阿立哌唑微生物限度檢查法驗證方案

1、kh1110005-01-2 一清 微生物計數方法再驗證方案 第3頁 共4頁 阿立哌唑微生物限度檢查法驗證方案文件編碼hd1109010-00-2copy 安裝位置房間號起草人日期驗證小組會簽項目負責人：驗證管理員：qc室主任：qa室主任：設備動力室主任：質量部經理：日期：日期：日期：日期：日期：日期：驗證記載 批準日期 執(zhí)行日期 00分發(fā)單位藥品生產質量管理文件 hd1109009-00-2 阿立哌唑微生物限度檢查法驗證方案 第 9 頁 共 9頁 1 主題內容 本方案規(guī)定了阿立哌唑微生物限度檢查細菌、霉菌及酵母菌計數方法和控制菌檢查方法的驗證。2 適用范圍：本方案適用于阿立哌唑微生物限度檢查

2、。3 職責項目負責人：負責起草驗證方案及實施，并對實驗數據結果準確性負責。驗證管理員：起草驗證方案，負責驗證協(xié)調工作，收集驗證資料、數據并出具驗證報告。qc室主任：負責審核驗證方案，并監(jiān)督驗證方案實施。qa主任： 負責審核驗證方案。質量部經理：負責驗證方案的批準。4 概述 根據中華人民共和國藥典2010版的規(guī)定，阿立哌唑需進行細菌數、霉菌和酵母菌數及控制菌的測定，為保證檢驗結果的準確可靠，特制定本方案對阿立哌唑的微生物限度檢查方法進行驗證。根據中國藥典2010年版一部附錄xc“微生物限度檢查法”指導，驗證管理規(guī)程、阿立哌唑質量標準、微生物限度檢查sop，對阿立哌唑的微生物限度檢查方法進行驗證。

3、5 驗證目的：通過阿立哌唑微生物限度方法的驗證，確保所采用的微生物限度檢查方法適合于阿立哌唑的微生物限度檢查，確保檢驗在結果的準確可靠。6 驗證內容：細菌、霉菌及酵母菌計數方法、控制菌檢查方法 供試液的制備-細菌（試驗組、菌液組、供試品對照組、稀釋劑對照組）-霉菌和酵母菌（試驗組、菌液組、供試品對照組、稀釋劑對照組）-控制菌檢查方法（菌液制備、供試液對照組、試驗組、陰性菌對照組、陰性對照組）6.1 菌種驗證試驗所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特征。 大腸埃希菌 （escherichia coli） cm

4、cc（b）44 102 金黃色葡萄球菌 （staphylococcus aureus） cmcc（b）26 003 枯草芽孢桿菌 （bacillus subtilis） cmcc（b）63 501白色念珠菌 （candida albicans） cmcc（f）98 001黑曲霉 （asprgillus niger） cmcc（f）98 0036.2 菌液制備 （見附表一）6.2.1 分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經3035培養(yǎng)1824小時。取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液1ml加入0.9%無菌氯化鈉溶液9ml, 分別制成10-1、10-2、10-3、10-4、

5、10-5、10-6、10-7、10-8菌懸液，再分別取各稀釋級的菌懸液1ml, 注入平皿中,傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基, 搖勻，凝固,經3035培養(yǎng)1824h,取出計數。每種菌種各稀釋級平行制備2個平皿。取計數范圍在50100cfu菌懸液為驗證時的使用菌液。6.2.2 接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，經2328培養(yǎng)2448小時，取改良馬丁培養(yǎng)物1ml加入0.9%無菌氯化鈉溶液9ml, 10倍遞增稀釋至每1ml含菌數為50100cfu的菌懸液為驗證時的使用菌液。6.2.3 接種黑曲霉菌液時,關掉凈化工作臺風機,操作時靠近酒精燈,輕拿輕放。將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，經2

6、328培養(yǎng)57天，加入35ml含0.05%（ml/ml） 聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花）至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml） 聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至每1ml含孢子數為50100cfu的孢子懸液為驗證時的使用菌液。6.2.4 操作完畢后的菌液和使用過的器具經121濕熱滅菌30分鐘，再作清潔處理，并對操作臺面進行消毒和清潔處理。6.3供試液的制備取阿立哌唑10g，加入在100mlph7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液中，45水浴保溫，使完全溶化，振搖后，作為1：10供試液。 7 驗證方法：進行3次獨立平行試

7、驗,分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。7.1細菌大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌（試驗組）取1:10供試液1ml，注入無菌平皿中，再注入1ml大腸埃希菌備用菌液，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置3035培養(yǎng)3天，計數。同法再制備1份平行樣。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試驗組照大腸埃希菌試驗組同法制備。（菌液組）取大腸埃希菌菌備用菌液1ml，注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置3035培養(yǎng)3天，計數。同法再制備1份平行樣。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液組照大腸埃希菌菌液組同法制備。（供試品對照組）取1:10供試液1ml，注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培

8、養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置3035培養(yǎng)3天，計數。同法再制備1份平行樣。（稀釋劑對照組）取ph7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液1ml，注入無菌平皿中，再注入1ml大腸埃希菌備用菌液，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置3035培養(yǎng)3天，計數。同法再制備1份平行樣。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌稀釋劑對照組照大腸埃希菌稀釋劑對照組同法制備。7.2 霉菌和酵母菌 白色念珠菌、黑曲霉（試驗組）取1:10供試液1ml，注入無菌平皿中，再注入1ml白色念珠菌備用菌液，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置2328培養(yǎng)5天，計數。同法再制備1份平行樣。 黑曲霉試驗組照白色念珠菌試驗組同法制備。（菌液

