蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法

1、蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法編制說(shuō)明(征求意見(jiàn)稿)、任務(wù)來(lái)源本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)二()一五年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制 修訂項(xiàng)目,項(xiàng)目編號(hào)“20154061-T-424”。本項(xiàng)任務(wù)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出 并歸口，定于2016年完成。本標(biāo)準(zhǔn)起草工作組山中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、河北農(nóng)業(yè)大 學(xué)、浙江工商大學(xué)等單位共同組成。二、目的及意義絲氨酸蛋口酶是一類裂解肽鍵的蛋口酶，其活性中心的親和氨基酸為絲氨 酸，它們?cè)谏镉袡C(jī)體中起著重要而廣泛的生理作用。絲氨酸蛋口酶超家族被 分為胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶兩個(gè)大家族，蛋白酶K (EC 3.4.21.14)屬于枯 草桿菌蛋白酶家族,是由林伯氏白色念球菌(Tr

2、itirachium album Limber)產(chǎn)生的 一類主要蛋白酶。因其能消化角蛋白(keratin),故將其稱作蛋口酶K。蛋白酶 K擁有典型的絲氨酸活性位點(diǎn)：Asp39-His69-Ser224o蛋口酶K具有穩(wěn)定的結(jié) 構(gòu)、極高的酶活力和廣泛的底物特異性，但偏好于帶有脂肪族及芳香桂的肽 鏈，能優(yōu)先分解與疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸竣基端連接的肽 鍵，因而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和科學(xué)研究領(lǐng)域，也因此吸引了來(lái)自學(xué)術(shù) 界、工業(yè)和農(nóng)業(yè)團(tuán)體的研究興趣?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展依賴于生物技術(shù)用的一些酶類，這些酶對(duì)與基因工程 技術(shù)的作用，就如同CPU對(duì)與電腦的重要性一樣，它們是現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中 用

3、于研究和開(kāi)發(fā)基因工程產(chǎn)品和分子生物學(xué)研究的最基礎(chǔ)物質(zhì)。如果我國(guó)沒(méi)有 獨(dú)立的生物技術(shù)用酶的生產(chǎn)體系，就不會(huì)有獨(dú)立的現(xiàn)代化生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。作為 一個(gè)大國(guó)，我國(guó)應(yīng)該建立自主的蛋白酶K生產(chǎn)體系，以適應(yīng)生物產(chǎn)業(yè)的快速發(fā) 展。在政府監(jiān)管中，標(biāo)準(zhǔn)的重要價(jià)值在于它架起了法律與科學(xué)之間的橋梁，提 高了行政決定過(guò)程的公開(kāi)性與結(jié)果的準(zhǔn)確性，為規(guī)范和控制行政裁量權(quán)提供了 工具?？谠兾覈?guó)在誠(chéng)信制度沒(méi)有健全、存在巨大經(jīng)濟(jì)利益誘惑的情況下，對(duì)于 生物產(chǎn)業(yè)的監(jiān)督，政府主管部門才是最有公信力和最能承擔(dān)責(zé)任的。因此，開(kāi) 展蛋白酶K技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)研究是政府實(shí)施科學(xué)監(jiān)管、有效監(jiān)管的必要技術(shù)支撐。通過(guò)研究制定基因工程常用蛋白酶K國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，有利

4、于加快分子生物學(xué)實(shí) 驗(yàn)的速度、提高分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，從而提升整體分子 生物學(xué)研發(fā)水平，產(chǎn)生廣泛的社會(huì)效益。建立我國(guó)獨(dú)立自主的蛋白酶K工業(yè)系 統(tǒng)，即可創(chuàng)造出可觀的經(jīng)濟(jì)效益乂能解決我國(guó)LI前主要依賴國(guó)外進(jìn)口蛋口酶K 的問(wèn)題，突破國(guó)內(nèi)生物技術(shù)酶產(chǎn)業(yè)發(fā)展受制于人的瓶頸。要對(duì)所檢測(cè)的產(chǎn)品或 相關(guān)過(guò)程的特性進(jìn)行符合性判定，就需要制定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。要對(duì)產(chǎn)品或相關(guān)過(guò)程 的特性進(jìn)行定量檢測(cè)，就需要依據(jù)經(jīng)過(guò)科學(xué)評(píng)估的、可重復(fù)的、公認(rèn)的檢測(cè)方 法。LI前，基因工程進(jìn)步如此之快，對(duì)相關(guān)的定性定量分析方法進(jìn)行全面的分 析方法的驗(yàn)證非常有必要，只有可靠穩(wěn)定的系列檢測(cè)方法才能得出可靠的結(jié) 果，才能保障這一新

