抗氧化酶活性等測定方法

1、葉綠體的提取一、試劑配置1、 PBS 提取液：每 L 水依次加入 MES(195.2 X0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33 x182.2=60.126g) 、NaCI(0.010 X58.5=0.585g )、MgCl (0.002 X95=0.19g )、EDTA (292.25 X0.002=0.5845g )、KH2PO4 (200X0.0005=0.1g);使用時加入 ASA-Na ( 198.1 X0.002=0.3962g);2、 懸浮液：將 PBS 提取液中的 MES 換為 238.3 X0.05=11.915g的 HEPES (238.3 X0.05=11.915g )

2、;3 、 80%Percol ： 80ml 原液 +20ml 水； 40%Percol ： 40ml 原液 +60ml 水；實際配制：PBS提取液2000ml(3 個處理*2個品種*3個重復*20ml*3 次=1080ml),懸浮液100ml(3個處理*2個品種*3個重復*1ml*3 次=54ml );80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.(3 個處理 *2 個品種 *3 個重復 *3ml*3 次=162ml )二、提取步驟1、10g 鮮樣加 20ml 提取 PBS (50mM MES PH6.1 ，含 0.33M 山梨糖醇，10mM NaCl ，2mM MgCl

3、2， 2mM EDTA ， 0.5 mMKH 2PO4， 2mM ASA-Na ， ASA-Na 使用前現(xiàn)配現(xiàn)加)2、 快速研磨，使葉片碎成綠豆粒大小，4 層紗布過濾，去除殘渣(注意過濾時不可用力擠壓，以免葉綠 體膜破碎)3、濾液 2000g 3min ，小心倒出上清液，將離心管放入離心機后，使離心機的加速很快上升到預定值(水平轉(zhuǎn)頭，加速度調(diào)到 9)，約經(jīng) 30s 后很快使其下降停止，整個離心持續(xù)大約 2-3min 左右完成；4 、沉淀用 1ml 提取液漂洗表面懸浮物；5、用 1ml 懸浮液( 50mM HEPES pH 7.6 ，含0.33 mM 山梨糖醇， 10mM NaCl ， 2mM

4、MgCl 2， 2mMEDTA， 0.5 mMKH 2PO4，2mM ASA-Na ，ASA-Na 使用前現(xiàn)配現(xiàn)加）將沉淀懸浮，在分散葉綠體時宜用 毛筆輕輕刷，或者用手握住離心管在冰塊之間攪動，使葉綠體由于震動分散開來，不要用棉球吸濾，以防被膜壓破。葉綠體懸浮時要濃點，含葉綠素 2mg.ml -1 以上，這樣有利于保持活性。6 、 2000g 1min;7、沉淀再用懸浮液懸浮 ;（懸浮液同 5 ，可以不做 ）8 、用 Percol 試劑進行梯度離心（將 3ml 含有 80%Percol （原液按 100% 算）鋪在 10ml 離心管下層，再 把 3ml 40%Percol 鋪在離心管中層， 然

5、后將 1ml 葉綠體懸浮液輕輕鋪在離心管上層） 1500g 2-3min （用 水平離心頭的離心機，離心機加速要緩慢上升，加速度調(diào)到1 ），下降也要緩慢下降，否則會破碎 Percol的濃度梯度層的形成，取出會看到 3 層綠色帶，最上層為破碎的葉綠體，沉在地層的為粗顆粒， 40-80% 的 Percol 之間的界面有一層綠色層為完整的葉綠體 ;9、小心吸出，轉(zhuǎn)移到懸浮介質(zhì)中，使葉綠體濃度達到1mg.ml -1 ；（計算：取葉綠體懸浮液 0.1ml ，加 4.9ml 80% 的丙酮，搖勻后于 1000g 離心 2min ，上清液置于 1cm 的比色杯，在 625nm 上比色，按照公式 計算：OD

6、625nm X50/34.5=葉綠素 mg/ml ）10 、測定葉綠體的完整性，完整率達到 85-95% ；參考： Takeda K, Otaubo T,Konda N. Participation of hydrogen peroxide in the inactivation of Calvin-cycle SH enzyme in so2-furmugated spinach leaves. Plant and cell Physiology,1982,23:1009-1018.取上述制備的完整葉綠體進行如下測定：1、 用50mM PBS （保護酶或其他測定項目的緩沖液）稀釋 2-5倍，

