DNA第一代,第二代,第三代測(cè)序的介紹

1、原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4種單脫氧核苷三磷酸(d NTP其中 的一種用放射性P32標(biāo)記)存在條件下復(fù)制時(shí)，在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引 入4種雙脫氧核苷三磷酸(dd NTP )，因?yàn)殡p脫氧核苷沒(méi)有3 -O H,所以只 要雙脫氧核苷摻入鏈的末端， 該鏈就停止延長(zhǎng)， 若鏈端摻入單脫氧核苷， 鏈就可 以繼續(xù)延長(zhǎng)。如此每管反應(yīng)體系中便合成以各自 的雙脫氧堿基為 3端的一系列長(zhǎng)度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分4個(gè)泳道進(jìn)行凝膠電泳， 分離長(zhǎng)短不一的核酸片段， 長(zhǎng)度相鄰的片段相差一個(gè)堿基。 經(jīng)過(guò) 放射自顯影后，根據(jù)片段 3端的雙脫氧核苷，便可依次閱讀合成片段的堿基排 列順序。 Sanger 法

2、因操作簡(jiǎn)便，得到廣泛的應(yīng)用。后來(lái)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種 DNA測(cè)序技術(shù)，其中最重要的是熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)。熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù) 熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)基于 Sanger 原理， 用熒光標(biāo)記代替同位素標(biāo) 記，并用成像系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)，從而大大提高了D NA測(cè)序的速度和準(zhǔn)確性。20世紀(jì)80年代初 Jorgenson 和 Lukacs 提出了毛細(xì)管電泳技術(shù) ( c a p il l ar y el ect r ophor es i s ) 。 1992 年美國(guó)的 Mathies 實(shí)驗(yàn)室首先提出陣列毛細(xì)管電泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并

3、采用激光聚焦熒光掃描檢測(cè)裝置，25 只毛細(xì)管并列電泳，每只毛細(xì)管在內(nèi)可讀出 350 bp，DNA序列，分析效率可達(dá) 6 000 bp/h。1995年 Woolley研究組 用該技術(shù)進(jìn)行測(cè)序研究，使用四色熒光標(biāo)記法，每個(gè)毛細(xì)管長(zhǎng)，在9min內(nèi)可讀取150個(gè)堿基，準(zhǔn)確率約 97 % 。目前， 應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 ( ABI ) 37 30 系列 自動(dòng)測(cè) 序儀即是基于毛細(xì)管電泳和熒光標(biāo)記技術(shù)的D NA測(cè)序儀。女口 ABI3730XL測(cè)序儀擁有96道毛細(xì)管 ， 4 種雙脫氧核苷酸的堿基分別用不同的熒光標(biāo)記 ， 在通過(guò)毛細(xì)管時(shí) 不同長(zhǎng)度的 DNA 片段上的 4 種熒光基團(tuán)被激光激發(fā) ， 發(fā)出不

4、同顏色的熒光 ， 被 CCD 檢測(cè) 系統(tǒng)識(shí)別 ， 并直接翻譯成 DNA 序列。雜交測(cè)序技術(shù) 雜交法測(cè)序是 20 世紀(jì) 80 年代末出現(xiàn)的一種測(cè)序方法 ， 該方法不同于 化學(xué)降解法和 Sanger 法， 而是利用 DNA 雜交原理 ， 將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片 段固定在基片上 ， 把待測(cè)的 DN A 樣品片段變性后與其雜交 ， 根據(jù)雜交情況排列出樣品的 序列 序檢測(cè)速度快 , 采用標(biāo)準(zhǔn)化的高密度寡核苷酸芯片能夠大幅度降低檢測(cè)的成本，具 有部分第二代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)。但 該方法誤差較大 , 且不能重復(fù)測(cè)定焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的 DNA序列分

5、析技術(shù)，它通過(guò)核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)， 促使熒光素 發(fā)光并進(jìn)行檢測(cè)。既可進(jìn)行DNA序列分析,又可進(jìn)行基于序列分析的 單核苷酸多 態(tài)性(SNP)檢測(cè)及等位基因頻率測(cè)定 等。1 焦磷酸測(cè)序技術(shù)的原理及步驟焦磷酸測(cè)序是由DNA聚合酶(DNA polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATPsulfurylase) 、 熒光素酶 (1ueiferase) 和雙磷酸酶 (apyrase)4 種酶催化同一反 應(yīng)體系的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，反應(yīng)底物為5-磷酰硫酸(APS)和熒光素。反應(yīng)體系還包括待測(cè)序DNA單鏈和測(cè)序引物。在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，加入1種dNTP 若該dNTP與模板配對(duì)，聚