5、興的產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。在我國(guó)涉及蛋白酶酶活力測(cè)定方法的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，提供的方法具有普適 性，然而其各種參數(shù)設(shè)定范圍寬，針對(duì)性差。這就導(dǎo)致不同廠商的蛋口酶K酶 活力單位定義不統(tǒng)一，從而無(wú)法對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量做出準(zhǔn)確的判定，繼而影響到其合理 的使用。因此，亟待系統(tǒng)研究并確定蛋白酶K酶活力測(cè)定體系中的各項(xiàng)參數(shù)， 以建立蛋白酶K酶活力測(cè)定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。D前，可用于蛋白酶K活力檢測(cè)的方 法很多，但到LI前為止，國(guó)家尚未發(fā)布相關(guān)蛋口酶K活力檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)，這 給人們使用蛋白酶K帶來(lái)很大的不變，而且不同的生產(chǎn)廠家因其檢測(cè)方法不同, 故對(duì)蛋口酶K的酶活力定義也不同，使得使用者無(wú)法對(duì)不同廠家的蛋口酶K活 力進(jìn)行正確的評(píng)價(jià)與

6、比較，為購(gòu)買與使用帶來(lái)困難。因此，對(duì)其活性檢測(cè)方法的 需求也越來(lái)越迫切，蛋白酶K活性檢測(cè)方法的建立，將為更多的行業(yè)使用蛋白 酶K帶來(lái)很大的便利。三、標(biāo)準(zhǔn)制定原則及主要內(nèi)容（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則標(biāo)準(zhǔn)的制定過(guò)程中采用文獻(xiàn)調(diào)查法、專家座談法、科學(xué)試驗(yàn)法等多種研究方 法，方法科學(xué)先進(jìn)、過(guò)程周密嚴(yán)謹(jǐn)、數(shù)據(jù)真實(shí)可信、結(jié)果明確。本標(biāo)準(zhǔn)是為相關(guān)組織的蛋白酶K檢測(cè)提供技術(shù)支撐，考慮到生產(chǎn)、監(jiān)管等不 同需求，在方法選擇上，主要基于產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、現(xiàn)有成熟的技術(shù)以及試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證 基礎(chǔ)確定的，因此實(shí)用性較強(qiáng)。（二）標(biāo)準(zhǔn)制訂主要依據(jù)1、標(biāo)準(zhǔn)編寫遵循GB1. 1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和 編寫規(guī)則的有關(guān)要求。2

7、、標(biāo)準(zhǔn)編寫內(nèi)容參考了與蛋白酶K檢測(cè)相關(guān)文獻(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)參照了 GB/T6379. 1-2004測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第1部分總則與 定義和GB/T 6379. 2-2004測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度笫2部分確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量 方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法。3、本標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法參考了 GB/T 28715-2012飼料添加劑酸性、中性蛋白 酶活力的測(cè)定-分光光度法和SB/T 10317-1999蛋口酶活力測(cè)定法中的酶活 力和酶活力單位的定義和檢測(cè)流程，還借鑒了 Sigma公司和Merk公司有關(guān)蛋口 酶K酶活力測(cè)定的文件。同時(shí)，通過(guò)系統(tǒng)地試驗(yàn)，驗(yàn)證了適于蛋口酶K酶活力 測(cè)定的底物種類、反應(yīng)體系pH