7、用于測定 SOD、POD、CAT、APX ;2、用冷丙酮稀釋2倍，取0.5ML提取液用于測定 H2O2 ；（本試驗中用0.2 mol/L HClO 4稀釋）3、用 5% 的 TCA 稀釋 2-5 倍，取 1.5ml 用于測定 MDA ；4、用乙醇：丙酮：水 =4.5 ： 4.5 ： 1 稀釋，用于測定葉綠素；抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）活性測定方法一、 超氧化物歧化酶（ SOD ）活性測定（氮藍四唑光化還原法）1、試劑的配制（ 1）0.05mol/L 磷酸緩沖液 （PBS，pH7.8） ：A 母液：0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液：取 Na2HPO4 32H2O （分子量 358

8、.14 ） 71.7g ;B 母液：0.2mol/L 磷酸二氫鈉溶液：取 NaH2PO42H2O （分子量 156.01）31.2g。分別用蒸餾水定容到 1000ml 。0.05mol/L PBS （ pH7.8 ）的配制：分別取 A 母液（W2HPO4） 228.75ml ,B 母液（NaH 2PO4） 21.25ml ， 用蒸餾水定容至 1000ml 。參考文獻：李合生主編：植物生理生化實驗原理和技術(shù).高等教育出版社，2000 : 267268。（2）14.5mM 甲硫氨酸溶液：取 2.1637g Met 用磷酸緩沖液（ pH7.8 ）定容至 1000ml 。（3） 30 M EDTA-N

9、a 2溶液：取 0.001gEDTA-Na 2用磷酸緩沖液定容至 100ml。（4） 60 M核黃素溶液：取 0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml ,避光保存。（5）2.25mM 氮藍四唑（NBT）溶液：取0.1840g NBT 用PBS定容至100ml，避光保存。（上述試劑先配好，放到 4 度冰箱，用之前臨時按下面的方法配，然后放在 4 度冰箱中，不要在最上層， 避免見光，第一組樣品加好后拿出來加，加完后放回冰箱，第二組的樣品加好后再拿出來加）酶液制備：取0.2g （可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預冷的研缽中，加入1.6ml50mmol/L 預冷的磷酸緩沖液（pH

10、7.8 ）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在 4 C 12000g下離心20min , 上清液即為酶液。2 、酶活性測定1）反應混合液配制 （以 60 個樣為準 ）：分別取 Met 溶液 162ml ，EDTA-Na 2溶液 0.6ml （加的量和前面的濃度要核對） ，磷酸緩沖液 5.4ml ， NBT 溶液 6ml ，核黃素溶液 6ml, 混合后搖勻；SOD 反應混合液： 3 個處理 *2 個品種 *3 次重復 *3ml*3 次測定 =162ml（ 實際配置 200ml）（2）分別取3ml反應混合液和30訕（可視情況調(diào)整，最好先做一個濃度梯度，看加多少合適，如果 量太少，最好稀釋后再加，這樣

11、精確）酶液于試管中（盡可能加到試管的底部，要靠著試管壁打下去先加 酶液，后加反應液，加好后搖一搖，看看試管上是不是有霧氣，最好拿紗布把試管下邊擦一下，免得霧氣 擋住光線照過去） ；（3）將試管置于光照培養(yǎng)箱中在 4000 lux 光照下反應 20min ；（照光很重要，試管要選擇相同規(guī)格 的，因為不同的試管透光率是不一樣的，試管架不要選擇遮光的，這個最好分組做，同時幾組做相互之間 會遮光，每一組一個重復，就是每一組中都要有所有的處理，且都要有一個最大管，處理多的話，把根和 葉分開做，最大管放在中間）同時做兩支對照管，其中 1支試管取3ml反應混合液加入 30 M PBS （不加酶液）照光后測定

