低溫響應(yīng)嗜麥芽單胞菌FF11外泌蛋白酶表征及調(diào)控機(jī)制

1、低溫響應(yīng)嗜麥芽單胞菌 FF11 外泌蛋白酶表征及調(diào)控機(jī)制在最近的二十年中 , 作為一個(gè)篩分比率逐年增加的海產(chǎn)品腐敗菌及魚類致病 菌,嗜麥芽單胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有潛在的危害性, 其低溫下較強(qiáng)的蛋白酶水解能力是導(dǎo)致海產(chǎn)品腐敗和魚類致病的重要因素。 S.maltophilia 低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白酶種類和特性 , 還沒有文獻(xiàn)詳細(xì)報(bào)道 , 而且 溫度誘導(dǎo)蛋白酶產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)制也不清楚。 本課題針對(duì)以上兩個(gè)問題進(jìn)行初步的 研究與探索 : 一是對(duì)低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白酶分離純化 , 詳細(xì)了解該酶的特性及一 級(jí)結(jié)構(gòu)特征 ; 二是對(duì)溫度響應(yīng)蛋白酶的調(diào)控機(jī)制

2、進(jìn)行初步探索。(1) 通過富集培養(yǎng)的方法從冷凍的南極磷蝦中分離得到一株低溫下高產(chǎn)蛋白酶的菌株,通過16S rDNA和生理生化分析鑒定為嗜麥芽單胞菌,命名為S.maltophilia FF11。菌株在低溫(15 C和25C)下產(chǎn)生胞外蛋白酶活性高,而37C 下幾乎檢測(cè)不到蛋白酶活性。酶譜分析表明,S.maltophilia FF11主要的蛋白酶 僅在低溫下產(chǎn)生,在37E并不產(chǎn)生，此蛋白酶命名為SmtP(S.maltophilia temperature-responsiveprotease) 。通過硫酸銨沉淀、 陰離子交換層析 (Q-Sepharose Fast Flow chromatogra

3、phy) 和凝膠篩分層析(Superdex75),從S.maltophiliaFF11發(fā)酵液中分離純化出電泳純的蛋白酶SmtP;該酶在高鹽(4M)和有機(jī)溶劑(50%)環(huán)境下具有較高的活性及較 強(qiáng)的耐受性。肽指紋圖譜分析及基因克隆測(cè)序獲得了編碼該酶的全基因序列 , 基 因全長(zhǎng)為1854 bp,編碼617氨基酸蛋白酶的前體(GeneBank序列號(hào)為KP399635)。 N端測(cè)序(LVPND和質(zhì)譜分子量(37.4 kDa),確定成熟酶由368個(gè)氨基酸組成,獲 得了該酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列。實(shí)時(shí)定量PCR和啟動(dòng)子融合分析表明,溫度影響SmtP的產(chǎn)生至少發(fā)生在 轉(zhuǎn)錄水平上。利用自殺載體pEX18Tc,采用雙親

4、結(jié)合的方法,敲除S.maltophiliaFF11-個(gè) cAMP 受體類似蛋白(cAMPreceptorprotein-like,Clp),獲得 Aclp 菌株。clp的敲除顯著減少了 S.maltophilia FF11在15C和25C下的蛋白酶活性, 酶譜結(jié)果顯示 ,Aclp 菌株不再產(chǎn)生 SmtP。實(shí)時(shí)定量PCR和啟動(dòng)子活性分析表明,Clp能夠正向調(diào)控smtP的表達(dá)。同時(shí),clp的表達(dá)同樣具有溫度依賴性的特征。(3)生物信息學(xué)分析顯示,在S.maltophilia 中, 四個(gè)雙組份系統(tǒng) Sm3706/Sm370、5Sm1829/Sm182、8Sm1911/Sm1912和Sm0737/07

