免疫分型基礎(chǔ)介紹

1、近年來(lái)白血病的免疫分型已成為診斷血液惡性腫瘤不可缺少的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。早年曾用過(guò)的熒光顯微鏡或APAAP方法基本被廢棄。國(guó)際上公認(rèn)的通用的方法是流式細(xì)胞術(shù)（ FCM ）。流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型是 利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體（ McAb ）作分子探針，多參數(shù)分析白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿或細(xì)胞核 的免疫表型，由此了解被測(cè)白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。1 .流式細(xì)胞儀診斷白血病的依據(jù) FCM能快速，多參數(shù)，客觀的定性又定量測(cè)定細(xì)胞膜、漿、核的抗原表達(dá)至今尚未發(fā)現(xiàn)白血病的特異抗原。能用正常血細(xì)胞的單抗來(lái)進(jìn)行免疫分型是基于白血病形成的分化阻斷學(xué)說(shuō)。即白血病細(xì)胞基因異常， 分化受阻于某階段形成不同

2、亞型的白血病。這群細(xì)胞充盈于骨髓。正常血細(xì)胞從多能干細(xì)胞分化、發(fā)育、 成熟為功能細(xì)胞的過(guò)程中，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿或胞核抗原的出現(xiàn)、表達(dá)增多與減少甚至消失與血細(xì)胞的分化 發(fā)育階段密切相關(guān)，而且表現(xiàn)岀與細(xì)胞系列及其分化程度相關(guān)的特異性。因此，這些抗原的表達(dá)與否可作 為鑒別和分類血細(xì)胞的基礎(chǔ)。白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，在形態(tài)上變化雖相當(dāng)大，但仍能表達(dá)正常血 細(xì)胞所具有的抗原，因而仍可依據(jù)其抗原的表達(dá)譜對(duì)白血病進(jìn)行免疫分型。2 .流式細(xì)胞儀診斷白血病的意義骨髓血細(xì)胞是形態(tài)學(xué)分型的基礎(chǔ)，F(xiàn)CM白血病免疫分型是對(duì)形態(tài)學(xué)分型的重要補(bǔ)充和進(jìn)一步深化，國(guó)際白血病MIC分型協(xié)作組認(rèn)為免疫分型對(duì)每一例急性白血病都是必

3、不可少的，對(duì)下列情況意義更大：用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色不能肯定細(xì)胞來(lái)源的白血病。形態(tài)學(xué)為急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL ）或急性未分化白血?。ˋUL ）但缺乏特異性淋巴細(xì)胞系列抗原標(biāo)記?；旌闲园籽　２糠炙柘蛋籽　Ｄ壳埃?疫分型對(duì)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞白血病的鑒別尚有一定困難。慢性淋巴細(xì)胞白血病。微小殘留白血病。 臨床預(yù)測(cè)；可根據(jù)抗原的表達(dá)情況預(yù)測(cè)病情的預(yù)后：如白血病患者有CD7+與CD34+共表達(dá)，預(yù)后不好。 疾病監(jiān)測(cè)：可監(jiān)測(cè)病程的發(fā)展，療效，可進(jìn)行微小殘留白血病的檢測(cè)。二、免疫分型常用的免疫標(biāo)志及其意義1 白血病系列分化抗原T淋巴細(xì)胞白血?。?CD3、CD5、CD7。B淋巴細(xì)胞白血?。?CD10、

4、CD19、CD22。NK淋巴細(xì)胞白血病： CD16、CD56、CD57。髓系白血?。篊D13、CD14、CD33、MPO （髓過(guò)氧化物酶）。紅白血?。篏lyA （血型糖蛋白 A） o巨核細(xì)胞白血?。?CD41、CD42、CD61。2 白血病系列非特異性抗原CD34、HLA - DR為早期細(xì)胞抗原，無(wú)系列特異性，可與 CD38聯(lián)合運(yùn)用于免疫分型。一般而言，干 /祖 細(xì)胞 CD34 +、HLA - DR +、CD38 -，原始細(xì)胞 CD34 +、HLA - DR +、CD38 +，而幼稚細(xì)胞（如早 幼粒細(xì)胞）CD34 、HLA - DR 、CD38 +。3 白血病分化階段抗原T纟田胞抗原 CD4、

