粉凝 膠電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。膠電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。DavisDavis和和Ornstein

22、Ornstein于于19591959年年 報(bào)道了聚丙烯酰胺凝膠盤(pán)狀電泳法，并用該法成功地對(duì)報(bào)道了聚丙烯酰胺凝膠盤(pán)狀電泳法，并用該法成功地對(duì) 人血清蛋白進(jìn)行了分離。從此，這種電泳方法成了分離人血清蛋白進(jìn)行了分離。從此，這種電泳方法成了分離 蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)的重要工具之一，目前已在蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)的重要工具之一，目前已在 科研、教學(xué)及生產(chǎn)等方面廣泛應(yīng)用?？蒲小⒔虒W(xué)及生產(chǎn)等方面廣泛應(yīng)用。 聚丙烯酰胺凝膠是人工合成的多聚體。調(diào)節(jié)單體濃聚丙烯酰胺凝膠是人工合成的多聚體。調(diào)節(jié)單體濃 度，或單體和交聯(lián)劑的比例，就能得到孔徑不同、度，或單體和交聯(lián)劑的比例，就能得到孔徑不同、 范圍廣泛的凝膠物質(zhì)

23、，而且范圍廣泛的凝膠物質(zhì)，而且重復(fù)性重復(fù)性好；好； 聚丙烯酰胺凝膠機(jī)械強(qiáng)度好，彈性大聚丙烯酰胺凝膠機(jī)械強(qiáng)度好，彈性大( (類似橡皮類似橡皮) )， 有利于電泳后進(jìn)行各種處理；有利于電泳后進(jìn)行各種處理； 聚丙烯酰胺凝膠是聚丙烯酰胺凝膠是- -C- C- C- CC- C- C- C連接的多聚體，連接的多聚體， 側(cè)鏈除不活潑的酰胺基外，并無(wú)其它離子基團(tuán)，故側(cè)鏈除不活潑的酰胺基外，并無(wú)其它離子基團(tuán)，故 無(wú)電滲作用無(wú)電滲作用； 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱Acr)和和 交聯(lián)劑交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱Bis)在加速劑在加

24、速劑N， N，N ，N -四甲基乙二胺四甲基乙二胺(簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱TEMED)和催化和催化 劑過(guò)硫酸銨劑過(guò)硫酸銨(簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱AP)或核黃素或核黃素(VB2)的作用下聚的作用下聚 合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持 物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱PAGE)。 圖圖1 1 夾心垂直板電泳槽示意圖夾心垂直板電泳槽示意圖 1.1.樣品槽模板；樣品槽模板；2.2.長(zhǎng)玻璃板；長(zhǎng)玻璃板；1.1.導(dǎo)線接頭；導(dǎo)線接頭；2.2.下貯槽；下貯槽； 3.3.凹形橡膠框；凹形橡膠框；4.4.樣品槽模板；樣品槽模板；5.5.固定螺絲；固定螺

25、絲；6.6.上貯槽；上貯槽； 7.7.冷凝系統(tǒng)冷凝系統(tǒng) 圖圖2 2 聚丙烯酰胺凝膠圓盤(pán)電泳示意圖聚丙烯酰胺凝膠圓盤(pán)電泳示意圖 (A(A為正面為正面,B,B為剖面為剖面) ) (1)(1)樣品膠樣品膠 pH 6.7pH 6.7； (2)(2)濃縮膠濃縮膠 pH 6.7pH 6.7； (3)(3)分離膠分離膠 pH 8.9pH 8.9； (4)(4)電極緩沖液電極緩沖液 pH 8.3pH 8.3 式中式中a a代表單體的重量代表單體的重量(g)(g)；b b代表雙體的重量代表雙體的重量(g)(g)；m m代表代表 溶液的體積溶液的體積(ml)(ml)。 a a與與b b的比值的比值(W/W)(W/

26、W)對(duì)凝膠的篩孔、透明度和機(jī)械強(qiáng)度等對(duì)凝膠的篩孔、透明度和機(jī)械強(qiáng)度等 性質(zhì)也有明顯影響。當(dāng)性質(zhì)也有明顯影響。當(dāng)a/ba/b1010時(shí)，凝膠變硬呈乳白色；時(shí)，凝膠變硬呈乳白色； 當(dāng)當(dāng)a/ba/b100100時(shí)，時(shí)，5 5凝膠呈糊狀凝膠呈糊狀, ,且易斷裂。且易斷裂。 綜上可知，凝膠濃度不同，其交聯(lián)度是不同的。綜上可知，凝膠濃度不同，其交聯(lián)度是不同的。 交聯(lián)度隨著總濃度交聯(lián)度隨著總濃度(T)(T)的增加而降低。因此，當(dāng)?shù)脑黾佣档?。因此，?dāng) 總濃度一定、交聯(lián)度增加時(shí)，將導(dǎo)致篩孔直徑降總濃度一定、交聯(lián)度增加時(shí)，將導(dǎo)致篩孔直徑降 低。根據(jù)這個(gè)道理，低。根據(jù)這個(gè)道理，RihardRihard等在等在19