5、38涉及胞內(nèi)第二信使環(huán)二鳥苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP) 代謝。分別敲除4個(gè)響應(yīng)蛋白發(fā)現(xiàn)，Sm3705減少菌株FF11低溫下78-82%胞外酶活 性,Sm1828減少50-53%,Sm1912減少了 10-15%,Sm0737無影響。酶譜分析顯示, 敲除Sm370Sl全消除了 SmtP的產(chǎn)生，與Aclp菌株具有相似的性狀,敲除Sm1828 明顯減少了 SmtP的產(chǎn)生。Sm3706/Sm370是一個(gè)新的未被鑒定的雙組份系統(tǒng)， 能夠響應(yīng)低溫的刺激 , 命名為 LotS/LotR(lowtemperature sensorandregulator);LotS 是一個(gè)非

6、經(jīng)典的感應(yīng)激酶 ,LotR 是一個(gè)響應(yīng)蛋白 , 此 蛋白包含了與c-di-GMP代謝有關(guān)的GGDE和EAL結(jié)構(gòu)域及信號(hào)接收的REC結(jié)構(gòu) 域。LotS/LotR與Clp都能夠調(diào)控smtP的表達(dá),表明LotS/LotR與Clp處在同一個(gè)調(diào)控smtP表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中； lotR和厶lotS菌株中clp啟動(dòng)子活性及 表達(dá)分析表明,Clp是LotS/LotR下游的調(diào)控蛋白。重組表達(dá) LotR體外檢測(cè)發(fā) 現(xiàn),LotR不能合成,也不能降解c-di-GMP。胞內(nèi)c-di-GMP檢測(cè)表明,高溫生長(zhǎng)增 加S.moltoplilia FF11 中的c-di-GMP的水平,而厶lotR 菌株中的c-di-GMP的

7、 濃度并不表現(xiàn)明顯的高溫依賴性的特征 ,表明 LotR 參與了溫度調(diào)控的 c-di-GMP 水平。ITC結(jié)果顯示,S.maltophilia FF11 中的C1p與c-di-GMP親和常數(shù)在25C 下為Kd= 20.3 0.9nM,37C下Kd= 22.7 1.11 nM,表明嗜麥芽單胞菌中的 Clp 與 c-di-GMP 能夠結(jié)合, 而且溫度對(duì)兩者的結(jié)合能力沒有明顯影響。 (4) 生物信息 學(xué)分析顯示，Sm1829/Sm1828W黃單胞菌中的雙組份系統(tǒng) RpfC/RpfG具有較高的 序列同源性。構(gòu)建 rpfF 、rpfC 及 rpfG 敲除菌株及各自的回補(bǔ)菌株 , 驗(yàn)證 S.maltophi

8、lia FF11 中RpfC/RpfG同樣響應(yīng)DSF分子調(diào)控胞外酶的活性。rpfC及rpfG的敲除對(duì)菌株的生長(zhǎng)沒有影響，卻顯著減少了菌株FF11在低溫 下胞外蛋白酶的活性，酶譜結(jié)果顯示，敲除菌株顯著減少了 SmtP的產(chǎn)生,表明 RpfC/RpfG能夠響應(yīng)溫度變化調(diào)控胞外蛋白酶的產(chǎn)生。在低溫培養(yǎng)下，缺失信號(hào)分子DSF明顯減少了胞外蛋白酶的活性，在37T下外源添加DSF或者過表達(dá)RpfF 蛋白均不能增加胞外蛋白酶的活性，表明DSF僅在低溫下能夠調(diào)控胞外蛋白酶的 表達(dá)。RpfG酶活性表明,S.maltophilia FF11 中RpfG的活性依賴于DSF信號(hào)分 子和低的生長(zhǎng)溫度兩種信號(hào)。綜上，本論文分析了 S.maltophilia FF11中外泌蛋白酶SmtP的主要特性，并解析了 SmtP的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列；發(fā)現(xiàn)調(diào)控smtP表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Clp及其上游調(diào) 控因