8、值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和酶濃度。（三）本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)主要包括以下7個(gè)部分：(1)范圍;(2)術(shù)語(yǔ)和定義；(3)原理；(4)儀器設(shè)備及器具;(5)主要試劑；(6)分析步驟；(7)結(jié)果分析等。四、主要工作過(guò)程（-）組成標(biāo)準(zhǔn)起草小組根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂有關(guān)程序和要求，2015年10月下旬，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究 院主持召開(kāi)了蛋口酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制定研討會(huì)。會(huì)上, 組成了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，明確了任務(wù)要求，安排了工作進(jìn)度，成立了標(biāo)準(zhǔn)起草工 作小組，會(huì)議研究討論了蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法初稿，對(duì)起草小 組在標(biāo)準(zhǔn)起草過(guò)程中的一些思考及難點(diǎn)問(wèn)題進(jìn)行了深刻討論，各單位代表就標(biāo)準(zhǔn) 內(nèi)容及方法選擇進(jìn)

9、行了討論。（二）開(kāi)展相關(guān)調(diào)研情況蛋口酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)屬于生物產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)，是支撐生 產(chǎn)方、第三方組織開(kāi)展產(chǎn)品評(píng)價(jià)的技術(shù)依據(jù)。起草工作小組首先針對(duì)生產(chǎn)和檢測(cè) 開(kāi)展了大量的調(diào)研匸作。從滿足實(shí)際檢測(cè)需要出發(fā)，開(kāi)展了國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料的收 集和確認(rèn)工作，資料的檢索和信息的收集過(guò)程中，分析比較了大量的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn) 方法。（三）標(biāo)準(zhǔn)起草完善過(guò)程在廣泛調(diào)查研究的基礎(chǔ)上，標(biāo)準(zhǔn)起草單位組織相關(guān)技術(shù)人員對(duì)蛋白酶K酶 活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)LI進(jìn)行了預(yù)研，課題組成員廣泛收集了國(guó)內(nèi)外蛋口酶 K酶活力及朵質(zhì)檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)，了解了國(guó)內(nèi)外相關(guān)技術(shù)動(dòng)態(tài)，并且明確 了工作思路和進(jìn)程安排，分析了通過(guò)前期的實(shí)驗(yàn)摸索

10、、反復(fù)論證，確定了本標(biāo)準(zhǔn) 方法設(shè)定的重要參數(shù)，開(kāi)展了實(shí)際樣品的檢測(cè)。然后依據(jù)GB/T 1.1-2000標(biāo)準(zhǔn) 化工作導(dǎo)則 笫1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則、GB/T 1.2-2002標(biāo)準(zhǔn)化工 作導(dǎo)則 第2部分：標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)范性技術(shù)要素內(nèi)容的確定方法等標(biāo)準(zhǔn)編制要求， 對(duì)蛋口酶K酶活力及朵質(zhì)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)展了起草工作。于2016年3月中 旬，起草工作小組完成了蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（草案）。 2016年6月，在北京組織有關(guān)單位和專家分別召開(kāi)了標(biāo)準(zhǔn)草案討論會(huì)，重點(diǎn)對(duì) 蛋口酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法選擇提出了完善建議。同時(shí)對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證, 針對(duì)驗(yàn)證所出現(xiàn)的問(wèn)題，在2016年11月11組織專家對(duì)標(biāo)

11、準(zhǔn)逐字逐句進(jìn)行了討 論完善，形成了蛋口酶K酶活力及雜質(zhì)檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿。五、國(guó)內(nèi)外研究概況通過(guò)測(cè)試蛋口酶K水解經(jīng)尿素變性的血紅蛋口的酶活性，顯示岀蛋口酶K 在pH7.5-12.0范圍內(nèi)都具有較高的酶活性。U前蛋白酶K通常使用的pH范圉是 7.5-9.0,蛋白酶K的最適pH是8.0。在37C時(shí)，蛋口酶K顯示出最拓的活性， 在20-60C之間蛋白酶K的酶活性可保持在80%以上。Shu-Qun Liu等人探討了 蛋白酶K在催化過(guò)程中動(dòng)力學(xué)機(jī)制，提出了在蛋白酶K的催化三分子中，Asp39 和His69以及His69和eSer224之間靜電和氫鍵的相互作用，使得一些在催化 過(guò)程中起到不同功能的