27、651965年提出了適年提出了適 合于確定凝膠濃度為合于確定凝膠濃度為5%-205%-20范圍內(nèi)交聯(lián)度的經(jīng)范圍內(nèi)交聯(lián)度的經(jīng) 驗(yàn)公式：驗(yàn)公式：C=6.50.3T C=6.50.3T 如選用總濃度如選用總濃度T T分別為分別為5 5 和和1010時(shí)，依照上述公式便可計(jì)算出交聯(lián)度時(shí)，依照上述公式便可計(jì)算出交聯(lián)度C C應(yīng)應(yīng) 分別為分別為5 5和和3.53.5。 FawcettFawcett提出了另一種看法：當(dāng)凝膠總濃度不變，提出了另一種看法：當(dāng)凝膠總濃度不變， 交聯(lián)度為交聯(lián)度為5 5時(shí)，篩孔直徑最小；大于或小于此時(shí)，篩孔直徑最??；大于或小于此 交聯(lián)度時(shí)，篩孔直徑均變大。因此，目前有些交聯(lián)度時(shí)，篩孔直徑

28、均變大。因此，目前有些 實(shí)驗(yàn)室采用實(shí)驗(yàn)室采用a/ba/b19/119/1的配方。的配方。 C C值是由值是由T T值決定的，或是固定值值決定的，或是固定值(5(5) )。而。而T T值則依據(jù)值則依據(jù) 分離物質(zhì)的分子量大小來(lái)確定。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)或核酸在分離物質(zhì)的分子量大小來(lái)確定。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)或核酸在 不同濃度凝膠中的遷移率，是隨著總濃度的增加而降不同濃度凝膠中的遷移率，是隨著總濃度的增加而降 低的。所以在分離不同分子量的混合物時(shí)，只有選擇低的。所以在分離不同分子量的混合物時(shí)，只有選擇 適宜濃度的凝膠才能奏效。常用于分離血清蛋白的標(biāo)適宜濃度的凝膠才能奏效。常用于分離血清蛋白的標(biāo) 準(zhǔn)凝膠是指濃度為準(zhǔn)凝膠是

29、指濃度為7.57.5的凝膠。用此膠分離大多數(shù)生的凝膠。用此膠分離大多數(shù)生 物體內(nèi)的蛋白質(zhì)，電泳結(jié)果一般都較滿意。當(dāng)分析一物體內(nèi)的蛋白質(zhì)，電泳結(jié)果一般都較滿意。當(dāng)分析一 個(gè)未知樣品時(shí)，常常先用個(gè)未知樣品時(shí)，常常先用7.57.5的標(biāo)準(zhǔn)凝膠或用的標(biāo)準(zhǔn)凝膠或用4 4-10-10 的梯度凝膠試驗(yàn)，以便選到理想濃度的凝膠。當(dāng)分的梯度凝膠試驗(yàn)，以便選到理想濃度的凝膠。當(dāng)分 離物的分子量已知時(shí)，選擇何種濃度凝膠為佳，可參離物的分子量已知時(shí)，選擇何種濃度凝膠為佳，可參 考表考表123123 化學(xué)聚合：化學(xué)聚合： 化學(xué)聚合的催化劑一般是過(guò)硫酸銨化學(xué)聚合的催化劑一般是過(guò)硫酸銨(AP)(AP)，加速劑是脂，加速劑是脂

30、 肪叔胺如四甲基乙二胺肪叔胺如四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)、三乙醇銨和二甲基氨、三乙醇銨和二甲基氨 丙腈等。其中以丙腈等。其中以TEMEDTEMED為最好。當(dāng)為最好。當(dāng)AcrAcr、BisBis和和TEMEDTEMED的的 水溶液中加入過(guò)硫酸銨時(shí)，過(guò)硫酸銨水溶液中加入過(guò)硫酸銨時(shí)，過(guò)硫酸銨(NH4)(NH4)2 2S S2 2O O8 8 立即立即 產(chǎn)生自由基：產(chǎn)生自由基： S S2 2O O8 8 - - 、 、2SO2SO4 4 - - ； ； 丙烯酰胺與自由基作丙烯酰胺與自由基作 用后，隨即用后，隨即“活化活化”?；罨谋０繁舜诉B接形成?；罨谋０繁舜诉B接形成 多聚體長(zhǎng)

31、鏈：多聚體長(zhǎng)鏈： (2)(2)丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺的聚合 丙烯酰胺聚合時(shí)，常用的催丙烯酰胺聚合時(shí)，常用的催 化系統(tǒng)有化系統(tǒng)有化學(xué)聚合化學(xué)聚合和和光聚合光聚合。 含有這種多聚體鏈的溶液盡管比較粘稠，但不能含有這種多聚體鏈的溶液盡管比較粘稠，但不能 形成凝膠。只有當(dāng)交聯(lián)劑形成凝膠。只有當(dāng)交聯(lián)劑(bis)(bis)存在時(shí)，才能形存在時(shí)，才能形 成凝膠。在過(guò)硫酸銨成凝膠。在過(guò)硫酸銨TEMEDTEMED催化系統(tǒng)中，從催化系統(tǒng)中，從AcrAcr 和和BisBis聚合的初速率與過(guò)硫酸銨濃度的平方根成聚合的初速率與過(guò)硫酸銨濃度的平方根成 正比，并且在堿性條件下反應(yīng)迅速。例如、正比，并且在堿性條件下反應(yīng)迅速。

