基因打靶(精美)講述

1、基因打靶 QQ:947645776 目錄 一、簡介 二、什么是基因打靶 三、優(yōu)點 四、基因打靶的原理 五、基因打靶步驟 六、基因打靶技術(shù)的應(yīng)用 一、簡介： 在歷經(jīng)近20年的推廣和應(yīng)用后, 基因打靶技 術(shù)終于獲得諾貝爾獎評審委員會的關(guān)注和肯定。 2007年 10月8日, 美國科學(xué)家卡佩奇和史密斯、英國科學(xué)家埃文斯 因為在利用胚胎干細(xì)胞對小鼠基因進(jìn)行定向修飾原理方面 的系列發(fā)現(xiàn)分享了2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎?；虼?靶技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用革命性地改變了現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的 面貌, 并導(dǎo)致了生物醫(yī)學(xué)研究各個領(lǐng)域中的許多突破性進(jìn) 展。 三巨人 卡佩奇在哈佛時就是一位成果 豐富的研究者，他發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致 蛋

2、白合成的分子機制。當(dāng)他于 1973年在猶他大學(xué)建立實驗室 時，便試圖將分子基因?qū)W引入 到對動物細(xì)胞的研究，以便獲 悉如何掌控這些細(xì)胞里的基因。 卡佩奇于1977年開始一系列實 驗室研究，這些研究展現(xiàn)了對 動物細(xì)胞進(jìn)行基因打靶的技術(shù)， 并在1989年成功對一只老鼠進(jìn) 行基因打靶。 Mario R. Capecchi 史密斯1925年出生在英國，后獲 得美國國籍。史密斯1951年獲得 牛津大學(xué)生物化學(xué)博史密斯和卡 佩基幾乎同時對“基因靶向”技 術(shù)做出了奠基性貢獻(xiàn)。他目前的 研究方向主要集中在兩個方面： 一是對異形基因進(jìn)行修正，另外 一個便是利用人類基因病變構(gòu)造 動物模型，以發(fā)現(xiàn)新的疾病治療 方法。

3、多年來，奧利弗-史密西 斯教授及其助手深入研究了“基 因打靶”的具體操作方法，并借 助這項技術(shù)治療地中海貧血癥。 Oliver Smithies 埃文斯1941年出生在英國， 1963年從劍橋大學(xué)畢業(yè)后，進(jìn) 入倫敦大學(xué)學(xué)院學(xué)習(xí)，獲得解 剖學(xué)和胚胎學(xué)博士學(xué)位。1978 年，他返回劍橋大學(xué)工作。3 年后，他和同事從小鼠胚胎中 第一次成功分離出未分化的胚 胎干細(xì)胞。這為“基因靶向” 技術(shù)提供了施展本領(lǐng)的空間。 如今，埃文斯在英國加的夫大 學(xué)擔(dān)任哺乳動物遺傳學(xué)教授。 Sir Martin J. Evans 基因打靶（gene targeting）是指外源DNA與受體 細(xì)胞染色體DNA上的同源序列之間發(fā)

4、生重組，并整 合在預(yù)定位點，改變細(xì)胞遺傳特性的方法。 建立在胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES細(xì) 胞）與同源重組技術(shù)基礎(chǔ)之上的基因打靶技術(shù)是 一種定向改變生物活體遺傳信息的實驗手段。 三、優(yōu)點： 基因打靶所適應(yīng)的細(xì)胞既可以是原核細(xì)胞，也可以是真 核細(xì)胞； 基因打靶能把外源基因引入染色體DNA 的特定片段上； 在設(shè)計合理的情況下基因打靶可對宿主細(xì)胞染色體基因 進(jìn)行精細(xì)的改造; 基因打靶后被擊中的基因或新引入的基因隨染色體DNA 的 復(fù)制而穩(wěn)定復(fù)制。 進(jìn)行基因打靶，首先要設(shè)計和合成一個將要導(dǎo)人 靶細(xì)胞的靶載體(targeting vector)。該載體不 僅含有需要插入的DN

5、A序列，其兩端還含有與靶基 因座上的序列相同的核苷酸片段即同源重組指 導(dǎo)序列。將此載體用基因轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)人靶細(xì) 胞通過外源載體和內(nèi)源靶位點相同的核苷酸序 列之間的同源重組(homologous recombination， HR)，使外源DNA定點整合到靶細(xì)胞的特定的基因 座上。 生物界同源重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，為基因打靶奠定了堅實的理 論基礎(chǔ)，而胚胎干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)了基因打靶的廣 泛應(yīng)用。 同源重組(Homologous recombination)又稱一般性重組或 非特異性重(General recombination)，是指相似的DNA交 換遺傳信息的過程, 外源DNA片段可與宿主基因組

6、的相應(yīng) 片段發(fā)生交換（即重組）。ES細(xì)胞是一類具有在體外培養(yǎng) 條件下保持未分化狀態(tài)的增殖能力及分化為多種細(xì)胞類型 的細(xì)胞。 1.1. 重組基因載體的構(gòu)建重組基因載體的構(gòu)建 2. 2. 轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 3.3. 篩選篩選 4.4. 鑒定鑒定 1.1.重組基因載體的構(gòu)建重組基因載體的構(gòu)建 把目的基因和同源重組指導(dǎo)序列重組到帶有標(biāo)記基因的 載體上?；蛲粗亟M的發(fā)生依賴于同源序列的長度， 目前認(rèn)為3O40bp的同源序列長度將是發(fā)生同源重組的 保險線，重組率與同源序列長度呈正比，一般情況下同 源重組指導(dǎo)序列為基因組DNA而不用cDNA，以免造成基 因組缺失或其他改變。 基因打靶載體包括載體骨

