siRNA與癌癥治療的探究

1、siRNA與癌癥治療的探究 siRNA的簡介 小干擾小干擾RNA（Small interfering RNA；siRNA）有時稱為有時稱為 短干擾短干擾RNA（short interfering RNA）或沉默）或沉默RNA（silencing RNA），是長度），是長度20到到25個核苷酸的個核苷酸的雙股雙股RNA，在生物學上有許多，在生物學上有許多 不同的用途。目前已知不同的用途。目前已知siRNA主要參與主要參與RNA干擾（干擾（RNAi）現(xiàn)象，）現(xiàn)象， 以帶有以帶有專一性專一性的方式調(diào)節(jié)基因的表達。此外，也參與一些與的方式調(diào)節(jié)基因的表達。此外，也參與一些與RNAi （RNA inter

2、ference 核糖核酸干擾）相關的反應途徑，例如抗病核糖核酸干擾）相關的反應途徑，例如抗病 毒機制或是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變、阻斷細胞內(nèi)可能發(fā)生的有害活動，毒機制或是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變、阻斷細胞內(nèi)可能發(fā)生的有害活動， 如腫瘤細胞的生長，但是要成功地將如腫瘤細胞的生長，但是要成功地將siRNA傳送到特異性的細胞傳送到特異性的細胞 中而不對其它細胞產(chǎn)生不利影響還一直是個難題。中而不對其它細胞產(chǎn)生不利影響還一直是個難題。 本次本次 2021-8-13 siRNA的結(jié)構(gòu) siRNA通常是一段長21個核苷酸的雙股RNA（dsRNA），其兩股分 別在RNA的兩端超出另一端2個核苷酸，圖示如下： 每一股各有一個5

3、磷酸基末端與一個3羥基末端。此結(jié)構(gòu)經(jīng)dicer作 用而得，dicer是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以 一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉(zhuǎn)基因病毒感染等各種 方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈 RNAs(siRNAs)。 此外，siRNA也可經(jīng)由多種不同轉(zhuǎn)染（transfection）技術導入細 胞內(nèi)，并對特定基因產(chǎn)生具專一性的基因敲除（knockdown）效果。 本質(zhì)上，任何已知序列的基因都可以、也因此是經(jīng)過適當剪裁而具有序 列互補性的siRNA的作用對象。這使siRNA成為研究基因功能與藥物目 標的一項重要工具。 2021-8-

4、14 RNAi RNARNA沉默是存在于生物中的一種古老現(xiàn)象沉默是存在于生物中的一種古老現(xiàn)象, , 是生物抵抗異常是生物抵抗異常DNA(DNA(病毒、轉(zhuǎn)座因子和某些高病毒、轉(zhuǎn)座因子和某些高 重復的基因組序列重復的基因組序列) )的保護機制的保護機制, , 同時在生物發(fā)同時在生物發(fā) 育過程中扮演著基因表達調(diào)控的角色，它可以通育過程中扮演著基因表達調(diào)控的角色，它可以通 過降解過降解RNARNA、抑制翻譯或修飾染色體等方式發(fā)揮、抑制翻譯或修飾染色體等方式發(fā)揮 作用作用，因此在治療癌癥腫瘤中有很大的應用前景，因此在治療癌癥腫瘤中有很大的應用前景。 2021-8-15 siRNA發(fā)揮RNAi作用的過程

5、siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復合物從而形成所謂RNA激活的RISC 通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3端 12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每 個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。 另外，還有研究證明含有啟動子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi) 同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應的DNA 序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默。 歸納siRNA的特點 依賴依賴Dicer酶的加工，是酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點。產(chǎn)物的特點。 2 長度約在長度約