32、例如、7 7 的丙烯酰胺溶液要完全聚合，在的丙烯酰胺溶液要完全聚合，在pH8.8pH8.8時(shí)，僅需時(shí)，僅需 3030分鐘；而在分鐘；而在pH4.3pH4.3時(shí)，則需時(shí)，則需9090分鐘。此外，溫分鐘。此外，溫 度、氧分子和雜質(zhì)等都會(huì)影響聚合速度。一般在度、氧分子和雜質(zhì)等都會(huì)影響聚合速度。一般在 室溫下比在零度下聚合快，溶液預(yù)先抽氣的比不室溫下比在零度下聚合快，溶液預(yù)先抽氣的比不 抽氣的聚合快。抽氣的聚合快。 膠體的聚合反應(yīng)膠體的聚合反應(yīng) Ammonium persulfate (free radical initiator) (O4S-SO4)2- 2SO4- 自由基的生成者自由基的生成者 成

33、膠的基本單位成膠的基本單位 Acrylamide (monomer) 架橋使聚合產(chǎn)生分枝架橋使聚合產(chǎn)生分枝 Bis(acrylamide)(bridge) 幫助傳遞自由基的催化劑幫助傳遞自由基的催化劑 TEMED(catalyst) SDS (Sodium dodecyl sulfate) 光聚合：催化劑是核黃素。光聚合過(guò)程是一個(gè)光激發(fā)光聚合：催化劑是核黃素。光聚合過(guò)程是一個(gè)光激發(fā) 的催化反應(yīng)過(guò)程。在氧及紫外線作用下、核黃素生成含的催化反應(yīng)過(guò)程。在氧及紫外線作用下、核黃素生成含 自由基的產(chǎn)物，自由基的作用如同上述的過(guò)硫酸銨一樣。自由基的產(chǎn)物，自由基的作用如同上述的過(guò)硫酸銨一樣。 通常將反應(yīng)混合

34、液置于一般熒光燈旁，即可使反應(yīng)發(fā)生。通常將反應(yīng)混合液置于一般熒光燈旁，即可使反應(yīng)發(fā)生。 用核黃素催化時(shí)，可不加用核黃素催化時(shí)，可不加TEMED，但是加入后會(huì)使聚，但是加入后會(huì)使聚 合速度加快。光聚合形成的凝膠呈乳白色，透明度較差。合速度加快。光聚合形成的凝膠呈乳白色，透明度較差。 用核黃素催化劑的優(yōu)點(diǎn)是，用量極少用核黃素催化劑的優(yōu)點(diǎn)是，用量極少(1mg100ml)，對(duì)，對(duì) 分析樣品無(wú)任何不良影響；聚合時(shí)間可以自由控制，改分析樣品無(wú)任何不良影響；聚合時(shí)間可以自由控制，改 變光照時(shí)間和強(qiáng)度可使聚合作用延遲或加快。變光照時(shí)間和強(qiáng)度可使聚合作用延遲或加快。 化學(xué)聚合后的凝膠孔徑比光聚合的小，而且化學(xué)聚

35、合后的凝膠孔徑比光聚合的小，而且 重復(fù)性和透明度也比光聚合的好。但是化學(xué)重復(fù)性和透明度也比光聚合的好。但是化學(xué) 聚合的催化劑過(guò)硫酸銨是強(qiáng)氧化劑，若殘存聚合的催化劑過(guò)硫酸銨是強(qiáng)氧化劑，若殘存 于凝膠中往往會(huì)使某些蛋白質(zhì)分子喪失活性，于凝膠中往往會(huì)使某些蛋白質(zhì)分子喪失活性， 或者產(chǎn)生不正或者產(chǎn)生不正常的電泳圖譜。常的電泳圖譜。 2.2.分離效應(yīng)分離效應(yīng) 用凝膠電泳分離血清樣品時(shí)，除了與紙電泳一樣用凝膠電泳分離血清樣品時(shí)，除了與紙電泳一樣 具有電荷效應(yīng)外，還有濃縮效應(yīng)具有電荷效應(yīng)外，還有濃縮效應(yīng)( (不連續(xù)電泳發(fā)不連續(xù)電泳發(fā) 生于濃縮膠中生于濃縮膠中) )和分子篩效應(yīng)和分子篩效應(yīng)( (發(fā)生于分離膠中

36、，發(fā)生于分離膠中， 故其分辨率比紙電泳高。故其分辨率比紙電泳高。 (1)(1)濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) 當(dāng)分離膠和濃縮膠選用當(dāng)分離膠和濃縮膠選用pH6.7 TrispH6.7 TrisHClHCl緩沖液、電極緩沖液、電極 液選用液選用pH8.0 TrispH8.0 Tris甘氨酸緩沖酸時(shí)，在電泳的開(kāi)頭，甘氨酸緩沖酸時(shí)，在電泳的開(kāi)頭， 鹽酸幾乎全部解離釋放出氯離子（鹽酸幾乎全部解離釋放出氯離子（C1C1- -) )，甘氨酸，甘氨酸(pI(pI為為 6.06.0、pKapKa為為2.342.34，pKpK為為97)97)則只有則只有1 1-0.1-0.1解離釋解離釋 放出甘氨酸根離子放出甘氨酸根離子(NH