5、CD8 oB細(xì)胞抗原：CD10、Cy卩（胞漿卩鏈）Smlg （表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg （胞漿免疫球蛋白）、CD11C o4.白細(xì)胞共同抗原CD45為白細(xì)胞共同抗原，其表達(dá)量在淋巴細(xì)胞最高，單核細(xì)胞，成熟粒細(xì)胞，早期造血細(xì)胞（blasts ）依次減弱。紅細(xì)胞（中，晚幼紅細(xì)胞，成熟紅細(xì)胞）不表達(dá) CD45。用SSC/CD45 PerCP雙參數(shù)分析可十分 容易鑒別骨髓和血液中的原始或成熟細(xì)胞。用兩個(gè)系列或階段特異性 McAb加CD45進(jìn)行三色免疫熒光染色，經(jīng)FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45 PerCP 五參數(shù)分析，可特異地分析原幼白血病細(xì)胞 的免疫表型

6、而不受成熟細(xì)胞的干擾。三、白血病及淋巴瘤免疫分型1 . AMLMO :有低的SSC和FSC。在CD45 - SSC圖上出現(xiàn)在淋巴細(xì)胞位置上， 至少表達(dá)一個(gè)特異性標(biāo)志如 CD13 或CD116，但MPO比CD13與CD33更靈敏。一般淋系標(biāo)志陰性，但也可表達(dá) CD7或CD4。一般HLA -DR、CD34陽(yáng)性，有些研究表明 CD7與CD34共表達(dá)在AML且預(yù)后差。M1 :流式上 M1與M0相似不易區(qū)分， M1 般CD13 +、CD33 +、HLA - DR-，但CD34表達(dá)少于M0，可能表達(dá)部分CD15。M2 : M0與M1的主要區(qū)別是成熟度增加，blasts減少，CD15較M1較顯著，CD34弱

7、于M1，CD13有時(shí)表達(dá)強(qiáng)于 CD33，多數(shù)病例HLA - DR (- )。CD45 - SSC圖顯示從髓系blast區(qū)至成熟骨髓細(xì)胞區(qū)的 連續(xù)細(xì)胞帶，CD45 - SSC圖有助于確定blasts比例。M3、高顆粒性，具較高的 SSC，但CD45較成熟C少，多數(shù)情況HLA - DR (-)或表達(dá)減少，CD34少 于M2、一般CD13弱(+ )，可有CD2表達(dá)。M4與M5 :兩型表型相似，但 M4較M5表達(dá)更多的 CD34 ( + )，較之 M0、M1，M4與M5有更大的 FSS和SSC，CD45 - SSC圖上，成熟C出現(xiàn)在單核區(qū)，重要的表型為 CD13、CD33、HLA -DR、CD14 和

8、CD15，CD33可表達(dá)強(qiáng)于 CD13，CD33 ( + )、CD13 ()、CD34 ()很可能為 M5，但只出現(xiàn)在 少數(shù)病人中，部分 M5可見(jiàn)CD56 ( + )。M6 : M6較少見(jiàn)且特征不明顯，一般HLA - DR，CD34、CD13、CD33陽(yáng)性，CD45 - SSC圖顯示主要為紅系成份。M7 :巨核細(xì)胞白血病，在 AML中少于1 %。一般 CD61 ( Gp山a)和/或CD41 ( Gp n b-山a)陽(yáng)性， 而注意由于血小板粘附在 blasts上造成的假陽(yáng)性，可以用流式雙色分析在EDTA存在下，測(cè) Gp n b/山a與CD34以減少激活血小板的粘附。2. ALL :ALL是兒童中

9、最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占全部腫瘤的25 %，在成人，ALL約占急性白血病的25 %，我們將ALL分為B祖細(xì)胞型，CD10 +或CD10 ,前B細(xì)胞型，B細(xì)胞型，T細(xì)胞型。B祖細(xì)胞型 ALL :在幼兒約占ALL的65 %70 %，青少年為55 %60 %，成人為50 %。在兒童，約 90 %病例CD10 +， 在幼兒只有少于 50 %病例 CD10 +, blasts 一般FSC、SSC很少，是 FAB標(biāo)準(zhǔn)的L1或L2，一般 TdT(+)HLA-DR(+) ，CD19(+)，此型又分為2個(gè)亞型，CD10 +和CD10 ,前者預(yù)后好，多數(shù)病例CD24 + , CD34 +, CD20表達(dá)隨成熟度增加

