MXC對小鼠離體培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響(一).doc

1、MXC 對小鼠離體培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響(一)作者：王寶平，馬向東，馬佳佳，陳必良【摘要】目的：研究甲氧滴滴涕（MXC）對顆粒細(xì)胞凋亡的影響，探討 MXC 對雌性小鼠性腺毒性的作用機(jī)制 .方法：以孕馬血清（ PMSG）處理的雌性昆明小鼠為模型 ,制備顆粒細(xì)胞懸液 ,以不同濃度的 MXC（ 1.25,2.50，5.00 和 10.00 g/mL）對其作用 24，48h 后,應(yīng)用 TUNEL法及流式細(xì)胞術(shù) ,檢測 MXC 對離體培養(yǎng)顆粒細(xì)胞凋亡的影響 .結(jié)果：體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞存在自發(fā)性凋亡，對照組和MXC不同濃度實(shí)驗(yàn)組的顆粒細(xì)胞都有不同程度的體積變小、細(xì)胞濃縮、變圓、離壁等類似凋亡的特征 .

2、MXC1.25g/mL濃度組凋亡的顆粒細(xì)胞最少,其余 3 個實(shí)驗(yàn)組隨MXC 濃度的升高 ,凋亡細(xì)胞也逐漸增多 ,MXC10.00 g/mL濃度組的顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著高于對照組和其他各組(P0.05).采用 3末端原位標(biāo)記法在細(xì)胞中檢測到棕色深染的凋亡顆粒細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示處于早期凋亡的細(xì)胞所占百分率明顯升高 (最高達(dá) 53.5%).結(jié)論：環(huán)境污染物高濃度 MXC 可抑制除血清后體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞生長 ,導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡 ,它的作用是雙向的并具有劑量依賴性 . 【關(guān)鍵詞】甲氧滴滴涕 ;卵泡顆粒細(xì)胞 ;細(xì)胞凋亡 ;小鼠【Abstract】AIM:Toinvestigatetherela

3、tionshipbetweenfemalegonadtoxicityofmethoxychlor(MXC)onmouseandtheapoptosisofgranulosacells.METHODS:Pregnantsedasmodelsandgranulosacellsuspensionswereprepared.MXC(1.25,2.50，5.00，10.00 g/mL)wasaddedtoculturedcellsafter24,48hofincubation.Theeffectof MXConapoptosisofgranulosacellswasassessedbyTUNELmeth

4、odandflowcyt ometry.RESULTS:Therewasspontaneousapoptosisintheculturedgranulosacesacacellsincreasedgraduallyinother3testgroupswiththeincreasingconcentratioin10.00 g/mLgroupthanthatinothergroups(P0.05)poptoticsignalswerede.AtectedbyDNA3.CONCLUSION:AhigherconcentrationofMXCmayserveasanimportantendocrin

5、edisruptingchemical(EDC),mediatingmousegranulosecellapoptosisinvitroafterFBSwasremovedfrommedium.Theeffectisbidirectionalandconcentrationdependent.【Keywords】methoxychlor;granulosecell;apoptosis;mouse0 引言甲氧滴滴涕 (methoxychlor,MXC)是一種被人們主動投放于環(huán)境中的數(shù)量最大、毒性最廣的化學(xué)物質(zhì)，因其殺蟲效果明顯，被人們廣泛應(yīng)用于水果，蔬菜和園林中殺蟲 .近年來，MXC的生殖毒性作

6、用不斷被發(fā)現(xiàn) 1,有研究表明長期接觸MXC可導(dǎo)致生育能力下降 2-3和異常胚胎細(xì)胞的形成 4，但其生殖細(xì)胞的毒性作用機(jī)制仍不清楚，有關(guān)是否對卵泡顆粒細(xì)胞的生存具有影響的報(bào)道少見.本研究以小鼠離體培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞為模型，觀察具有雌激素樣作用的環(huán)境污染物MXC對顆粒細(xì)胞存活的影響，以探討MXC的雌性生殖細(xì)胞毒性作用機(jī)制.1 材料和方法11 材料健康，尚未性成熟的雌性昆明小鼠 40 只，體質(zhì)量 1822g（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心） ；甲氧滴滴涕（批號： 49054，美國 Sigma 公司）；DMEM/F12 干粉細(xì)胞培養(yǎng)基， 無脂肪酸牛血清白蛋白 （BSA）（美國 Gibcol 公司）；已二胺四乙酸