37、(NH2 2-CH-CH2 2-COO-COO- -) )，而酸性蛋白質(zhì)一般，而酸性蛋白質(zhì)一般 在濃縮膠中解離為帶負(fù)電荷的離子。這三種離子帶有相在濃縮膠中解離為帶負(fù)電荷的離子。這三種離子帶有相 同類型的電荷，并同時(shí)向正極移動(dòng)。其有效泳動(dòng)率按如同類型的電荷，并同時(shí)向正極移動(dòng)。其有效泳動(dòng)率按如 下次序排列：下次序排列： m mcl- cl-a a- -m m蛋蛋- -aa蛋蛋- -m m甘甘- -aa甘甘- -式中式中m m 代表泳動(dòng)率，代表泳動(dòng)率，n n代表解離度，代表解離度，mama代表有效泳功率。代表有效泳功率。 根據(jù)有效泳動(dòng)率的大小區(qū)分，把最快的根據(jù)有效泳動(dòng)率的大小區(qū)分，把最快的ClCl-

38、 -稱為快離子，稱為快離子， 又稱前導(dǎo)離子又稱前導(dǎo)離子) )；把最慢的；把最慢的NHNH2 2-CH-CH2 2COOCOO- -稱為慢離子稱為慢離子( (又又 稱尾隨離子稱尾隨離子) )。在電泳剛開(kāi)始時(shí)，三層凝膠。在電泳剛開(kāi)始時(shí)，三層凝膠( (樣品膠、樣品膠、 濃縮膠和分離膠濃縮膠和分離膠) )中都含有快離子。只是電極緩種液中中都含有快離子。只是電極緩種液中 含有慢離子。電泳進(jìn)行時(shí)，由于快離子的泳動(dòng)率最大，含有慢離子。電泳進(jìn)行時(shí)，由于快離子的泳動(dòng)率最大， 因此很快超過(guò)蛋白質(zhì)，于是在快離子后邊形成一離子濃因此很快超過(guò)蛋白質(zhì)，于是在快離子后邊形成一離子濃 度低的區(qū)域，即低電導(dǎo)區(qū)。電場(chǎng)強(qiáng)度與電導(dǎo)成

39、反比關(guān)系：度低的區(qū)域，即低電導(dǎo)區(qū)。電場(chǎng)強(qiáng)度與電導(dǎo)成反比關(guān)系： E E1/(1/(伏厘米伏厘米) )，式中，式中E E代表電場(chǎng)強(qiáng)度、代表電場(chǎng)強(qiáng)度、1 1代表電流代表電流 強(qiáng)度，強(qiáng)度，代表電導(dǎo)率。代表電導(dǎo)率。 由于電導(dǎo)與電勢(shì)梯度成反比，因而在低電導(dǎo)區(qū)可產(chǎn)生較由于電導(dǎo)與電勢(shì)梯度成反比，因而在低電導(dǎo)區(qū)可產(chǎn)生較 高的電勢(shì)梯度。這種高電勢(shì)梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快高的電勢(shì)梯度。這種高電勢(shì)梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快 離子后面加速移動(dòng)。因而在高電勢(shì)梯度和低電勢(shì)梯度之離子后面加速移動(dòng)。因而在高電勢(shì)梯度和低電勢(shì)梯度之 間形成一個(gè)迅速移動(dòng)的界面，由于樣品中蛋白質(zhì)的有效間形成一個(gè)迅速移動(dòng)的界面，由于樣品中蛋白質(zhì)的有效 遷

40、移率恰好介于快、慢離子之間，所以，也就聚集在這遷移率恰好介于快、慢離子之間，所以，也就聚集在這 個(gè)移動(dòng)的界面附近，逐漸被濃縮，在到達(dá)小孔徑的分離個(gè)移動(dòng)的界面附近，逐漸被濃縮，在到達(dá)小孔徑的分離 膠時(shí)，已形成一薄層。膠時(shí)，已形成一薄層。 最后，樣品在電泳開(kāi)始時(shí)，通過(guò)濃縮膠被濃縮成高濃度最后，樣品在電泳開(kāi)始時(shí)，通過(guò)濃縮膠被濃縮成高濃度 的樣品薄層的樣品薄層( (一般能濃縮幾百倍一般能濃縮幾百倍) )，然后再被分離。，然后再被分離。 樣品樣品 濃縮膠濃縮膠 分離膠分離膠 快離子快離子慢離子慢離子蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) A A B B C C + - + 界面界面 - - (2)(2)電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) 當(dāng)各種離