6、在22nt左右。左右。 1 是是RISC組分。組分。 4 生成需要生成需要Argonaute家族蛋白存在家族蛋白存在3 植物體內(nèi)也存在內(nèi)源的植物體內(nèi)也存在內(nèi)源的siRNA。 5 siRNA在RNAi應用中的缺陷 在在RNAi實驗中，化學合成與體外轉(zhuǎn)錄方法都是在體外得到實驗中，化學合成與體外轉(zhuǎn)錄方法都是在體外得到siRNA后再導入后再導入 細胞內(nèi)，但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點：細胞內(nèi)，但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點：siRNA進入細胞后容進入細胞后容 易被降解；進入細胞易被降解；進入細胞siRNA在細胞內(nèi)的在細胞內(nèi)的RNAi效應持續(xù)時間短。效應持續(xù)時間短。針對這種情況，針對

7、這種情況， 出現(xiàn)了質(zhì)粒、病毒類載體介導的出現(xiàn)了質(zhì)粒、病毒類載體介導的siRNA體內(nèi)表達。體內(nèi)表達。 該方法的基本思路是：該方法的基本思路是： 將將siRNA對應的對應的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶聚合酶III的啟動子后，的啟動子后， 這樣就能在體內(nèi)表達所需的這樣就能在體內(nèi)表達所需的siRNA分子。這種方法總體的優(yōu)點在于不需要直分子。這種方法總體的優(yōu)點在于不需要直 接操作接操作RNA，能達到較長時間的基因沉默效果。，能達到較長時間的基因沉默效果。 質(zhì)粒表達siRNA的優(yōu)點 通過質(zhì)粒表達通過質(zhì)粒表達siRNAs大都是用大都是用Pol III啟動子啟動編碼啟動子

8、啟動編碼shRNA (small hairpin RNA)的序列。選用的序列。選用Pol III啟動子的原因在于啟動子的原因在于 這個啟動子總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成這個啟動子總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成RNA， 遇到遇到45個連續(xù)的個連續(xù)的U即終止，非常精確。當這種帶有即終止，非常精確。當這種帶有Pol III 啟動子啟動子 和和shRNA模板序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞時，這種能表達模板序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞時，這種能表達siRNA 的質(zhì)粒確實能夠下調(diào)特定基因的表達，可抑制外源基因和內(nèi)源基因。的質(zhì)粒確實能夠下調(diào)特定基因的表達，可抑制外源基因和內(nèi)源基因。

9、采用質(zhì)粒的優(yōu)點在于，通過采用質(zhì)粒的優(yōu)點在于，通過siRNA表達質(zhì)粒的選擇標記，表達質(zhì)粒的選擇標記，siRNA載載 體能夠更長時間地抑制目的基因表達。當然還有一點，那就是由于質(zhì)粒體能夠更長時間地抑制目的基因表達。當然還有一點，那就是由于質(zhì)粒 可以復制擴增，相比起其它合成方法來說，這就能夠顯著降低制備可以復制擴增，相比起其它合成方法來說，這就能夠顯著降低制備siRNA 的成本。的成本。 此外，帶有抗生素標記的此外，帶有抗生素標記的siRNA表達載體可用于長期抑制研究，表達載體可用于長期抑制研究， 通過抗性輔助篩選，該質(zhì)?？梢栽诩毎谐掷m(xù)抑制靶基因的表通過抗性輔助篩選，該質(zhì)?？梢栽诩毎谐掷m(xù)抑制靶基

10、因的表 達數(shù)星期甚至更久（比如達數(shù)星期甚至更久（比如Clontech（現(xiàn)屬于（現(xiàn)屬于Takara）的）的RNAi -Ready表達載體）。另外帶有熒光標記的表達載體）。另外帶有熒光標記的siRNA表達載體也表達載體也 受到研究者的重視與歡迎，因為帶熒光標記的表達載體，可以受到研究者的重視與歡迎，因為帶熒光標記的表達載體，可以 讓研究人員通過熒光標記很容易觀察到載體的轉(zhuǎn)染效率及目的讓研究人員通過熒光標記很容易觀察到載體的轉(zhuǎn)染效率及目的 基因的沉默效率?？赏ㄟ^熒光顯微鏡觀察含有基因的沉默效率?？赏ㄟ^熒光顯微鏡觀察含有shRNA的細胞的細胞 或通過流式細胞儀富集被轉(zhuǎn)染的細胞。同時熒光蛋白的表達與或通