12、催化殘基，具有不同的熱動(dòng)力學(xué)和取向。之后，陶燕分 別對(duì)沒(méi)有底物結(jié)合的蛋白酶K和結(jié)合了肽底物AAPA的蛋白酶K進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間分 子動(dòng)力學(xué)模擬，以研究底物結(jié)合對(duì)蛋口酶K的動(dòng)力學(xué)行為和分子運(yùn)動(dòng)特征的影 響。結(jié)果顯示，在動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中，與底物結(jié)合的蛋口酶K比沒(méi)有底物結(jié)合 的蛋口酶K具有更加致密穩(wěn)定的構(gòu)象。提出了大尺度的協(xié)同運(yùn)動(dòng)所導(dǎo)致的底物 結(jié)合口袋動(dòng)力學(xué)行為與底物的識(shí)別、結(jié)合、定位以及產(chǎn)物的釋放相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn) 底物結(jié)合口袋區(qū)域運(yùn)動(dòng)模式可以調(diào)整酶與底物之間的動(dòng)態(tài)相互作用。補(bǔ)充了前 人的生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究結(jié)果，從分子運(yùn)動(dòng)和蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)角度闡釋了 蛋口酶K的催化機(jī)制。蛋白酶K含有兩個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，距離

13、酶的活性中心有一定的距離，它們 與催化機(jī)理并無(wú)直接關(guān)系，但當(dāng)用EDTA去除Ca?+之后，催化活性將在6h之內(nèi) 降低至原來(lái)的20%,這是山于Ca2+的去除引發(fā)了底物識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)象的改變。同 時(shí)Cf+的去除會(huì)影響氯屮烷類較長(zhǎng)肽抑制劑的結(jié)合，提高了 48 h之后的自溶 率，降低了蛋口酶K的熱穩(wěn)定性等。蛋口酶K在抑制劑如尿素和SDS存在時(shí)仍 能保持較高的穩(wěn)定性。在除去Ca后其剩余活性通常不足以降解在一般情況下 污染酸制品的蛋白質(zhì)，所以蛋白酶K消化過(guò)程中通常加入EDTA。但是，如果 要消化對(duì)蛋白酶K具有較強(qiáng)耐性的蛋口，如角蛋白一類，則可能需要使用含有 lmmol/LCa2+而不含EDTA的緩沖液。在消化完

14、畢后、純化核酸前要加入EGTA (pH8.0)至終濃度為2mmol/L,以螯合Ca*。蛋白酶K是一種絲氨酸蛋口酶，因此可以用苯屮基磺醸氟抑制其作用，苯 屮基磺酰氟是一種絲氨酸蛋白酶的抑制劑，在純化蛋白質(zhì)時(shí)用于防止蛋口質(zhì)的 降解。此外，Anilkumar R. Kore等人合成了 一種五肽化合物，即 MeOSuc-AAAPF-CH2Cl,可以抑制蛋白酶K的水解活性，濃度僅需要O.lmMo Jurgen Bajorath等人用單肽或二肽氯甲基酮對(duì)蛋口酶K進(jìn)行了處理，發(fā)現(xiàn)該化合 物對(duì)蛋白酶K的水解起到了一定的抑制作用?？捎糜诘鞍酌窴活力檢測(cè)的方法有以下兒種，每種實(shí)驗(yàn)方法都有各自的優(yōu) 缺點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)者需根