41、子進(jìn)入當(dāng)各種離子進(jìn)入pH8.9pH8.9的小孔徑分離膠后，甘氨酸離子的的小孔徑分離膠后，甘氨酸離子的 電泳遷移率很快超過(guò)蛋白質(zhì)，高電勢(shì)梯度也隨之消失，電泳遷移率很快超過(guò)蛋白質(zhì)，高電勢(shì)梯度也隨之消失， 在均一電勢(shì)梯度和在均一電勢(shì)梯度和pHpH的分離膠中，由于各種蛋白質(zhì)的等的分離膠中，由于各種蛋白質(zhì)的等 電點(diǎn)不同，所帶電荷量不同，在電場(chǎng)中所受引力亦不同，電點(diǎn)不同，所帶電荷量不同，在電場(chǎng)中所受引力亦不同， 經(jīng)過(guò)一定時(shí)間電泳，各種蛋白質(zhì)就以一定順序排列成一經(jīng)過(guò)一定時(shí)間電泳，各種蛋白質(zhì)就以一定順序排列成一 條條蛋白質(zhì)區(qū)帶。條條蛋白質(zhì)區(qū)帶。 由于分離膠的孔徑較小，分子量大小或分子形狀不同的由于分離膠的孔徑

42、較小，分子量大小或分子形狀不同的 蛋白質(zhì)通蛋白質(zhì)通 過(guò)分離膠時(shí)，所受阻滯的程度不同，因而；過(guò)分離膠時(shí)，所受阻滯的程度不同，因而； 遷移率不同而被分離。此處分子篩效應(yīng)是指樣品通過(guò)一遷移率不同而被分離。此處分子篩效應(yīng)是指樣品通過(guò)一 定孔徑的凝膠時(shí)，受阻滯的程度不同，小分子走在前面，定孔徑的凝膠時(shí)，受阻滯的程度不同，小分子走在前面， 大分子走在后面，各種蛋白質(zhì)按分子大小順序排列成相大分子走在后面，各種蛋白質(zhì)按分子大小順序排列成相 應(yīng)的區(qū)帶。應(yīng)的區(qū)帶。 1 1不連續(xù)垂直板狀凝膠電泳不連續(xù)垂直板狀凝膠電泳 2. 2. 不連續(xù)垂直柱狀凝膠電泳不連續(xù)垂直柱狀凝膠電泳 主要討論垂直板狀不連續(xù)電泳操作主要討論垂

43、直板狀不連續(xù)電泳操作 (1)(1)裝置裝置 垂直板凝膠電泳的裝置是由電泳儀和電泳槽構(gòu)成。它垂直板凝膠電泳的裝置是由電泳儀和電泳槽構(gòu)成。它 的膠板則是由二塊正方形或長(zhǎng)方形、大小適中、性質(zhì)的膠板則是由二塊正方形或長(zhǎng)方形、大小適中、性質(zhì) 均一的玻璃板，三種不同厚度均一的玻璃板，三種不同厚度( (分別為分別為2 2、3 3、4mm)4mm)的的 塑料條或硅橡膠條和一個(gè)塑料條或硅橡膠條和一個(gè)“梳子梳子”組成。組成。 二者柱狀凝膠電泳相比，垂直板凝膠電泳有表面積大、二者柱狀凝膠電泳相比，垂直板凝膠電泳有表面積大、 溫度好控制、凝膠易取出、可作雙向電泳、在同一膠溫度好控制、凝膠易取出、可作雙向電泳、在同一膠

44、 板上一次能檢測(cè)多個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn)。板上一次能檢測(cè)多個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn)。 膠板模型的粘合膠板模型的粘合 在干凈玻璃板的三條邊上在干凈玻璃板的三條邊上( (距邊緣距邊緣5mm5mm處處) )，用去掉針頭，用去掉針頭 的的5 5毫升注射器連續(xù)擠下高真空硅酮油，使其成不間斷毫升注射器連續(xù)擠下高真空硅酮油，使其成不間斷 的線狀，或涂上薄薄的一層醫(yī)用凡士林。接著把塑料條的線狀，或涂上薄薄的一層醫(yī)用凡士林。接著把塑料條 ( (寬寬5mm)5mm)小心地壓在油脂上，讓油脂在塑料條與玻璃板小心地壓在油脂上，讓油脂在塑料條與玻璃板 之間形成一透明薄層之間形成一透明薄層( (1mm)1mm)。油脂不宜涂得太多，其。油脂不宜

45、涂得太多，其 寬度亦應(yīng)小于塑料條。然后在塑料條上用上述方法加一寬度亦應(yīng)小于塑料條。然后在塑料條上用上述方法加一 層油脂，隨即將另一塊玻璃板壓在其上，用夾子夾緊。層油脂，隨即將另一塊玻璃板壓在其上，用夾子夾緊。 A.A.加入分離膠：加入分離膠： 使凝膠溶液沿玻璃壁來(lái)回使凝膠溶液沿玻璃壁來(lái)回 移動(dòng)慢慢注入，謹(jǐn)防產(chǎn)生氣泡。移動(dòng)慢慢注入，謹(jǐn)防產(chǎn)生氣泡。玻璃壁玻璃壁 B. B. 加入濃縮膠：加入濃縮膠： 當(dāng)分離膠凝聚后，小心地吸去上層溶液，再用濾紙條當(dāng)分離膠凝聚后，小心地吸去上層溶液，再用濾紙條 吸干。接著用加分離膠的方法加濃縮膠，加濃縮膠到吸干。接著用加分離膠的方法加濃縮膠，加濃縮膠到 離玻璃板頂約離