11、過流式細胞儀富集被轉(zhuǎn)染的細胞。同時熒光蛋白的表達與 shRNA的表達是獨立的，因此不影響的表達是獨立的，因此不影響shRNA基因沉默的效果?；虺聊男Ч?帶有標記的siRNA表達載體 研究人員將編碼人類端粒酶研究人員將編碼人類端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR），）， 長長67bp的寡核苷酸引入的寡核苷酸引入pSIREN一種重組腺病毒構(gòu)建中的穿梭載體。一種重組腺病毒構(gòu)建中的穿梭載體。 然后將然后將U6-RNA啟動子和啟動子和siRNA編碼編碼insert從從pSIREN上剪切下來，亞克隆進上剪切下來，亞克隆進 pAdeno-X，構(gòu)建出了質(zhì)粒，構(gòu)建出了質(zhì)粒pAd-

12、hTR。 接著研究人員將接著研究人員將pAd-hTR轉(zhuǎn)染進哺乳動物細胞系轉(zhuǎn)染進哺乳動物細胞系HEK-293，獲得了攜帶，獲得了攜帶 有有hTR靶向的靶向的siRNA（Ad-hTR-siRNA）的腺病毒。通過一系列的實驗，研）的腺病毒。通過一系列的實驗，研 究人員證明了究人員證明了Ad-hTR-siRNA介導的端粒酶沉默在介導的端粒酶沉默在HeLa細胞中的作用。同時細胞中的作用。同時 將將Ad-hTR-siRNA與與Ad-NT-siRNA進行比對，發(fā)現(xiàn)前者能極大的降低進行比對，發(fā)現(xiàn)前者能極大的降低HeLa細細 胞中胞中hTRmRNA水平（水平（by 70.21%），和端粒酶活性（），和端粒酶活性

13、（by 58.87%）。而且）。而且 會引起會引起HeLa細胞凋亡。細胞凋亡。 利用利用Ad-hTR-siRNA進行皮下腫瘤異種移植治療可以減緩腫瘤的生長，其進行皮下腫瘤異種移植治療可以減緩腫瘤的生長，其 中至少部分是由于體內(nèi)細胞凋亡（中至少部分是由于體內(nèi)細胞凋亡（P0.05）?？偠灾@些研究結(jié)果證明）?？偠灾@些研究結(jié)果證明 了了hTR siRNA在在HeLa細胞系中有效和特異的端粒酶的敲除，從而指出了這種細胞系中有效和特異的端粒酶的敲除，從而指出了這種 siRNA表達重組腺病毒系統(tǒng)在癌癥基因治療方面的前景。表達重組腺病毒系統(tǒng)在癌癥基因治療方面的前景。 siRNA病毒載體減緩腫瘤生長

14、 2021-8-111 siRNA在卵巢癌治療中的實驗探究在卵巢癌治療中的實驗探究 siRNA在胃癌治療中的實驗探究在胃癌治療中的實驗探究 siRNA與癌癥的實驗與癌癥的實驗 siRNA在其他癌癥治療中的應用在其他癌癥治療中的應用 2021-8-112 德克薩斯州學M. D. Anderson癌癥中心的項新研究顯 示，裝載在一微小的脂肪球中的一種分子開關 （siRNA）能夠滲入卵巢癌腫瘤細胞中“掐死”一種 討厭的蛋白并明顯縮小腫瘤的尺寸。該項研究的結(jié)果 刊登在8月15日的Clinical Cancer Research雜志上，這項 研究還成為該期雜志的封面故事。 小鼠模型實驗證實一種強有力的短