15、據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)條件來(lái)選擇適合的檢測(cè)方法。（1）紫外可見(jiàn)分光度法。該法是以酪蛋白為底物，在一定pH和溫度下反 應(yīng)后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定275nm處的吸光值，從而檢測(cè)酶活力。紫外 分光光度訃為L(zhǎng)I前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室普遍擁有的儀器設(shè)備，采用紫外分光光度法檢測(cè)蛋 白酶K活性簡(jiǎn)單易行便于實(shí)施。（2）福林一酚試劑法。該法實(shí)質(zhì)上是在一定溫度，一定pH下，一定時(shí)間 內(nèi)，蛋白酶K以酪蛋白或變性血紅蛋白為底物，將其水解成氨基酸，以測(cè)定氨 基態(tài)氮的量來(lái)衡量蛋口酶活力的數(shù)值，即用分光光度計(jì)測(cè)定680nm處的吸光值, 從而測(cè)定蛋白酶K的酶活力。該法操作簡(jiǎn)單，靈頌度較高，但測(cè)定中蛋口質(zhì)特 異性有影響，即不同的蛋白質(zhì)因所

16、含酪氨酸和色氨酸不同，顯色時(shí)其強(qiáng)度稍有差 別。另外，本法受多種因素干擾，凡對(duì)雙縮服反應(yīng)起干擾作用的基團(tuán)以及在性質(zhì) 上是氨基酸或肽的緩沖液均可干擾福林-酚反應(yīng)。所測(cè)氨基酸樣品若含酚類和檸 檬酸也干擾福林-酚反應(yīng)，在測(cè)試時(shí)應(yīng)排除干擾因素或做空白試驗(yàn)。（3）紫外光譜定量測(cè)定法。張寒俊等人建立了用紫外光譜法定量測(cè)定蛋口 酶K活力的新方法：釆用不同pH值的磷酸氫二鈉和檸檬酸溶液作為緩沖溶液， 使用紫外光譜法測(cè)定蛋口酶K的活力。該方法與福林-酚法比較，相對(duì)偏差W1%, 在允許誤差范圍內(nèi)，操作便捷、快速，試劑易得，可廣泛適用于蛋白酶K的活 力測(cè)定。（4）以 Sue- （Ala） 3-NH-Np 或 Suc-

17、（Ala）2-Pro-Phe-pNA 等試劑為底物，在 一定溫度和pH下反應(yīng)后用冰酷酸終止反應(yīng)，410nm測(cè)吸光值確定酶解反應(yīng)釋放 的硝基苯胺的量，從而檢測(cè)酶活性。（5）以酪蛋口或牛血清口蛋口為底物，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白酶活力， 以水解后剩余的蛋口質(zhì)含量來(lái)表達(dá)酶的活力?？捡R斯亮藍(lán)法不能直接反應(yīng)出酶活 力。（6）DNA/澳乙錠熒光分析法。當(dāng)澳乙錠插入雙鏈DNA的堿基對(duì)之間時(shí)， 可使DNA的熒光性增加，其熒光增加量與DNA的量成正比。組蛋白與DNA的 親和力很強(qiáng)，組蛋白結(jié)合到DNA的所有結(jié)合位點(diǎn)上，使澳乙錠不能與DNA結(jié) 合，從而熒光性降低。加入蛋口酶后水解組蛋口，使熒光性增加，通過(guò)測(cè)定熒光 增

18、加量來(lái)計(jì)算酶活力。此方法雖提高了底物特異性，但其操作復(fù)雜，儀器設(shè)備和 試劑均較為昂貴，不適宜普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行酶活測(cè)定。（7）流動(dòng)注射分析法（FIA）。用熒光素異硫氤酸鹽標(biāo)記底物牛血清口蛋 白（BSA）,然后將標(biāo)記的BSA偶聯(lián)到2-F-1甲基毗碇（FMP）活化的分離膠上, 制成分析柱，當(dāng)酶液流過(guò)分析柱時(shí)，將BSA上的熒光基團(tuán)解離下來(lái)，通過(guò)熒光 光度訃檢測(cè)酶解流出液的熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定蛋口酶活力。該方法測(cè)定酶活力時(shí)所具 有的優(yōu)缺點(diǎn)同（6）所示。六、關(guān)鍵試驗(yàn)內(nèi)容和技術(shù)指標(biāo)說(shuō)明6.1主要儀器與設(shè)備721G型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司），單孔四列型電熱 恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司），PH