46、玻璃板頂約1 1厘米處時(shí)，把與凝膠厚度一樣的厘米處時(shí)，把與凝膠厚度一樣的“梳子梳子” 插入其頂部。待膠完全聚合后，拿出插入其頂部。待膠完全聚合后，拿出“梳子梳子”，于是，于是 在聚丙烯酰胺膠中便鑄出若干上樣品的凹穴。在聚丙烯酰胺膠中便鑄出若干上樣品的凹穴。 試劑名稱試劑名稱 分離膠分離膠 (8%)濃縮膠濃縮膠 (4%) 分離膠緩沖液分離膠緩沖液1.25 ml / 濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液 / 0.5 ml 水水2.4 ml 1.2 ml TEMED 10 ul 5 ml AP 60 ul 25 ul 聚丙烯酰胺凝膠配制聚丙烯酰胺凝膠配制 A. 樣品處理樣品處理適量濃度蛋白溶液加入適量濃度蛋白溶

47、液加入1上樣緩沖液混上樣緩沖液混 勻，勻，95水浴中處理水浴中處理5分鐘。分鐘。 B. 加樣加樣 用微量進(jìn)樣器取用微量進(jìn)樣器取10-15 l上述混合液，通過(guò)電極上述混合液，通過(guò)電極 緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。 C. 電泳電泳將電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接，將電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接， 打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，開(kāi)始時(shí)電流為打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，開(kāi)始時(shí)電流為10 mA，待樣品進(jìn)入分，待樣品進(jìn)入分 離膠后，將電流調(diào)至離膠后，將電流調(diào)至20-30 mA，當(dāng)溴酚藍(lán)染料距硅膠框，當(dāng)溴酚藍(lán)染料距硅膠框 1 cm時(shí)，停止電泳，關(guān)閉電源。時(shí)

48、，停止電泳，關(guān)閉電源。 A.A.制備樣品時(shí)，離子強(qiáng)度不能太高。否則電導(dǎo)太大，制備樣品時(shí)，離子強(qiáng)度不能太高。否則電導(dǎo)太大， 不能在樣品部分產(chǎn)生電壓梯度，從而降低濃縮效應(yīng)，不能在樣品部分產(chǎn)生電壓梯度，從而降低濃縮效應(yīng)， 甚至使樣品泳動(dòng)緩慢。電泳開(kāi)始后，樣品液應(yīng)在甚至使樣品泳動(dòng)緩慢。電泳開(kāi)始后，樣品液應(yīng)在5-5- 1010分鐘內(nèi)進(jìn)入凝膠。指示染料進(jìn)膠緩慢，是樣品的分鐘內(nèi)進(jìn)入凝膠。指示染料進(jìn)膠緩慢，是樣品的 鹽濃度鹽濃度( (離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度) )太高的表現(xiàn)。對(duì)含高鹽濃度的樣太高的表現(xiàn)。對(duì)含高鹽濃度的樣 品須在電泳前進(jìn)行透析去鹽，使其電導(dǎo)值低于分離品須在電泳前進(jìn)行透析去鹽，使其電導(dǎo)值低于分離 膠，這才

49、能達(dá)到預(yù)期的濃縮效果。膠，這才能達(dá)到預(yù)期的濃縮效果。 B B樣品液中的沉淀和混濁等物質(zhì)必須除去。不然會(huì)有樣品液中的沉淀和混濁等物質(zhì)必須除去。不然會(huì)有 許多物質(zhì)留在凝膠界面上，堵塞凝膠篩孔，影響樣品許多物質(zhì)留在凝膠界面上，堵塞凝膠篩孔，影響樣品 的分離。當(dāng)樣品裝載量與樣品溶解度不相適應(yīng)時(shí)就的分離。當(dāng)樣品裝載量與樣品溶解度不相適應(yīng)時(shí)就 會(huì)在電泳過(guò)程中連續(xù)發(fā)生沉淀、溶解結(jié)果導(dǎo)致拖尾會(huì)在電泳過(guò)程中連續(xù)發(fā)生沉淀、溶解結(jié)果導(dǎo)致拖尾 現(xiàn)象的產(chǎn)生?，F(xiàn)象的產(chǎn)生。 C C當(dāng)樣品溶液有聚合或不溶解情況發(fā)生時(shí)，可在當(dāng)樣品溶液有聚合或不溶解情況發(fā)生時(shí)，可在 8mol/L8mol/L尿素系統(tǒng)中電泳，在此系統(tǒng)中遷移率往往會(huì)

50、低尿素系統(tǒng)中電泳，在此系統(tǒng)中遷移率往往會(huì)低 一些。一些。 電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下膠框，用凝膠鏟電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下膠框，用凝膠鏟 小心撬開(kāi)短玻璃板，小心撬開(kāi)短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記， 在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，加入染色液染色在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，加入染色液染色1-2 h， 再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計(jì)算相對(duì)再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計(jì)算相對(duì) 遷移率遷移率. A A固定：固定： 把取出的凝膠柱浸泡在把取出的凝膠柱浸泡在7 7醋酸或醋酸或12.512.5三氯三氯 醋酸水溶液中幾分鐘到幾小時(shí)，以固定其中含醋酸