7、架、靶基因同源序列和突變序 列及選擇性標(biāo)記基因等。 基因打靶載體類型： 基因插入型載體(Gene-insertion vector)：插入型載 體中與靶基因同源的區(qū)段中含有特異的酶切位點，線 性化后，同源重組導(dǎo)致基因組序列的重復(fù)，從而干擾 了目標(biāo)基因的功能。 基因置換型載體(Genereplacement vector)：置換 型載體進(jìn)行線性化的酶切位點在引導(dǎo)序列和篩選基因 外側(cè)，線性化后，同源重組使染色體DNA序列為打靶載 體序列替換。大多數(shù)基因敲除突變都采用置換型載體大多數(shù)基因敲除突變都采用置換型載體 進(jìn)行基因打靶。進(jìn)行基因打靶。 2.2.轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 外源DNA導(dǎo)人的方式主要

8、有顯微注射法、電穿孔法、逆轉(zhuǎn) 錄病毒法、DNA-磷酸鈣共沉淀法等。目前應(yīng)用最廣的是顯 微注射法。 顯微注射每次只能注射一個細(xì)胞； 電穿孔法可同時使許多細(xì)胞得到轉(zhuǎn)染。Mansour等研究發(fā) 現(xiàn)電穿孔可使1的ES細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染； 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法利用某些病毒與組織細(xì)胞有特異的親合 力，可用于時空特異性基因打靶，在人類疾病的基因治療 方面具有較大的發(fā)展?jié)摿Α?正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)(positive-negative-selection, PNS)。 構(gòu)建載體時，在靶基因的同源區(qū)序列中插入正選擇標(biāo)記， 在同原序列的3和5兩個末端接上負(fù)選擇標(biāo)記。 同源重組時，只有載體的同源區(qū)以內(nèi)以內(nèi)部分發(fā)生重組，同源 區(qū)以外

9、部分將被切除 隨機整合時，是在載體的兩端將整個載體連入染色體內(nèi)。 正選擇基因多為新霉素抗性基因（neo）基因，位于同源 區(qū)內(nèi)，其在隨機整合和同源重組中均可正常表達(dá) 負(fù)選擇基因常用單純孢疹病毒的胸腺尿嘧啶激酶基因 （HSV-tk），在靶基因同源區(qū)之外在靶基因同源區(qū)之外，位于載體的3末端， 以藥物G148和GANG（丙氧鳥苷）作雙重選擇。neo 基因的 產(chǎn)物使細(xì)胞具有G 418抗性而HSV一tk， 基因的產(chǎn)物則 使內(nèi)氧鳥苷變成毒性核苷酸從而致死。用G418篩選所有 能表達(dá)neo 基因的細(xì)胞然后用GANG淘汰所有H5 一旗f 常表達(dá)的細(xì)胞剩下的細(xì)胞為命中的細(xì)胞。 無毒的丙氧鳥苷（GANC） 毒性核苷

10、酸 殺死細(xì)胞 腺苷激酶蛋白 4.鑒定 觀察被擊中細(xì)胞的生物學(xué)特性并進(jìn)行分子生物學(xué)檢測。 可以用特異PCR方法鑒定，PCR 引物一端以基因組DNA 的特 定基因座為模板，另一端以導(dǎo)人的外源基因為模板這樣 保證擴增后的片段為同源重組產(chǎn)生的特殊片段。對經(jīng)PCR鑒 定的克隆用Southern雜交產(chǎn)生特殊帶譜的方法來進(jìn)一步確 定同源重組克隆。 六、基因打靶技術(shù)的應(yīng)用 基因打靶技術(shù)與小鼠胚胎干細(xì)胞技術(shù)結(jié)合，產(chǎn)生了近千種 轉(zhuǎn)基因小鼠品系對于大動物的胚胎干細(xì)胞還沒有成功 的報道，但已成功的用培養(yǎng)的體細(xì)胞進(jìn)行基因打靶。PPI 公司的研究人員在原代綿羊和豬細(xì)胞中進(jìn)行了基因打 靶并通過體細(xì)胞核移植，獲得了帶有目的基

11、因的克隆羊。 基因打靶在植物上的應(yīng)用研究才剛起步。Park JM等人對 擬南芥ADL1基因進(jìn)行了基因敲除。Ruf S等對煙草進(jìn)行基 因打靶發(fā)現(xiàn)了一個新的與光系統(tǒng)I相關(guān)的基 。 基因打靶技術(shù)在微生物領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。在80年 代利用酵母35S rDNA 作為同源序列將外源基因捅入到 酵母rDNA 區(qū)，使外源基因得到穩(wěn)定表達(dá)。在隨后的研究 中人們利用酵母的rDNA作為同源序列構(gòu)建了一系列高轉(zhuǎn) 化效率、高拷貝插入及高度表達(dá)的打靶載體。在寄生蟲學(xué) 的研究中也應(yīng)用了基因打靶技術(shù)，利用此技術(shù)制備利什曼 原蟲的減毒活蟲疫苗已進(jìn)入臨床前期研究。 基因打靶技術(shù)是近十余年發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)。 它克服了隨機整合的