12、作為最 大光還原管，另 1 支只加緩沖液置于暗中測定時用于調(diào)零。（ 4）以不照光的對照管（只有緩沖液并置于暗處）調(diào)零后，避光測OD560（ 出現(xiàn)顏色即可測定 ）。（ 5）酶活性計算： SOD 活性單位以抑制 NBT 光化還原 50 所需酶量（測的樣品值要在最大管的一 半左右才合適，否則要調(diào)整酶量）為 1 個酶活單位（ u）。SOD 總活性=（Ack-AE ）XV/ （ 1/2A ck XW XVt）SOD比活力=SOD總活性/蛋白質(zhì)含量SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（u/g FW ）;比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示； Ack為照光對 照管的吸光度；Ae為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（m

13、l,1.6ml，加入PBS的體積）;Vt為測定時的 酶液用量 （ml， 30ul ）； W 為樣品鮮重 （g ，測定時應換算為葉綠體的質(zhì)量 mg ）；蛋白質(zhì)含量單位為 mg/g二、POD、CAT酶活性的測定粗酶液制備同 SOD 。1、過氧化物酶（ POD ）活性測定（愈創(chuàng)木酚法）（1）試劑配制：0.2mol/L 磷酸緩沖液（pH6.0）:分別取 A 母液（Na 2HPO 4 ） 123ml 和 B 母液（NaH 2PO4 ） 877ml 混勻 即為 1000ml PBS（0.2M ，pH6.0） ；（2）反應混合液配制（以 60 個樣為準） :取 200ml PBS（0.2M ，pH6.0）

14、，加入 0.076ml 液體（原液）愈創(chuàng)木酚（ 2- 甲氧基酚）加熱攪拌溶解， 冷卻后加入 0.112ml 30 的 H 2 O 2，混勻后保存于冰箱中備用。POD 反應混合液: 3 個處理 *2 個品種 *3 次重復 *3ml*3 次測定 =162ml （實際配置 200ml,0.076ml,0.112ml）（3）樣品測定:取3ml反應液并加入30訕酶液，以PBS為對照調(diào)零，而后測定 OD470值（測定40秒）。（邊加樣邊測定， 測定前等待 5 秒，動作要快， 如果慢的話， 要保證每個樣品從加好樣到開始記時的時間相差不大）（4）酶活性計算:以每 min OD 值變化（升高） 0.01 為1

15、個酶活性單位（ u）。POD= （AA470 XVt） / （W XVs X0.01 xt）（u/g min）AA470 :為反應時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重（g） ; t為反應時間（min） ; Vt為提取酶液總體積（ml , （1.6ml ）; Vs為測定時取用酶液體積（ ml , 30ul ）。2、過氧化氫酶（ CAT ）活性測定1)試劑配制：0.15mol/L 磷酸緩沖液(pH7.0 ):取 A 母液(Na2HPO4)457.5 ml 和 B 母液(NaH 2PO4) 292.5 ml 混合后用蒸餾水定容至 1000ml 。(2) 反應液配制：取 200ml PBS (0.15M

16、, pH7.0 ),加入 0.3092ml 30% 的 H2O2 (原液)搖勻即 可。CAT反應液：3個處理*2個品種*3次重復*3ml*3 次測定=162ml(實際配置200 ml, 0.3092ml )(3) 樣品測定：取3ml反應液加入0.1ml (可視情況調(diào)整)酶液，以PBS為對照調(diào)零，測定OD240 (紫外)(測定 40s)。(4) 酶活性計算：以每 min OD 值減少 0.01 為 1 個酶活性單位( u)。CAT= AA240 XVt / (W XVs X0.01 xt)(u/g min)AA240 :為反應時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g) ; t為反應時間(min) ;

17、 Vt為提取酶液總體積(ml ,1.6ml ); Vs為測定時取用酶液體積( ml, 0.1ml )。三、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的測定(緩沖液為 K)1 、試劑配制(按 50 個樣計算) ：(1) 0.05 mol/L K 2HPO4-KH2PO4 緩沖液(pH7.0 )的配制：(A) K2HPO4 3H2O : 228.22 X0.05 X0.61=6.9607g(B) KH2PO4：136.09 x0.05 x0.39=2.6538g ，以上兩者混合起來用去離子水定容到 1L。(2) 0.1 mM EDTA-Na 2：取 0.01861g EDTA-Na 2用 PBS 溶液定容到