6、合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的 焦磷酸基團(tuán)(PPi)。硫酸化酶催化APS和 PPi形成ATP后者驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo) 的熒光素向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)出與ATP量成正比的可見(jiàn)光信號(hào)，并由PyrogramTMW化為一個(gè)峰值，其高度與反應(yīng)中摻人的核苷酸數(shù)目成正比。根據(jù)加 入dNTP類(lèi)型和熒光信號(hào)強(qiáng)度就可實(shí)時(shí)記錄模板 DNA勺核苷酸序列。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程 中用a-硫化的三磷酸腺苷(dATPotS)代替三磷酸腺苷(dATP)以有效地被DNA聚合 酶利 用，而不被蟲(chóng)熒光素識(shí)別。由于SpdATPetS可以降低dATPotS降解產(chǎn)物的 濃度，近年來(lái)，單鏈 DNA吉合蛋白(single strand DN

7、A binding protein ，SSBP) 和純化Spisomer dATPaS的使用dATPotS降解產(chǎn)物抑制雙磷酸酶活性的這一問(wèn)題 得到較好解決，使得測(cè)序長(zhǎng)度可達(dá) 100 bp ，拓展了該技術(shù)在遺羅氏454的GSFLX測(cè)序技術(shù)利用了焦磷酸測(cè)序原理，主要包括以下步驟：1) 文庫(kù)準(zhǔn)備 將基因組DNA丁碎成300-800 bp長(zhǎng)的片段(若是sn RNA或PCR 產(chǎn)物可以直接進(jìn)入下一步)，在單鏈DN A的3端和5端分別連上不同的接 頭。2) 連接 帶接頭的單鏈DNA被固定在DNA捕獲磁珠上。每一個(gè)磁珠攜帶一個(gè)單 鏈 DNA 片段。隨后擴(kuò)增試劑將磁珠乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了 許多

8、 只包含一個(gè)磁珠和一個(gè)獨(dú)特片段的微反應(yīng)器 。3）擴(kuò)增 每個(gè)獨(dú)特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增（ 乳液 PCR） ，從而排除了其它序列的競(jìng)爭(zhēng)。整個(gè)DNA片段文庫(kù)的擴(kuò)增平行進(jìn)行。對(duì)于每一個(gè)片段 而言，擴(kuò)增產(chǎn)生幾百 萬(wàn)個(gè)相同的拷貝。乳液 PC R 終止后，擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。4）測(cè)序 攜帶D NA的捕獲磁珠被放入PTP板中進(jìn)行測(cè)序。PTP孔的直徑（29 卩m ）只能容納一個(gè)磁珠（20卩m ）。放置在4個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的4種堿 基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如 果發(fā)生堿基配對(duì) , 就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在ATP 硫酸化酶和熒光素酶的作用下

9、，釋放出光信號(hào)，并實(shí)時(shí)地被儀器配置的高靈敏度 CCD 捕獲到。有 一個(gè)堿基和測(cè)序模板進(jìn)行配對(duì)， 就會(huì)捕獲到一分子的光信號(hào)； 由此一一對(duì)應(yīng)， 就 可以準(zhǔn) 確、快速地確定待測(cè)模板的堿基序列與其它第二代測(cè)序平臺(tái)相比， 454 測(cè)序法的突出優(yōu)勢(shì)是較長(zhǎng)的讀長(zhǎng)， 目前 GSFLX 測(cè)序系統(tǒng)的序列讀長(zhǎng)已超過(guò) 400 bp 。雖然 454平臺(tái)的測(cè)序成本比其他新一代測(cè) 序 平臺(tái) 要高很多，但對(duì)于那些需要長(zhǎng)讀長(zhǎng)的應(yīng) 用，如 從頭測(cè) 序，它仍是最 理想的選擇。Solexa 測(cè)序技術(shù)Illumna 公司的新一代測(cè)序儀 Genome Analyzer 最早由 Solexa 公司研發(fā)，利用 合成測(cè)序 （Sequencin