19、S-3DW型pH計(jì)（上海儀電分析 儀器有限公司），GL-20G-H型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）等。6.2主要材料與試劑（1）底物：酪蛋白（Solarbio公司），角蛋白（梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有 限公司），血紅蛋白（源葉生物公司），組蛋白，牛血清白蛋白（BSA）,明膠O（2）蛋白酶：蛋口酶K,堿性蛋口酶，木瓜蛋口酶，菠蘿蛋口酶，胰蛋口酶，a- 胰凝乳蛋口酶。（3）其它試劑：L-酪氨酸，三氯乙酸（TCA）,無(wú)水碳酸鈉，三羥甲基氨基甲烷（Tris）, 磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，濃鹽酸，福林試劑（2N）,化學(xué)試劑均為分析純。6.3主要試驗(yàn)方法6.3.1 L酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線參考GB/T 28

20、715-2012分光光度法測(cè)定。精確稱取預(yù)先于105 1干燥至恒 重的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1000 g0.0002g,用1 mol/L鹽酸溶液20 ml溶解后，用 蒸鐳水定容至100 ml,即為lmg/mlL-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（0-4C保存）。準(zhǔn) 確吸取1 mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液10.0 mL,用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至100 mL,即得到100 P g/mL的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。按表1配置L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液。表1 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配置編號(hào)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度（pg/ml）酪氨酸儲(chǔ)備液體積（ml）蒸館水體積（ml）00010.0110.01.09.0220.02.08

21、.0330.03.07.0440.04.06.0550.05.05.0660.06.04.0770.07.03.0880.08.02.0990.09.01.010100.010.00分別吸取L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各1.0 ml于具塞試管中（每個(gè)濃度作2個(gè) 平行試驗(yàn)），各加碳酸鈉溶液5.0 ml和稀福林試劑1.0 ml,震蕩均勻。同時(shí)置于 在40 C水浴鍋中顯色20 min。取出，迅速冷卻至室溫，于分光光度計(jì)波長(zhǎng)680 nm 下測(cè)其吸光值，以0號(hào)管作為空白調(diào)儀器零點(diǎn)。以橫坐標(biāo)為L(zhǎng)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作 液濃度C （ Pg/mL）,縱坐標(biāo)則為吸光值A(chǔ)68O繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如下圖1所示。L整氨酸濃度（颼/mL

22、） the concentration ofL-tyiosine089 u. JOUBqJO主v圖1 L酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線6.3.2蛋白酶K酶活力測(cè)定的底物的確定6.3.2.1底物溶液的配制山于不同的蛋白質(zhì)底物的溶解性不同，故不同的底物溶液配制方法有差異。 除測(cè)定堿性蛋口酶的底物用0.1 mol/L的硼酸緩沖液（pH 10.0）配制以外，測(cè)定 其他蛋口酶的底物均用磷酸緩沖液（PBS）配制。（1）1%酪蛋白溶液，1%明膠溶液準(zhǔn)確稱取酪蛋白/明膠1.000 g,精確到0.001 g,加入0.1 mol/L氫氧化鈉5.0 mL濕潤(rùn)后，再加入0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH為受試酶的最適pH） 80

23、mL,于 磁力攪拌器上邊加熱邊攪拌30 min,直至完全溶解。冷卻后，用0.1 mol/L鹽酸 或0.5 mol/L氫氧化鈉，單向調(diào)整pH至磷酸緩沖液pH值，并轉(zhuǎn)移到100 mL容 量瓶中，用磷酸緩沖液定容至刻度。4 C冷藏備用。（2）1%角蛋白溶液用0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH為受試酶的最適pH）將5%濃度的角蛋口試 劑稀釋至1%, 4 C冷藏備用。（3）1%血紅蛋白溶液，1%BSA溶液，1%組蛋白溶液分別準(zhǔn)確稱取血紅蛋白，BSA,組蛋口 1.000 g,用0.1 mol/L的PBS （pH為 受試酶的最適pH）溶解并定容至100 mL, 4 C冷藏備用。6.3.2.2蛋白酶溶液的配