9、組）取白色念珠菌備用菌液1ml，注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置2328培養(yǎng)5天，計數。同法再制備1份平行樣。 黑曲霉菌液組照白色念珠菌菌液組同法制備。 （供試品對照組）取1:10供試液1ml，注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置2328培養(yǎng)5天，計數。同法再制備1份平行樣。（稀釋劑對照組）取ph7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液1ml，注入無菌平皿中，再注入1ml白色念珠菌備用菌液，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，待凝固后，置2328培養(yǎng)5天，計數。同法再制備1份平行樣。 黑曲霉稀釋劑對照組照白色念珠菌稀釋劑對照組同法制備。 7.3 結果判

10、斷：在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低于70。若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率）均不低于70，照該供試液制備方法和計數法測定；若任一次試驗中試驗組的菌數回收率低于70，應應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。8 控制菌檢查方法的驗證8.1 供試液對照組：取1:10供試液10ml加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，置3035培養(yǎng)1824小時，取培養(yǎng)后的膽鹽乳糖培養(yǎng)基0.2ml，接種至5mlm

11、ug培養(yǎng)基的試管內，培養(yǎng)，于5小時、24小時在366mm紫外線下觀察，同時用未接種的mug培養(yǎng)基作本底對照。管內培養(yǎng)物呈現熒光，為mug陽性；不呈現熒光，為mug陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入23滴靛基質試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質陽性；呈試劑本色，為靛基質陰性。本底對照應為mug陰性和靛基質陰性。若mug、靛基質同為陽性，則判檢出；若均為陰性，則判未檢出；若有一項陰性則取膽鹽乳糖的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時。若平板上無菌生長或與形態(tài)與標準不符，則判未檢出，若相符或疑似，應進行分離、純化、染色、鏡檢及適宜的鑒定試驗。8.2 試驗組：取1:10供試

12、液10ml和大腸埃希菌備用菌液1ml加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，參照供試液對照組進行試驗，并對結果進行觀察。8.3 陰性菌對照組：取金黃色葡萄球菌備用菌液1ml加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，參照供試液對照組進行試驗，并對結果進行觀察。8.4 陽性菌對照組：取大腸埃希菌備用菌液1ml加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，參照供試液對照組進行試驗，并對結果進行觀察。8.5 陰性對照組取ph7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液10ml加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，參照供試液對照組進行試驗，并對結果進行觀察。8.6 結果判斷陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進行供試品

13、的該控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。附表一 菌液制備記錄營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基批號： 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基批號： 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基批號： 氯 化 鈉 批 號： 改良馬丁培養(yǎng)基批號： 名稱大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉代數培養(yǎng)時間培養(yǎng)溫度稀釋級皿號1皿號2皿號1皿號2皿號1皿號2皿號1皿號2皿號1皿號210-110-210-310-410-510-610-710-8選用稀釋級檢驗人： 復核人： 日期： 附表二 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證記錄供 試 品 批 號： 玫瑰紅鈉瓊脂

14、培養(yǎng)基批號： 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基批號： 一、大腸埃希菌（選用稀釋級： ）培養(yǎng)時間： 年 月 日 至 年 月 日 ，設備型號： 溫度： 試驗組菌液組供試液對照組稀釋劑對照組稀釋劑對照組回收率=稀釋劑對照組/菌液組100%試驗組回收率=（試驗組-供試液對照組）/菌液組100%皿號1皿號2 平均菌落數檢驗人： 復核人： 日期： 二、金黃色葡萄球菌（選用稀釋級： ）培養(yǎng)時間： 年 月 日 至 年 月 日 ，設備型號： 溫度： 試驗組菌液組供試液對照組稀釋劑對照組稀釋劑對照組回收率=稀釋劑對照組/菌液組100%試驗組回收率=（試驗組-供試液對照組）/菌液組100%皿號1皿號2 平均菌落數檢驗人： 復核人：

15、日期： 三、枯草芽孢桿孢菌（選用稀釋級： ）培養(yǎng)時間： 年 月 日 至 年 月 日 ，設備型號： 溫度： 試驗組菌液組供試液對照組稀釋劑對照組稀釋劑對照組回收率=稀釋劑對照組/菌液組100%試驗組回收率=（試驗組-供試液對照組）/菌液組100%皿號1皿號2 平均菌落數結論： 檢驗人： 復核人： 日期： 四、白色念珠菌（選用稀釋級： ）培養(yǎng)時間： 年 月 日 至 年 月 日 ，設備型號： 溫度： 試驗組菌液組供試液對照組稀釋劑對照組稀釋劑對照組回收率=稀釋劑對照組/菌液組100%試驗組回收率=（試驗組-供試液對照組）/菌液組100%皿號1皿號2 平均菌落數檢驗人： 復核人： 日期： 五、黑曲霉（選用稀釋級： ）培養(yǎng)時間： 年 月 日 至 年 月 日 ，設備型號： 溫度： 試驗組菌液組供試液對照組稀釋劑對照組稀釋劑對照組回收率=稀釋劑對照組/菌液組100%試驗組回收率=（試驗組-供試液對照組）/菌液組100%皿號1皿號2 平均菌落數結論： 檢驗人： 復核人： 日期： 附表三：控制菌檢查方法驗證記錄供 試 品 批 號： 膽鹽乳糖培養(yǎng)基批號： mug培養(yǎng)基批號： 大腸埃希菌檢查（培養(yǎng)時間： 年 月 日 至