10、而增加， B祖細(xì)胞被定義為sig-。前B細(xì)胞型ALL :此亞型約占兒童 ALL的25 %，細(xì)胞一般為 CD19 +, CD24 , HLA - DR +,胞漿CD22 +, CD10 +, TdT 隨CD20變化，CD34多為陰性，前B亞型被認(rèn)為比B祖型預(yù)后更差，這與t(1 ; 19)出現(xiàn)相關(guān)并由此產(chǎn)生 E2A - PBX1融合蛋白，它的表型為 CD19 +、CD10 +、CD9 +,不同程度 CD20表達(dá)，CD34 ,確認(rèn) 此表型有助于診斷基因上不確定的病例。B細(xì)胞型ALL :成熟B細(xì)胞型ALL約占ALL2 %5%,B細(xì)胞型ALL較之B祖細(xì)胞型ALL有更大的FSC和SSC,在CD45 -SS

11、C圖上出現(xiàn)在淋巴和單核細(xì)胞區(qū)域，即 FAB標(biāo)準(zhǔn)的L3，表型為CD19、CD20、CD22、CD24且sig(多數(shù)為IGM )多數(shù)病例CD10 +。但成熟抗原及 sig使之區(qū)別于更早的 B系A(chǔ)LL，極少數(shù)成熟 B細(xì)胞 ALL 無(wú) FAB - L3 形態(tài)。T- ALL :多數(shù)病例有大的 FSC、SSC,在CD45 - SSC圖上可能出現(xiàn)在淋系未成熟細(xì)胞和髓系未成熟細(xì)胞 或單核細(xì)胞區(qū)，多數(shù)表現(xiàn)為胸腺亞型，最常見(jiàn)亞型為皮質(zhì)晚期表達(dá)，CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/ CD8雙陽(yáng)與極少膜表面 CD3、TdT多為陽(yáng)性。另一常見(jiàn)亞型為皮質(zhì)早期表達(dá)CD2、CD5、CD7、TdT強(qiáng)表達(dá)。髓質(zhì)期亞型表達(dá) C

12、D2、CD5、CD7、與CD3 + CD4 + /CD3+CD8+,很少見(jiàn)TdT表達(dá)。前T細(xì)胞亞型，表 達(dá)CD7胞漿CD3 +且無(wú)其它T細(xì)胞抗原，T細(xì)胞腫瘤的特征是喪失 T細(xì)胞抗原而表現(xiàn)出其它異?？乖M合。雜合型白血?。弘S著流式技術(shù)的廣泛應(yīng)用，我們發(fā)現(xiàn)許多病例并不能嚴(yán)格劃分為淋系或髓系，真正的雙表型病人多為t(9 ;22)或(11q23)，現(xiàn)在雜合型的誤診率很高。最常導(dǎo)致誤診的原因是在分析中未能排除非白細(xì)胞，過(guò)度強(qiáng)調(diào)弱的非特異性結(jié)合，忽略了某些抗體缺乏系特異性，最重要的系特異性抗原在B系、T系、髓系分別為CD22、CD3 和 MPO。3. CML :由于慢性期顯著的細(xì)胞分化，在CD45 - S

13、SC圖上除了髓系細(xì)胞占主導(dǎo)外，只顯示一個(gè)正常骨髓像，CML可確診，CML起病與發(fā)展相對(duì)緩慢， 慢性期的持續(xù)1年左右最終發(fā)展為加速期和急變期。流式細(xì)胞技術(shù)對(duì) 急變期亞型的診斷具有極高價(jià)值。直接影響到治療效果。急變期CML主要表現(xiàn)為髓系，偶為淋系，髓性急變可表現(xiàn)岀多種形態(tài)包括未分化細(xì)胞。淋性急變具典型形態(tài)特征，為CD10 + B祖細(xì)胞ALL極少有T細(xì)胞型ALL。4. CLL:CLL細(xì)胞主要為較正常淋巴細(xì)胞稍大的小淋巴細(xì)胞。免疫分型主要為：SlgM、SlgD弱表達(dá)，B系抗原為CD19、CD20、CD43、CD79a與CD5共表達(dá)，CD23表達(dá)使得 CLL區(qū)別于帽細(xì)胞淋巴癌 MU，即(CLL : CD