24、制分別準(zhǔn)確稱取待測(cè)蛋白酶0.0010 g,以0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH為受試 酶的最適pH,見(jiàn)表2）配制成1.0 mg/mL的樣品酶液，再稀釋至適宜的濃度作為 待測(cè)酶液。6種蛋口酶的最適反應(yīng)溫度及pH見(jiàn)表2。表2受試蛋白酶的最適反應(yīng)溫度與pH酶種類蛋白酶K木瓜蛋白渡蘿蛋白*胰凝乳蛋白酶胰蛋白酶堿性蛋白酶反應(yīng)溫度/C374055373745pH7.56.07.27.28.010.0注：中性蛋白酶以磷酸緩沖液配制并稀釋至適宜濃度，堿性蛋白朋以硼酸緩沖液配制并稀釋。6323蛋白酶活力檢測(cè)方法參考GB/T 28715-2012分光光度法測(cè)定6種蛋白酶酶活力。6.324底物種類對(duì)蛋白酶K酶活力

25、測(cè)定的影響選擇適宜濃度的蛋白酶K溶液，分別以酪蛋白，角蛋白，血紅蛋白，BSA, 組蛋白為底物，于37 C下反應(yīng)10 min,測(cè)定酶活力；以相應(yīng)底物對(duì)其他蛋口酶 酶活力測(cè)定的影響為對(duì)照，研究底物種類對(duì)蛋口酶K酶活力測(cè)定的影響。各種蛋 白酶反應(yīng)的最適溫度和pH參照表2。63.3蛋白酶K酶活力測(cè)定的最適pH值的確定(1) 配制 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液(pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0),并以各 pH 值緩沖液分別配制牛血紅蛋口溶液(1%)與蛋口酶K溶液(0.01mg/mL),按照 6.3.2.3方法在37 C水浴中反應(yīng)10 min后，離心后取上清液，顯色，檢測(cè)酶活力。(2) 配

26、制 0.01 mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液(pH 7.1、7.5、8.0、8.5、8.9),并 以各pH值緩沖液分別配制牛血紅蛋口溶液(1%)與蛋白酶K溶液(0.01mg/mL), 按照6.323方法在37 C水浴中反應(yīng)10 min后，離心后取上清液顯色，檢測(cè)酶 活力。6.3.4蛋白酶K酶活力測(cè)定的最適溫度的確定(1) 在以上試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以pH 8.0的0.01 mol/LTris-HCl緩沖液分別配制牛 血紅蛋白溶液(1%)與蛋白酶K酶液(0.01 mg/mL),按6.323方法，分別在 27C、37C、47C、57C, 67C水浴10 min之后，離心后取上清液顯色，檢測(cè) 蛋白

27、酶酶活力。(2) 在以上試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以pH 8.0的0.01 mol/LTris-HCl緩沖液分別配制牛 血紅蛋白溶液(1%)與蛋白酶K酶液(0.01 mg/mL),按6.323方法，分別在 52C、57C, 62C水浴10 min之后，離心后取上清液顯色，檢測(cè)蛋白酶酶活力。63.5蛋白酶K酶活力測(cè)定的反應(yīng)時(shí)間的確定在以上試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以pH 8.0的0.01 mol/LTris-HCl緩沖液分別配制牛血紅 蛋白溶液(1%)與蛋白酶K酶液(0.01 mg/mL),按6.323方法，在57C分別 水浴反應(yīng)2, 5,8, 10 , 12 min之后，離心后取上清液顯色，檢測(cè)蛋口酶酶 活力。6.3.6