10、g by Synthesis） 的原理，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣本制備及大規(guī)模平 行測(cè)序。 Genome Analyzer 技術(shù)的基本原理是將基因組 DN A 打碎成約 100-200 個(gè)堿基的小片段，在片段的兩個(gè)末端加上接頭（adapter ）。將DNA片段變成單鏈后通過(guò) 接頭與芯片表面的引物堿基互補(bǔ)而使一端被固定在芯片上 。另外一端隨 機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ) ，也被固定住，形成橋狀結(jié)構(gòu)。通過(guò) 30輪擴(kuò)增反 應(yīng)，每個(gè)單分子被擴(kuò)增大約1 000倍，成為單克隆的DNA簇，隨后將DNA簇線(xiàn) 性化。在下一步合成反應(yīng)中，加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的d NTP在DNA合成時(shí)，每一個(gè)核苷酸加到引物

11、末端時(shí)都會(huì)釋放出焦磷酸鹽，激發(fā) 生物發(fā)光蛋白發(fā)出熒光。 用激光掃描反應(yīng)板表面， 在讀取每條模板序列第一輪反 應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類(lèi)后， 將這些熒光基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù) 3端黏性，隨 后添加第二個(gè)核苷酸 。如此重復(fù)直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣， 統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果， 就可以得知每個(gè)模板 DN A 片段的序列 GenomeAnalyzer 系統(tǒng)需要的樣品量低至 100ng ，文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單，減少了樣 品分離和制備的時(shí)間，配對(duì)末端讀長(zhǎng)可達(dá)到 2X 50 bp，每次運(yùn)行后可獲得超過(guò) 20 G B 的高質(zhì)量過(guò)濾數(shù)據(jù)，且運(yùn)行成本較低，是性?xún)r(jià)比較高的新一代測(cè)序技術(shù)。 SOLiD 測(cè)序

12、技術(shù)SOLiD 全稱(chēng)為 Supported Oligo Ligation Detetion，是 ABI (應(yīng)用生物系統(tǒng))公司于 2007 年底推出的全新測(cè)序技術(shù)，目前已發(fā)展到 SOLiD 3 Plus 。與 454和 Solexa 的合成測(cè)序不同， S OLiD 是通過(guò) 連接反應(yīng) 進(jìn)行測(cè)序的。其基本原理是以 四色熒光標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行多次連接合成 ，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)。具體步驟包括：1) 文庫(kù)準(zhǔn)備 SOLiD 系統(tǒng)能支持兩種測(cè)序模板：片段文庫(kù) ( fragment library )或配對(duì)末端文庫(kù)(mate-paired library)。片段文庫(kù)就是將基因組 DNA打斷，兩頭加上接頭，

13、制成文庫(kù)。該文庫(kù)適用于 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RNA定量、mi RNA研究、 重測(cè)序、3 ，5 RACE、甲基化分析及ChIP測(cè)序等。配對(duì)末端文庫(kù)是將基 因組 D NA 打斷后， 與中間接頭連接 ，環(huán)化，然后用 EcoP15 酶切，使中間接頭 兩端各有 27bp 的堿基，最后加上兩端的接頭，形成文庫(kù)。該文庫(kù)適用于 全基因 組測(cè)序、SNP分析、結(jié)構(gòu)重排及拷貝數(shù)分析 等。2) 擴(kuò)增 SOLiD 用的是與 454 技術(shù)類(lèi)似的乳液 PCR 對(duì)要測(cè)序的片段進(jìn)行擴(kuò)增。在微反應(yīng)器中加入測(cè)序模板、PCR反應(yīng)元件、 微珠和引物，進(jìn)行乳液PCR(emulsi on PCR )。PCR反應(yīng)結(jié)束后，磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大

14、的同一DNA莫板的擴(kuò)增產(chǎn)物。3) 微珠與玻片連接 乳液PCR完成之后，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠， 微珠上的模板經(jīng)過(guò) 3修飾，可以與玻片共價(jià)結(jié)合。 SOLiD 系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是 每張玻片能容納更高密度的微珠 ，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。 含有 DNA 模板的磁珠共價(jià)結(jié)合在SOLiD玻片表面，SOLiD測(cè)序反應(yīng)就在SOLiD玻片表面進(jìn) 行。每個(gè)磁珠經(jīng)SOLiD測(cè)序后得到一條序列。4) 連接測(cè)序 SOLiD 連接反應(yīng)的底物是 8 堿基單鏈熒光探針混合物 。探針的 5 端用 4 種顏色的熒光標(biāo)記，探針 3端第 1、2 位堿基是 ATCG 4種堿基中的任 何兩種堿基組成的堿基對(duì)，共 16