14、23 +，MCL : CD23 -)，CD10 、CD23 、CD11c 和 CD25、CD20 常弱表達(dá)，盡管 CLL 起病慢， 但CLL病人的生存率變化很大， 有染色體異常的病預(yù)后不良，最常見(jiàn)的三聯(lián)體trisony12、14q、13q、11q，免疫表型上沒(méi)有特異的變化而免疫表型的變化并不是提示染色體異常。最近，有研究表明，三聯(lián)體trisony12與SIg、CD20表達(dá)量高度相關(guān)，與 CD23 相關(guān)與FMC7相關(guān)。B型前淋巴細(xì)胞白血病(B DLL )較CLL更為嚴(yán)重，流式細(xì)胞技術(shù)在區(qū)分 B DLL和CLL上發(fā)揮很大作用，B DLL多為CD5 ，CD22 +，表達(dá)更強(qiáng)的 sig。MU病人平均生

15、存率不超過(guò) 5年，與CLL在形態(tài)上很難區(qū)分， 與CLL相似有CD5 + B祖細(xì)胞，但Sig表達(dá) 強(qiáng)于 CLL，且 CD22 。另一與CLL難于區(qū)分的是 FCC，細(xì)胞為強(qiáng) Sig、CD5 、CD10 +、CD23 +,具B系表型：對(duì)于診斷為 CLL，CD5、FMC7、CD22與SIg，CD20異常強(qiáng)表表達(dá)的病例我們要考慮是否為DLL、MCC或CLL的亞型(trisomy12 )因?yàn)樗鼈兾ｋU(xiǎn)性更大。四、流式細(xì)胞儀免疫分型實(shí)驗(yàn)1 樣本采集、運(yùn)輸、保存和操作樣本類型：適用于多種臨床標(biāo)本，如外周血、骨髓穿刺液、骨髓活檢物、淋巴樣組織活檢物、漿液、腦 脊液、皮膚、黏膜(內(nèi)窺鏡活檢物)、細(xì)針穿刺物等等?？鼓?/p>

16、劑的選擇：外周血標(biāo)本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標(biāo)本做白細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式分析，則應(yīng)用EDTA抗凝。骨髓穿刺可用肝素。其他體液用EDTA、ACD或肝素均可，但保存的樣本活性可能會(huì)降低，EDTA的優(yōu)點(diǎn)是成熟髓性細(xì)胞貼壁造成的損失及血小板聚集較小，但細(xì)胞散射光特征丟失較 肝素標(biāo)本快；由于相對(duì)大量的 ACD會(huì)通過(guò)改變pH而影響骨髓細(xì)胞活性問(wèn)題，通常不推薦用ACD做骨髓穿刺抗凝劑。(3)樣本的保存：樣本的完整性和細(xì)胞活性與抗凝劑的選擇、運(yùn)輸、保存和溫度息息相關(guān)。 理想狀態(tài)下，樣本應(yīng)在采集后立刻進(jìn)行處理和染色。 短期保存(1小時(shí)或更短)應(yīng)在室溫(18-22 C); 長(zhǎng)時(shí)間保存血或骨髓標(biāo)本

17、室溫即可，有些樣本可能4 C為佳。 標(biāo)本保存的時(shí)間上限取決于標(biāo)本類型及其保存條件。 肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小時(shí)； EDTA抗凝的血和骨髓可保存至 12 24小時(shí)。 ACD抗凝的血和骨髓可保存至 72小時(shí)，但 對(duì)于只做胞內(nèi)染色的樣本，可固定細(xì)胞以長(zhǎng)期保存。但？quot;固定-染色的方法取決于要分析的抗原特 性和染色方式，采用之前一定要進(jìn)行新鮮標(biāo)本的對(duì)照和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。2 樣本制備單細(xì)胞懸液的制備 血和骨髓：天然單細(xì)胞懸液。當(dāng)有血凝塊時(shí)，應(yīng)用50um尼龍網(wǎng)過(guò)濾，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和血涂片以判斷靶細(xì)胞群體是否仍然存在。 組織塊：機(jī)械分離和酶分離兩種方法。分離不僅是要獲得最大產(chǎn)量的單細(xì)胞懸