28、蛋白酶K酶活力測(cè)定的適宜酶濃度的確定以pH 8.0的0.01 mol/LTris-HCl緩沖液分別配制牛血紅蛋白溶液(1%)與 蛋白酶 K 酶液(0.25, 0.05, 0.01, 0.002 mg/mL),按 6.323 方法，在 57C分 別水浴反應(yīng)10 min之后，離心后取上清液顯色，檢測(cè)蛋白酶酶活力。63.7商品蛋白酶K制劑酶活力測(cè)定驗(yàn)證以pH 8.0的Tris-HCl緩沖液分別配制牛血紅蛋白溶液(1%)與蛋白酶K酶 液(0.01 mg/mL),蛋白酶 K 分別來(lái)自 Solarbio,國(guó)產(chǎn)蛋 口酶 K, Merckx Calbiochem 公司。按6.323方法，在57C分別水浴反應(yīng)1

29、0 min之后，離心后取上清液顯色, 檢測(cè)蛋白酶K酶活力。6.3.8蛋白酶酶活力計(jì)算酶活力單位定義：在蛋白酶的最適反應(yīng)溫度和pH條件下，Imin水解蛋白 質(zhì)底物釋放1 nmol顯色呈福林試劑陽(yáng)性的氨基酸的酶量，即為1個(gè)酶活力單位, 以U表示。酶活力計(jì)算公式：從L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品的最終稀釋液酶活力。樣 品的酶活力按下式計(jì)算：” A x 4 x K x n 1X = x M x m10x：樣品酶活力(u/g) ； A：由L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出的最終稀釋液酶活力 (U/mL) : V：溶解樣品所使用容量瓶的體積(mL) ； 4：反應(yīng)體系試劑的總體 積(mL) ； n：樣品的稀釋倍數(shù)：M：

30、L-酪氨酸的摩爾質(zhì)量(181.20g/moL) ； m： 樣品的質(zhì)量(g) ; 10：反應(yīng)時(shí)間(min)。6.3.9重復(fù)性與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)試驗(yàn)取兩份平行樣，每批試驗(yàn)以相同步驟進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定。使用MicrosoftExceL97-2003工作表處理數(shù)據(jù)。6.4主要試驗(yàn)結(jié)果6.4.1蛋白酶K酶活力測(cè)定的底物的確定o o o O o o o O o o o OS 6 4 .2 Au.-irczG&-R史Wnu王 亠蛋白礙種類enzyme species圖2酪蛋白對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖2,與其他底物測(cè)得的酶活力相比，在以酪蛋口為底物時(shí)，蛋口酶K19和其他3種蛋白酶測(cè)得的酶活力均最高。Tf

31、flo o o o o o X Rlo (m、B-R史鑑蛋白醸種類enzyme species圖3角蛋白對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖3,表明角蛋口能較好地反映出微生物蛋口酶（堿性蛋白酶和蛋白酶K）酶活力，而不能反映出植物源蛋口酶（菠蘿蛋口酶和木瓜蛋口酶）酶活力。O002(Ye-R蠶圖4血紅蛋白對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖4,以血紅蛋白為底物基本能反映蛋口酶K的酶活力，而不能完全反 映其它蛋白酶酶活力，可用于蛋口酶K酶活力測(cè)定的底物，且其具有特異性。500-1000蛋白酶種類enzyme species2-vurFc (an)z 妲teuw&c ae-R農(nóng)題蛋白 酶種類enzyme species圖6明膠對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖6,以明膠為底物時(shí)，各種蛋口酶測(cè)得酶活力極低，除了胰凝乳蛋口 酶顯示了極低活性，蛋白酶K酶等其它五種蛋口酶活力均呈現(xiàn)負(fù)值。因此，明膠 也不適合作為蛋口酶K酶活力測(cè)定的底物。200圖7 BSA對(duì)蛋白酶K酶活力測(cè)定的影響根據(jù)圖7,以組BSA為底物時(shí)，蛋白酶K酶活力較低(137U/g),其相對(duì)酶活力 僅為2.09%,不足以展現(xiàn)蛋白酶K的酶活力。因此，BSA也不適宜作為蛋白酶K酶活 力測(cè)定的底物。綜合圖2至圖7的試驗(yàn)結(jié)果，在測(cè)定蛋白酶K酶活力時(shí)，可選擇角蛋白或血紅蛋白 作為底物。結(jié)合目前國(guó)內(nèi)外蛋白酶K制劑