15、干擾RNA （siRNA）傳遞系統(tǒng)能夠攻擊癌癥。SiRNA是一種能 用于沉默基因關閉有害蛋白制造的偉大技術。在離體 實驗中，這種技術的效果很好，但是難點是如何能夠 讓它進入到腫瘤中。因為短的RNA片段在沒有被直接 注射的情況下無法進入到腫瘤中，并且實驗室用的注 射方法在臨床中是不能適用的。 8/1/2021 siRNA在卵巢癌癥治療的發(fā)現(xiàn) 2021-8-113 這研究組將能靶向一種促進卵巢癌細胞存活和擴散的蛋白質(zhì) 的siRNA轉(zhuǎn)載進一種脂質(zhì)體（一種脂肪球，體積非常 ?。┲小Ｑ芯咳藛T對感染了三種人類卵巢癌細胞系的 小鼠進行了3到5周的處理。這些小鼠接受了含有FAK siRNA、對照siRNA或空

16、處理。一些小鼠接受了siRNA 脂質(zhì)體和化療藥物docetaxel。 實驗結(jié)果顯示，接受了FAK沉默脂質(zhì)體的小鼠的腫瘤 重量與對照組相比，減少了4472；聯(lián)合使用了 FAK沉默脂質(zhì)體和藥物docetaxel的小鼠，其腫瘤腫瘤 減少了9498。而且這種聯(lián)合方法對docetaxel抗 性卵巢癌細胞系同樣有用。 8/1/2021 2021-8-114 8/1/2021 武漢大學中南醫(yī)院胃腸科教授鄧長生在International Immunopharmacology上發(fā) 表RNAi文章，解析以siRNA治療胃癌的新成果。 胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在癌癥致死原因中列第二。武大中南 醫(yī)院鄧長生

17、教授、夏冰教授等在先前的研究中發(fā)現(xiàn)了多個易感基因，與湖北 漢族人胃癌顯著相關，尤其是在湖北漢族人群腫瘤壞死因子基因位點上，檢 測出一新的等位基因，為胃癌的早期診斷和治療提供了一項新方法。找到靶 位基因后，鄧長生教授等嘗試用最新的RNAi技術治療胃癌。鄧教授研究小組 以survivin為靶位設計siRNA，構(gòu)建了一個Psilencer 2.1-surivin siRNA質(zhì)粒，并 將該質(zhì)粒導入胃癌MGC-803細胞系中，同時還將該細胞系注入裸鼠體內(nèi)，觀 察該siRNA的效果。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠細胞內(nèi)的surivin基因轉(zhuǎn)錄的mRNA量顯著下降，并且surivin蛋 白表達量也下降，癌細胞凋亡率升高。

18、總的來說，該siRNA靶位可有效的抑 制胃癌細胞增殖，可能成為胃癌的潛在治療靶位。 siRNA在胃癌癥治療的發(fā)現(xiàn)在胃癌癥治療的發(fā)現(xiàn) 2021-8-115 8/1/2021 Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，Survivin具有腫瘤特異性，只表達于 腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關。Survivin 是目前發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子，Survivin功能復雜，具有抑制細胞凋亡， 促進細胞轉(zhuǎn)化并且參與細胞的有絲分裂、血管的生成和腫瘤細胞耐藥性的 產(chǎn)生等作用。目前，Survivin已成為研究的熱點。 Survivin在人類各種腫瘤組織癌細胞中含量很豐富，但在正常細胞中卻

19、幾乎 不存在。體內(nèi)外研究表明，Survivin可在多 種轉(zhuǎn)化細胞系中表達，并見于 所有人類最常見的腫瘤組織，包括肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌和乳 腺癌。 Survivin蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 2021-8-116 靶向surviv in的siRNA對胃癌BGC-823細胞增殖的影響 設計并合成3條靶向surviv in的小分子干擾RNA( siRNA), 構(gòu)建表達 性干擾RNA質(zhì)粒( shRNA ) shRNAsurvivin-1、shRNA-surv iv in-2和 shRNA-surv iv in-3, 分別轉(zhuǎn)染胃癌BGC-823 細胞, 實時定量PCR檢 測干擾RNA 沉默surv ivin mRNA 表達效果, W estern b lo t觀察對 胃癌BGC-823 細