15、 種堿基對(duì)，因此 每種顏色對(duì)應(yīng)著 4 種堿基對(duì) 。 3 - 5 位是隨機(jī)的 3 個(gè)堿基。 6 - 8 位是可以和任何堿基配對(duì)的特殊堿基 。單向 SOLiD測(cè)序包括5輪測(cè)序反應(yīng)，每輪測(cè)序反應(yīng)含有多次連接反應(yīng)，得到原始顏色 序列。SOLiD序列分析軟件根據(jù)“雙堿基編碼矩陣”把堿 基序列轉(zhuǎn)換成顏色編碼序列，然后與 SOLiD 原始顏色序列進(jìn)行比較。由于雙堿 基編碼規(guī)則中一種顏色對(duì)應(yīng) 4 種堿基對(duì)，前面堿基對(duì)的第二個(gè)堿基是后面堿基對(duì) 的第一個(gè)堿基 , 所以一個(gè)錯(cuò)誤顏色編碼就會(huì)引起連鎖的解碼錯(cuò)誤， 改變錯(cuò)誤顏色 編碼之后的所有堿基。SOLiD序列分析軟件可以對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤進(jìn)行自動(dòng)校正，最后 解碼成原始序列。

16、因?yàn)镾OLiD系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術(shù)，在測(cè)序過(guò)程中對(duì)每個(gè) 堿基判讀兩遍， 從而減少原始數(shù)據(jù)錯(cuò)誤， 提供內(nèi)在的校對(duì)功能， 得到的原始?jí)A基 數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于 %，而在 15X 覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以 達(dá)到 9 % ，是目前新 一代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的 。超高通量是SOLiD系統(tǒng)最突出的 特點(diǎn)，目前SOLiD3單次運(yùn)行可產(chǎn)生50 GB的 序列數(shù)據(jù) , 相當(dāng)于 17 倍人類(lèi)基因組覆蓋度。第二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用1) 從頭測(cè)序 ( de-novo sequencing) 對(duì)于基因組未被測(cè)序過(guò)的生物，其基因組 測(cè)序需要從頭測(cè)序。由于受測(cè)序讀取長(zhǎng)度的限制，新一代測(cè)序技術(shù)中只有 454 技術(shù)能獨(dú)立完成復(fù)雜基

17、因組如真核生物基因組的從頭測(cè)序工作。Solexa 和SOLiD技術(shù)只能完成簡(jiǎn)單生物如細(xì)菌的基因組的從頭測(cè)序。在復(fù)雜基因組的從頭 測(cè)序中，將 Sol xa /S O L i D 與 45 4 技術(shù)或傳統(tǒng)的 Sanger 測(cè)序技術(shù)結(jié)合， 分別利用它們的高通量和較長(zhǎng)讀長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)， 可以大大降低測(cè)序成本， 提高測(cè)序速 度。2) 重測(cè)序 如果對(duì)照一個(gè)參考基因組， 新一代測(cè)序技術(shù)可以短時(shí)間內(nèi)非常輕松的 完成一個(gè)基因組的重測(cè)序3) SNP研究 SNP全稱(chēng)是 Single Nucleotide Polymorphism，意即單核苷酸多態(tài)性, 是指不同個(gè)體的基因組上單個(gè)核苷酸的變異，包括替換、缺失和插入。 SNP 是指變異頻率大于 1 % 的單核苷酸變異，人體許多表型差異、對(duì)藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關(guān)4) 轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜分析 基因表達(dá)譜指細(xì)胞在特定的條件下表達(dá)的所有基因。 以 往的基因表達(dá)譜分析主要依靠基因芯片技術(shù)， 該技術(shù)需要依賴(lài)已知的基因序列來(lái) 設(shè)計(jì)探針，通過(guò)熒光標(biāo)記和雜交， 根據(jù)熒光的強(qiáng)度計(jì)算表達(dá)量的多少， 誤差較大 , 而且無(wú)法檢測(cè)未知基因的表達(dá)量。第二代測(cè)序技術(shù)可對(duì)單個(gè)細(xì)胞樣品