18、液，還要盡量保證細(xì)胞結(jié) 構(gòu)的完整性和抗原性。大多數(shù)淋巴樣組織可用輕柔的機(jī)械方法快速分離，并保持收獲細(xì)胞的相對(duì)完整。某 些組織由于細(xì)胞間連接緊密，需在機(jī)械分離的基礎(chǔ)上用蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶。骨髓標(biāo)本亦可 能因骨細(xì)胞成分污染而需要酶消化。但使用酶法一定要確認(rèn)酶的使用沒(méi)有改變、減弱靶抗原的表達(dá)，細(xì)胞 活性沒(méi)有顯著降低。分離靶細(xì)胞群體樣本的任何處理方式都可能導(dǎo)致靶細(xì)胞群體的丟失。所以應(yīng)盡可能使用最接近原始標(biāo)本狀態(tài)的處理過(guò)程。去除紅細(xì)胞是流式分析要求的至少步驟。兩種方法： 紅細(xì)胞裂解：較佳。操作簡(jiǎn)單、快、并最可能保持原始標(biāo)本的白細(xì)胞分布。溶血?jiǎng)┑倪x擇應(yīng)基于其選擇 性去除成熟紅細(xì)胞而最小程度的影

19、響其他細(xì)胞的特點(diǎn)。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需確認(rèn)：抗原性不被溶血過(guò)程改變；溶血?jiǎng)┍粡氐紫慈?，?xì)胞和抗體結(jié)合的動(dòng)力反應(yīng)未受影響；所用溶血?jiǎng)┎缓潭▌?，否則會(huì)影響細(xì)胞活性及表面標(biāo)記結(jié)果。 度梯度離心：白血病細(xì)胞回收較好并可能得到富集，同時(shí)去除死細(xì)胞。但費(fèi)時(shí)，白血病細(xì)胞的相對(duì)頻率 較難分析，某些重要細(xì)胞群體可能選擇性丟失。根據(jù)密度梯度原理，若白血病細(xì)胞沒(méi)有與淋巴細(xì)胞相似的 浮力密度即可能丟失。所以用此方法時(shí)應(yīng)檢查各層細(xì)胞特性以防止靶細(xì)胞的丟失。估細(xì)胞懸液 樣本外觀：有嚴(yán)重溶血和血凝塊的標(biāo)本可能會(huì)有白細(xì)胞的損壞以及細(xì)胞亞群的丟失或改變，應(yīng)棄用。 細(xì)胞丟失和分布：確認(rèn)細(xì)胞形態(tài)和原始標(biāo)本相似。密

20、度梯度離心之后更應(yīng)檢查細(xì)胞分布?？勺鲅科?斷。 細(xì)胞計(jì)數(shù)和濃度調(diào)整：廠家推薦的抗體濃度通常是假定靶細(xì)胞數(shù)量在正常范圍內(nèi)(500,000-1,000,000/testAb)。白細(xì)胞數(shù)量上的顯著變化會(huì)帶來(lái)染色模式的變化。而白血病標(biāo)本常常有異常的白細(xì)胞數(shù)量，骨 髓標(biāo)本也可能被外周血稀釋，這些標(biāo)本的細(xì)胞性可能有極大的變異。因此有些標(biāo)本沒(méi)有足夠的細(xì)胞做流式分析，有些則由于細(xì)胞量大，正常濃度下的抗體相對(duì)不足，不能飽和所有的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。所以染色前的細(xì)胞計(jì)數(shù)非常必要。推薦方法：WBC20000/uL ，用稀釋至(3)范圍內(nèi)。骨髓標(biāo)本常常要在PBS 1:10稀釋后計(jì)數(shù)。應(yīng)該指出，由于不同的標(biāo)本

21、中不同系列的細(xì)胞比例不同，調(diào)整細(xì)胞總數(shù)不一定合適每一個(gè)系列特異的抗體。實(shí)驗(yàn)室若選擇不同于廠家推薦的方法(如自己稀釋抗體)，抗體一定需要進(jìn)行測(cè)試以得到抗體和細(xì)胞的最佳比率。 細(xì)胞活性：死細(xì)胞對(duì)許多抗體有非特異性染色，有些抗原同時(shí)存在于胞膜和胞漿，這就使樣本的細(xì)胞活性檢測(cè)變得重要，尤其毖？揪？?順肚奔淶腦聳浜痛4.媯？蚨匝？鏡鬧譜鞴？難惶？宄?薄V觳獾姆椒US辛街鄭 閡皇鞘凳鋇牧魘郊觳猓豪 ？糜？餿玖螾I、7-AAD或EMA (ethidium monoacide )。活細(xì)胞將拒染這些染 料。此方法的優(yōu)勢(shì)是細(xì)胞表面標(biāo)志和活性分析可同時(shí)進(jìn)行，通過(guò)設(shè)門即可得到活細(xì)胞的染色特性。尤其適 用于高度壞死的樣