18、 500 ml (372.24 g/M X0.1mM x500ml=0.01861 g)；（3） 5 mM AsA :取0.044g 抗壞血酸用 PBS溶液定容到 50ml （現(xiàn)用現(xiàn)配，176.13g/M5mM X 50ml=0.044 g ）;（4 ） 20mMH 2O2 :取 0.2ml,30%H 2O2 用去 離子水 稀釋到 100ml（ 30% H2O2 為 550g X30%/（34.01g/M X0.5L）=9.703M）。實際配置0.1 mM EDTA-Na 2: 3個處理*2個品種*3次重復*1.7ml*3 次測定=91.8ml;（實際配置250ml,0.009305g）5 m

19、M 的AsA: 3個處理*2個品種*3次重復*0.1ml*3 次測定=5.4ml;（實際配置50 ml,0.044g）20mM H 2O2: 3個處理*2個品種*3次重復*0.1ml*3 次測定=5.4ml;（實際配置50 ml,0.1ml ）2、酶活性的測定（以 2 ml體系測定）（1 ）取 0.10 ml 酶液（可視情況調(diào)整），加入 1.70 ml 含 0.1 mM EDTA-Na 2 的 PBS （0.05 mol/L , pH7.0 ）,再加入0.10 ml 5 mM 的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H 2O2，立即在20 C下測定 D290 （紫 外）值在40s內(nèi)（測定時

20、間內(nèi)變化大可測定的時間短點，否則長點）的變化，計算單位時間內(nèi)AsA減少量和酶活性（室溫下測定，緩沖液調(diào)零）。計算公式：OD/ XVr XVTA Xd XVt XWOD為反應時間內(nèi)吸光度的變化（40秒吸光度一0秒吸光度）；為反應時間（40秒）；Vr為反應 液體積（2mL ）; VT提取液體積（1.6mL ）; A為消光系數(shù)（2.8mM -1 .cm-1）; d為比色杯厚度（1cm ）; Vt測定液體積（0.1mL ）; W為樣品鮮重（0.2g ）。四、超氧陰離子自由基（O2.-）產(chǎn)生速率的測定（羥胺氧化法）1、試劑的配制（ 1）1mM 鹽酸羥胺溶液：稱取 0.02085g 鹽酸羥胺用蒸餾水定容至

21、 300ml ；（ 2）17mM 對氨基苯磺酸溶液：稱取 1.1776g 對氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水 =1 ：3 配制）加熱溶解后定容至 400ml ；（3 ）7mM a-萘胺溶液：稱取0.4008g a-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3 : 1配制）定容至400ml 。實際配置PBS （0.05M , pH7.8 ） : 3個處理*2個品種*3次重復*0.5ml*3 次測定=27ml;（實際配置100 ml ）1mM 鹽酸羥胺溶液 : 3 個處理 *2 個品種 *3 次重復 *1ml*3 次測定 =54ml; （實際配置100ml,0.00695g ）17mM 對氨基苯磺酸

22、 : 3 個處理 *2 個品種 *3 次重復 *1ml*3 次測定 =54ml; （實際配置100ml,0.2944g ） 7mM a-萘胺溶液：3個處理*2個品種*3次重復*1ml*3 次測定=54ml;（實際配置100ml,0.1004g ）2、O2-含量的測定（ 1 ）樣品液提取方法同 SOD 測定；（2）取 0.5ml 提取液（酶液）（可視情況調(diào)整用量） 中加入 0.5ml PBS（0.05M ， pH7.8 ）， 1ml 1mM 鹽酸羥胺溶液后搖勻。（3 ）在25 C下保溫1小時；（4）依次先加入1ml 17mM 對氨基苯磺酸，再加入1ml 7mMa-萘胺，混合后快速搖勻；（5 ）在