51、水溶液中幾分鐘到幾小時(shí)，以固定其中含 有的蛋白質(zhì)組分。有時(shí)也可把凝膠柱浸泡在用有的蛋白質(zhì)組分。有時(shí)也可把凝膠柱浸泡在用 上述溶液配制的染料混合溶液中，使固定與染上述溶液配制的染料混合溶液中，使固定與染 色同時(shí)進(jìn)行。色同時(shí)進(jìn)行。 其一是用氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、阿爾辛藍(lán)、其一是用氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、阿爾辛藍(lán)、 過(guò)碘酸過(guò)碘酸- -schiffschiff試劑以及銀試劑檢測(cè)；試劑以及銀試劑檢測(cè)； 其二是用熒光標(biāo)比和放射性同性素標(biāo)記法；其二是用熒光標(biāo)比和放射性同性素標(biāo)記法； 其三是特殊試劑染色法其三是特殊試劑染色法. . B B染色：染色： 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)( (包括糖蛋白和酶包括糖蛋白和酶) )的譜帶可用三

52、種方法的譜帶可用三種方法 染色檢測(cè)。染色檢測(cè)。 各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)， 按下式計(jì)算相對(duì)遷移率按下式計(jì)算相對(duì)遷移率mR: 蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm) 溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離(cm) 相對(duì)遷移率相對(duì)遷移率mR= 2 2不連續(xù)垂直柱狀凝膠電泳不連續(xù)垂直柱狀凝膠電泳 (1)(1)裝置裝置 不連續(xù)柱凝膠電泳裝置有三部分組成即，電泳槽，玻不連續(xù)柱凝膠電泳裝置有三部分組成即，電泳槽，玻 璃管和電泳儀。璃管和電泳儀。 電泳槽：電泳槽分為上下兩層，其形狀均為圓筒形。電泳槽：電泳槽分為上下兩層，

53、其形狀均為圓筒形。 下層無(wú)特殊設(shè)備，上層底板中央裝有鉑金絲電極，在其下層無(wú)特殊設(shè)備，上層底板中央裝有鉑金絲電極，在其 周圍以相等距離打周圍以相等距離打1010個(gè)小孔在孔中插入玻璃管后，設(shè)個(gè)小孔在孔中插入玻璃管后，設(shè) 法使溶液不發(fā)生滲漏現(xiàn)象。法使溶液不發(fā)生滲漏現(xiàn)象。 玻璃管：一般內(nèi)徑玻璃管：一般內(nèi)徑5-75-7毫米，外徑毫米，外徑7-97-9毫米，長(zhǎng)度毫米，長(zhǎng)度1010 厘米左右，玻璃的性質(zhì)均一，呈弱堿性，管口用金鋼厘米左右，玻璃的性質(zhì)均一，呈弱堿性，管口用金鋼 砂磨平，要切忌火燒，否則剝膠困難砂磨平，要切忌火燒，否則剝膠困難 電泳儀：它是一種恒壓恒流的電源裝置，其電泳儀：它是一種恒壓恒流的電源

54、裝置，其 量程通常為量程通常為600600伏、伏、100毫安。毫安。 瓊脂糖電泳是用瓊脂糖或優(yōu)質(zhì)瓊脂粉作支持物的一種瓊脂糖電泳是用瓊脂糖或優(yōu)質(zhì)瓊脂粉作支持物的一種 電泳方法。用瓊脂糖膠分離雙鏈電泳方法。用瓊脂糖膠分離雙鏈DNADNA時(shí)，其遷移率大小，時(shí)，其遷移率大小， 主要與樣品的分子量有關(guān)，主要與樣品的分子量有關(guān)，而與核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)以及而與核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)以及 堿基的組成無(wú)關(guān)。堿基的組成無(wú)關(guān)。瓊脂糖電泳對(duì)于分離或分析天然瓊脂糖電泳對(duì)于分離或分析天然DNADNA， 包括不同形式的質(zhì)粒包括不同形式的質(zhì)粒DNADNA即閉環(huán)即閉環(huán)DNA(cc-DNA)DNA(cc-DNA)、開(kāi)環(huán)、開(kāi)環(huán) DNA(oc-

55、DNA)DNA(oc-DNA)和線性和線性DNA(1-DNA)DNA(1-DNA)以及不同分子量的核以及不同分子量的核 酸片段都有效。酸片段都有效。 是電荷效應(yīng)及分子篩效應(yīng)是電荷效應(yīng)及分子篩效應(yīng)( (分離小分子物質(zhì)時(shí)無(wú)此效分離小分子物質(zhì)時(shí)無(wú)此效 應(yīng)應(yīng)) )。當(dāng)瓊脂糖介質(zhì)的濃度較低時(shí)，膠的篩孔較大，適。當(dāng)瓊脂糖介質(zhì)的濃度較低時(shí)，膠的篩孔較大，適 用于分離大分子用于分離大分子(70bp(70bp以上以上) )的核酸或蛋白質(zhì)及其復(fù)合的核酸或蛋白質(zhì)及其復(fù)合 物。物。 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)- -單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single Strand Conformation Polymo