22、本。樣本染色后需固定。應(yīng)在加固定劑之前洗去多余的7AAD，以保證區(qū)分的是固定前細(xì)胞的死活狀態(tài)。但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，7AAD會(huì)在固定的細(xì)胞群體重新分配，死活細(xì)胞的區(qū)分變難。對(duì)于染色后常規(guī)固定并在固定后 12小時(shí)以上分析的標(biāo)本， 最好用EMA。EMA與死細(xì)胞DNA穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合保 證了長(zhǎng)時(shí)間固定后仍能很好地區(qū)分固定前的死活狀態(tài)。二是手工檢測(cè)：使用Trypan blue 或其他細(xì)胞活性染料。細(xì)胞染色 細(xì)胞表面染色：大多數(shù)可幫助白血病免疫分型的抗原都在細(xì)胞膜上。但由于許多抗原也同時(shí)存在細(xì)胞內(nèi)，所以在細(xì)胞表面抗原檢測(cè)時(shí)應(yīng)特別注意保持細(xì)胞膜的完整以保證檢測(cè)的特異性。例如免疫球蛋白重鏈在細(xì) 胞內(nèi)和表面的存在有著

23、不同的意義，檢測(cè)表面標(biāo)記必須是未固定的活細(xì)胞。 細(xì)胞內(nèi)染色：有些胞內(nèi)特異性抗原的檢測(cè)對(duì)白血病的免疫分型尤為重要，如TdT, MPO, cCD3, cCD22, 以及胞漿內(nèi)lg的表達(dá)。胞內(nèi)染色的關(guān)鍵是使細(xì)胞膜通透，把抗體導(dǎo)入胞漿而不影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。要保證固定和透膜的步驟不影響有關(guān)標(biāo)記的抗原性以及和抗體的結(jié)合。胞膜和胞內(nèi)的同時(shí)染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞內(nèi)染色，最后是DNA染色。固定劑和通透劑都可能對(duì)細(xì)胞和參數(shù)有不同的多重影響，應(yīng)根據(jù)情況選擇。每一步染色對(duì)熒光素的選擇和抗體的選擇都很重要。如，用于表面標(biāo)記的熒光 素應(yīng)不被隨后的固定和通透步驟所影響，而對(duì)于胞內(nèi)染色，所用的熒光素應(yīng)足

24、夠小能穿透到胞膜內(nèi)。3. 抗體組合的確定：選擇抗體組合的技術(shù)性考慮：基于血液腫瘤的復(fù)雜性，提供一個(gè)通用的抗體選擇策略是不現(xiàn)實(shí)的。國(guó)際上 迄今也沒(méi)有一致性的抗體組合。應(yīng)該意識(shí)到，沒(méi)有一個(gè)神奇的既小又功能齊全的抗體組合可以解決所有的 臨床相關(guān)答案。一個(gè)局限性的小組合也可能影響對(duì)樣本的正確評(píng)估和分類。確認(rèn)細(xì)胞異常的能力與所用抗 體的數(shù)量直接成正比。選擇抗體組合的基本原則如下：1） 所選的抗體組合應(yīng)足夠?qū)?，可以鑒別樣本中的所有細(xì)胞亞群包括正常和異常群體。抗體的數(shù)量越多，檢 測(cè)的靈敏度越高。應(yīng)該指岀，由于腫瘤細(xì)胞常常缺少細(xì)胞的正常標(biāo)記或表達(dá)異常，所以特異性抗體一定程 度上的重復(fù)選擇有時(shí)是必要的。2） 抗