23、25 C下保溫20min后在3000 Xg下離心3min后馬上進行測定（或置于冰箱待測）;（ 6）以對照管調(diào)零（用水調(diào)零） ，取粉紅色水相液測定 OD530 值（測定）；（7） O2.-含量的計算：由測得的 OD530，查NO 2-標準曲線得到NO 2-;根據(jù)羥胺與 02.-的反應式： NH 2OH + 20 2.- + H+NO 2- + H2O2 + H20 計算0 2.-，即NO 2- X2=0 2.-;再根據(jù)樣品與羥胺反應的時間和樣品中的蛋白質(zhì)含量， 求得02.-產(chǎn)生速率（以nmol min -1 mg -1蛋白表示，也可以nmol min -1 g-1 鮮重表示） 。02.-產(chǎn)生速率

24、=（CXV） / （t XW）（nmol min -1 g-1 鮮重）C為標準曲線上查得的濃度（umol/L） ; V為測定時所取提取液用量（葉綠體稀釋后的體積）;t為反應時 間 （60min） ; W 為樣品鮮重 （葉綠體實際質(zhì)量 g）參考文獻：王愛國，羅廣華.植物生理學通訊， 1990 , （ 6）: 5557五、可溶性蛋白含量的測定（考馬斯亮藍染色法）1、試劑的配制（1）考馬斯亮藍溶液配制：稱取 100 mg 考馬斯亮藍，溶于 50 ml 90 乙醇中，加入 100 ml 85 （W/V ）的磷酸，再用蒸餾水定容到1 L。在過夜后過濾并貯于棕色瓶中，常溫下可在暗中保存一個月。（2）100

25、呃/ml牛血清蛋白（BSA ）標準溶液：稱取 25mg BSA加水溶解后定容至 100 ml，再從 中吸取40ml用蒸餾水定容至 100 ml （也可取10mg BSA 定容至100ml即為100呃/ml標準BSA溶液）。實際配置0.05M，pH7.8磷酸緩沖液：3個處理*2個品種*3次重復*0.08ml*3 次測定=0.3456ml;（實際配置 100 ml, ）考馬斯亮藍溶液：3個處理*2個品種*3次重復*2.9ml*3次測定=156.6ml;（實際配置200 ml ,20mg ）2、樣品可溶性蛋白含量的測定（1 ）樣品可溶性蛋白含量測定：取 20訕提取液（酶液）加入 80訕，0.05M，

26、pH7.8磷酸緩沖液（即 稀釋成0.1ml提取液），再加入2.9ml考馬斯亮藍溶液，反應2min后測OD595 （以100訕緩沖液加2.9ml考馬斯亮藍為對照調(diào)零）（2）蛋白質(zhì)含量計算：可溶性蛋白質(zhì)含量（mg/g ） =（C Wt）/（W xVsOOOO）C為標準曲線查得的蛋白質(zhì)含量（卩g ）; Vt為提取液總體積（稀釋后的體積ml ） ; Vs為測定時所用提取液體積（ml，20訕）；W為樣品鮮重（g ）。過氧化氫（H2O2 ）含量的測定一、試劑配制：1、 0.2 mol/L HClO 4：取 10.05g HClO 4溶解于 0.5L 的水中；2、4 mol/L KOH ：取 112 g K

27、OH 溶解于 0.5L 的水中；3、 0.1 mol/L , pH 6.5 的磷酸緩沖液：Na 2HPO 4 42H 2O5.6407g+NaH 2PO4 2H 2O5.3433g 用去離子水 定容到 500ml ；4、 顯色液：100mL、0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液+25 此N,N-二甲基苯胺+10 mg 4- 氨基氨替吡啉；5 、過氧化物酶溶液（ 250 U/mL ）二、測定步驟：稱取植株根和葉片組織各0.5g，分別置于研缽中，加入1.6 mL預冷至4 C的0.2 mol/L HClO 4,冰浴勻漿，于10 000 xg離心5 min （4 C）,取上清液，加 4 mol

28、/L KOH 調(diào)pH值為7.5后，再于10 000 xg離心5 min （4 C）,取上清液1 mL，加0.4 mL顯色液和0.1mL過氧化物酶溶液（250 U/mL ）,用 島津UV-1601分光光度計測定波長 550 nm （可見）處光密度值的變化， H2O2含量以卩mol/gFW 表示。（ 用什么調(diào)零？ ）三、計算方法：（ 要做標線？ ）參考：過氧化氫（H2O2）含量的測定參照 Uchida等（2002）方法并加以改進。還原型谷胱苷肽 GSH2 試劑配制（1）1mM GSH 標準液 10mL （現(xiàn)用現(xiàn)配）：稱 3.0733mgGSH, 加蒸餾水至 10mL 。（不要）（2）5磺基水楊酸