56、rphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP） 1.1.緩沖濃的配制緩沖濃的配制 在配制緩沖液時(shí)，不論那一種都須加適量的在配制緩沖液時(shí)，不論那一種都須加適量的EDTAEDTA， 以便除去二價(jià)的金屬離子。另外，硼酸與瓊脂糖易形以便除去二價(jià)的金屬離子。另外，硼酸與瓊脂糖易形 成復(fù)合物，因此一般成復(fù)合物，因此一般TrisTris硼酸緩沖液硼酸緩沖液使用較少。使用較少。 稱取一定量的瓊脂糖加入玻璃瓶中，按所需凝膠的濃度稱取一定量的瓊脂糖加入玻璃瓶中，按所需凝膠的濃度 加入適量的電極緩沖液，用棉塞將瓶口塞緊，置消毒鍋加入適

57、量的電極緩沖液，用棉塞將瓶口塞緊，置消毒鍋 4.44.410104 4PaPa處理處理1515分鐘，或在沸水浴中加熱熔化約分鐘，或在沸水浴中加熱熔化約0.50.5小小 時(shí)。待該溶液冷卻到時(shí)。待該溶液冷卻到6060左右，加入溴化乙錠左右，加入溴化乙錠( (取自用水取自用水 配制的配制的10mg/m110mg/m1的貯備液，的貯備液，44存放存放) )，最后濃度，最后濃度0.5ug/m10.5ug/m1。 搖勻后，即可用滴管吸取此液，封閉干凈玻板搖勻后，即可用滴管吸取此液，封閉干凈玻板(10(1015cm)15cm) 與?？虻倪B接處，以形成一個(gè)長(zhǎng)方形的模型。然后將與模框的連接處，以形成一個(gè)長(zhǎng)方形的

58、模型。然后將 “梳子梳子”固定于玻板適當(dāng)位置上，接著將凝膠溶液注入固定于玻板適當(dāng)位置上，接著將凝膠溶液注入 模型中，使其厚度為模型中，使其厚度為3mm3mm。室溫放置。室溫放置30-4530-45分鐘后，小心分鐘后，小心 地移走地移走“梳子梳子”和?？?，即制成了瓊脂糖凝膠板。和模框，即制成了瓊脂糖凝膠板。 將瓊脂糖凝膠板平移至電泳槽中，注入緩沖液將瓊脂糖凝膠板平移至電泳槽中，注入緩沖液( (液面高液面高 于膠面于膠面) )，接通電源，電壓應(yīng)低一點(diǎn)，在負(fù)極端每平方，接通電源，電壓應(yīng)低一點(diǎn)，在負(fù)極端每平方 厘米的樣品孔（深厘米的樣品孔（深3mm)3mm)中可加核酸樣品中可加核酸樣品10-50ug1

59、0-50ug，體，體 積可達(dá)積可達(dá)200ul200ul。在樣品中應(yīng)先加入示蹤染料。在樣品中應(yīng)先加入示蹤染料(0.2(0.2溴酚藍(lán)溴酚藍(lán) 和和4040蔗糖混合水溶液蔗糖混合水溶液) )。隨之電壓可調(diào)高一點(diǎn)，當(dāng)樣。隨之電壓可調(diào)高一點(diǎn)，當(dāng)樣 品進(jìn)入凝膠后，使其維持在品進(jìn)入凝膠后，使其維持在6v/cm6v/cm左右當(dāng)溴酚藍(lán)移至左右當(dāng)溴酚藍(lán)移至 陽(yáng)極端時(shí)，關(guān)閉電源。陽(yáng)極端時(shí)，關(guān)閉電源。 取出凝膠板，在取出凝膠板，在254nm254nm紫外燈下觀察。核酸存在的位紫外燈下觀察。核酸存在的位 置呈現(xiàn)紅色熒光區(qū)帶，照相時(shí)，要加紅色濾光片。置呈現(xiàn)紅色熒光區(qū)帶，照相時(shí)，要加紅色濾光片。 SDSSDS即十二烷基硫酸鈉

60、即十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate)(Sodium Dodecyl Sulfate)是陰是陰 離子表面活性劑，它能以一定的比例和蛋白質(zhì)結(jié)合，形離子表面活性劑，它能以一定的比例和蛋白質(zhì)結(jié)合，形 成一種成一種SDS-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。此復(fù)合物可用具有蛋白質(zhì)復(fù)合物。此復(fù)合物可用具有SDSSDS聚丙聚丙 烯酰胺凝膠烯酰胺凝膠( (包括連續(xù)的和不連續(xù)的系統(tǒng)包括連續(xù)的和不連續(xù)的系統(tǒng)) )電泳進(jìn)行分離，電泳進(jìn)行分離， 通常把這種電泳稱為通常把這種電泳稱為SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳( (簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱 SDS-PAGE)SDS-PAGE)。 用途：是用途：是分離