25、體的選擇應(yīng)可以區(qū)分正常和異常細(xì)胞，正常細(xì)胞可作為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參照，異常細(xì)胞的表達(dá)比例也更準(zhǔn)確。 如現(xiàn)在用CD45抗體來(lái)區(qū)分正常和幼稚細(xì)胞，此方法尤其在幼稚細(xì)胞含量少時(shí)更顯優(yōu)勢(shì)。3）熒光強(qiáng)度和表位密度應(yīng)同時(shí)考慮。對(duì)表達(dá)少的抗原表位應(yīng)盡可能選擇強(qiáng)度強(qiáng)的熒光素。4） 必要時(shí)用活性檢測(cè)排除死細(xì)胞較強(qiáng)的非特異性染色。國(guó)外統(tǒng)計(jì)，約70%組織樣本和48%血或骨髓標(biāo)本 有活性檢測(cè)結(jié)果。5） 實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)了解所用抗體的反應(yīng)細(xì)胞譜，以及與特定熒光素結(jié)合后的染色模式。相同的CD編號(hào)的不同抗體可能有不同的結(jié)合模式。常用的方案考慮：大而全的抗體組合：全面了解抗原表達(dá)，無(wú)需額外染色，省時(shí)但費(fèi)用高。先用篩查試劑了解樣本的一般情況

26、，再根據(jù)所得信息采用第二線特異性更高的抗體組。經(jīng)濟(jì)，但費(fèi)時(shí)，也需要正確的抗體選擇的策略性決定。但考慮到所用時(shí)間和設(shè)備費(fèi)用，只有約30%國(guó)外實(shí)驗(yàn)室采用此法?；谂R床或形態(tài)學(xué)的資料，選用有目標(biāo)性的抗體組合以確認(rèn)可疑的診斷或分類。4. 樣本獲取通常，每個(gè)標(biāo)本應(yīng)獲取1-2x104個(gè)有核細(xì)胞的熒光和散射光信號(hào)，微小殘余病變分析則需5x104個(gè)細(xì)胞。惡性細(xì)胞常有較寬的大小和粒度范圍，獲取時(shí)最好收集無(wú)門的數(shù)據(jù)以保留所有未知異常細(xì)胞群體的所有特 性。免疫熒光信號(hào)要求對(duì)數(shù)放大和至少256道的分辨率。無(wú)論選擇對(duì)數(shù)或線性放大都要以保證異常細(xì)胞都能被檢測(cè)到。5. 數(shù)據(jù)分析只有通過(guò)多參數(shù)分析，才能最大程度地區(qū)分異質(zhì)的樣

27、本中的正常和異常細(xì)胞。多參數(shù)分析意味著綜合細(xì)胞的光散射和多色熒光特征。最少的要求應(yīng)是4個(gè)參數(shù)（2個(gè)光散射和2個(gè)熒光參數(shù)）。采用的參數(shù)越多，分析步驟越復(fù)雜，流式免疫分型的靈敏度越高。分析技術(shù)：數(shù)據(jù)的分析方式隨樣本的特性、抗體組合及臨床情況的不同而變化。但總的原則是要用多參數(shù)的數(shù)據(jù)創(chuàng)造可以區(qū)分正常和異常細(xì)胞的圖形，如FSC vs. SSC, FL vs. FL, Scatter vs.FL 等，散射光與熒光參數(shù)的綜合分析常常能提供有效的信息。 分析步驟：首先分析所有細(xì)胞的抗原表達(dá)情況，鑒別岀正常細(xì)胞和異常細(xì)胞群體，正常細(xì)胞的表現(xiàn)可 以作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)染色過(guò)程的內(nèi)部參照，提供實(shí)驗(yàn)一致性與否的客觀證據(jù)，異常細(xì)胞則通過(guò)進(jìn)一步設(shè)門分析確定表型特點(diǎn)。 設(shè)門：即選擇特殊的細(xì)胞群體分析其各個(gè)參數(shù)的表現(xiàn)，是一個(gè)基本的分析技巧。把分析局限在門內(nèi)的 細(xì)胞群體的前提是門內(nèi)的細(xì)胞代表所有感興趣的細(xì)胞，而且沒(méi)有其他細(xì)胞的污染。一般來(lái)說(shuō)，不同疾病的 設(shè)門策略亦不同，常用的FSC vs. SSC的設(shè)門方式可能不總是適用于 L&L分析，如在急性白血病中，CD45 和SSC的雙參數(shù)顯示是鑒別幼稚細(xì)胞的一個(gè)簡(jiǎn)單而有效的方法；在B細(xì)胞淋巴瘤中用一個(gè)全 B細(xì)胞的抗體設(shè)門來(lái)看抗k鏈和抗入鏈的表現(xiàn)；T細(xì)胞淋巴瘤時(shí)用一個(gè)全 T細(xì)胞抗體設(shè)門使腫瘤細(xì)胞的分型更加明確。另 外，通過(guò)細(xì)胞特異的抗原表達(dá)確