29、500mL ： 25g 溶于 500mL 水中。（3）6mM DTNB ：稱取 0.118905g DTNB 溶于 50mL PBS （0.1M ，pH7.5 ）中。（4）2mM NADPH ：18.1mg NADPH溶于 10mL PBS 中。（5）ImMGSSG 標準液 10mL : 6.126mg GSSG 力口 PBS 至 10mL。（不要）實際配置0.1M PBS（pH 7.5）:3個處理*2個品種*3次重復*0.5ml*3 次測定=27ml;（實際配置50 ml ）6mM DTNB: 3 個處理 *2 個品種 *3 次重復 *0.2ml*3 次測定 =10.8ml; （實際配置 5

30、0 ml ，實際用量0.1189g ）2mM NADPH: 3 個處理 *2 個品種 *3 次重復 *0.1ml*3 次測定 =5.4ml; （實際配置 50 ml, 實際用量18.1mg ）（1U）GR川：3個處理*2個品種*3次重復*0.1ml*3 次測定=5.4ml;（實際配置50 ml,實際用量10ml ）5 磺基水楊酸: 3 個處理 *2 個品種 *3 次重復 *0.01ml*3 次測定 =0.54ml; （實際配置 10ml ） （實際用量 0.5g/10ml）0.5mM PBS: 3個處理*2個品種*3次重復*1.5ml*3 次測定=81ml;（實際配置100 ml ）乙醚（二乙

31、醚）:3個處理*2個品種*3次重復*10ml*3 次測定=540ml;（實際配置1000 ml ）PBS Buffer 0.5mM:3個處理*2個品種*3次重復*1.5ml*3 次測定=81ml;（實際配置150 ml ）2-乙烯吡啶:3個處理*2個品種*3次重復*0.2ml*3 次測定=10.8ml;（實際用量20 ml ）乙醚:3個處理*2個品種*3次重復*10ml*3 次測定=540ml;（實際用量1000 ml ）1標線制作：配制濃度為 0 ，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM的標準 GSH 溶液（吸取上述標準液各 0.1mL ）加入 0.

32、5mL 0.1M 磷酸鈉 Buffer （pH7.5 ）（含 5mM EDTA） ，0.2mL 6mM DTNB,0.1mL 2mM NADPH,0.1mL（1U）GR 川（谷胱甘肽還原酶）（sigma）,從O.ImL GSH 啟動反應，測定650s的A412 （OD412 ），繪制標準曲線。以 PBS 代替 DTNB 作空白。3 . GSH （還原型谷胱甘肽）及GSSH （氧化型谷胱甘肽）（1 ）取1g新鮮葉片，加入10卩L （可以取0.2g鮮樣，加1.6ml提取液）5 %磺基水楊酸，研磨后在 14000g 離心 10 分鐘，取 1mL 上清液，加入 1.5mL,0.5mM PBS （pH7.5 ）中，再用 5mL 乙醚（二乙 醚）抽取二次（雜質(zhì)會融到乙醚層中，而乙醚處于整個反應體系得上層，你直接用槍吸取上層乙醚丟棄即 可，反復進行兩次即為抽取兩次） ，此提取液用于分析總谷胱苷肽含量。各取 1mL 上清液，加入 1.5mL PBS Buffer 0.5mM （pH7.5）,0.2mL 2- 乙烯吡啶（原裝試劑濃度）混 合至乳膠狀，在25 C反應1小時，再用5mL乙醚（原裝試劑濃度）抽提 2次，此提取液用于分析 GSSG GSSG -氧化型谷胱甘肽，GSH -還原型谷胱甘肽不能夠直接測出，需測出氧化型和還原型谷胱甘肽含量，即總的谷胱甘肽含量，然后減去氧化型谷胱甘肽