7、（ EDTA）、孕馬血清 (PMSG）（天津生物制品公司）；無 Ca2+,Mg2+磷酸鹽緩沖液（ PBS）（北京中杉金橋公司）；3末端原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、多聚賴氨酸、DAB 顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司 )；流式細(xì)胞儀（美國 EPICS公司） . 12 方法121 小鼠顆粒細(xì)胞的制備及原代培養(yǎng)參照文獻(xiàn) 5的方法制備顆粒細(xì)胞，選取小鼠，皮下注射 PMSG， 10U/只，飼養(yǎng)溫度 22， 12h 光照，12h 黑暗，允許自由飲水和攝食 .48h 后頸椎脫臼處死， 無菌條件下迅速取出雙側(cè)卵巢，用 PBS（-）清洗 3 次，在體視顯微鏡下除去卵巢周圍包膜及脂肪組織 .將卵巢置于培養(yǎng)液中，

8、 37孵育15min.然后在解剖鏡下用不銹鋼針刺破排卵前卵泡使顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞釋放出來，加入 1g/L 透明質(zhì)酸酶消化使顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞分離，過 200 目篩網(wǎng)， 1000r/min 離心 5min.棄去上清后，用培養(yǎng)液（含0.5g/LBSA； 5g/L 蔗糖； 6.8mmol/LEDTA），垂懸細(xì)胞沉淀.3750mL/LCO2孵箱中孵育 15min，然后用培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞 3 次，1000r/min 離心 5min.采用文獻(xiàn) 6的方法用臺盼藍(lán)排斥法檢查活細(xì)胞比率（ 85%左右），細(xì)胞用一定量的無血清培養(yǎng)基（含100U/L 青霉素； 100g/mL鏈霉素； 0.5g/LBSA）稀釋并用血細(xì)胞

9、計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，將細(xì)胞分別接種于兩個 250mL 無菌的培養(yǎng)瓶中 .置于 3750mL/LCO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng) .122 實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞分為對照組：含 0.5g/LBSA的 DMED/F12細(xì)胞培養(yǎng)液和四個 MXC 不同濃度實(shí)驗(yàn)組（ M1M4 組）：MXC 含量分別為1.25,2.50,5.00，10.00 g/mL,每組均設(shè) 4 個重復(fù) .12 3TUNEL 法檢測顆粒細(xì)胞凋亡將顆粒細(xì)胞接種于鋪有蓋玻片的100mm 培養(yǎng)皿，孵育 24h 后培養(yǎng)液換為不同終濃度的 MXC應(yīng)用液，分別于第 12,24 和 48h 后收集顆粒細(xì)胞爬片，用 40g/L 多聚甲醛固定 1h，置于新鮮配置 3

10、0mL/LH2O2中，室溫處理 10min，然后加入標(biāo)記緩沖液（ LabelingBuffer）20L/片，以保持切片濕潤 .置樣品于濕盒中， 37標(biāo)記 2h.加封閉液 50L/片，室溫 30min，甩掉封閉液，不洗 .加入 TUNEL反應(yīng)混合物， 37濕盒中反應(yīng)1h，再加入稀釋后的SABC50L/片,37反應(yīng) 30min.DAB 顯色液顯色，自來水沖洗，蘇木素淺染，脫水，透明，封片（每次反應(yīng)間隔均用 TBS洗 3 次） .陰性對照為在標(biāo)記反應(yīng)混合物中不加脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（ TdT酶），其余操作步驟相同 .病理圖像分析儀觀察 (陽性反應(yīng)細(xì)胞核呈棕黃色 ,顆粒清晰，定位準(zhǔn)確；陰性反應(yīng)細(xì)胞

11、呈蘭紫色 ),拍照 ,鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù) 10 個視野細(xì)胞 ,計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)目的比例,求其均值即為卵巢細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosisindex,AI).124AnnexinV/PI 雙染流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡率將250mL 培養(yǎng)瓶中的顆粒細(xì)胞以1106個/ 瓶轉(zhuǎn)接種于 50mL 無菌的培養(yǎng)瓶中，孵育 24h后培養(yǎng)液換為不同終濃度的MXC 應(yīng)用液， 24，48h 后收集卵巢顆粒細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶中的原培養(yǎng)液棄去 ,加入少量的 2.5g/L 胰酶 ,清洗后棄去 ; 再加入適量的 2.5g/L 胰酶 ,在倒置顯微鏡下觀察 ,見細(xì)胞稍變圓時 ,立即豎起培養(yǎng)瓶 ,停止胰酶作用 ,棄去胰酶 ;每孔各加入 1mL 的磷酸鹽緩沖液(PBS),用吸管反復(fù)吹打 ,直至細(xì)胞成單細(xì)胞懸液為止 ,移入離心管中，1000r/min 離心 5min，棄上清液 .用 4預(yù)冷過的 750mL/L 乙醇固定 ,4 保存 ,至少固定 18h,用時