乙肝六項操作及檢驗結(jié)果的解釋幻燈片

1、 乙肝六項的操作、注意事項乙肝六項的操作、注意事項及檢驗結(jié)果的解釋及檢驗結(jié)果的解釋 1乙肝六項操作乙肝六項操作HBSAg (雙抗體夾心法）雙抗體夾心法）原理原理在微孔條上預(yù)包被，被純化的乙肝表面抗體，配以酶標(biāo)記抗體（HBsAb-HRP）及TMB等其它試劑，采用夾心法原理檢測人血清（或血漿）中乙肝表面抗原（HBsAg）。 2乙肝六項操作乙肝六項操作HBSAg (雙抗體夾心法）雙抗體夾心法） 操作步驟 一.準(zhǔn)備 1.1平衡：將試劑盒各組分別取出，平衡至室溫（18-25）， 1.2配液：濃縮洗滌液配制前充分搖勻（如有晶體應(yīng)充分溶解）， 濃縮洗滌液和蒸餾水或去離子水按25倍稀釋后使用。 1.3編號：將

2、微孔條固定于支架，按序編號。 3乙肝六項操作乙肝六項操作HBSAg (雙抗體夾心法雙抗體夾心法) 二.HBSAg操作2.1加樣：分別用加樣器在對照孔中加入陰、陽性對照血清各75l于相應(yīng)孔中。2.2溫育：置37溫育60分鐘。2.3 加酶：不用洗滌，分別在每孔中加入酶標(biāo)記抗體50l，輕輕混勻。2.4 溫育：置37溫育30分鐘，室溫平衡5分鐘。2.5 洗滌：用洗滌液充分洗滌5次，洗滌完扣干（每次應(yīng)保持30-60秒的浸泡時間）。2.6顯色：每孔加入底物A、B各50l，輕拍混勻，置37暗處30分鐘。2.7終止：每孔加終止液50l，混勻。 三.HBSAg測定用酶標(biāo)儀單波長450nm或雙波長450/630n

3、m測定各孔OD值（用單波長測定時需設(shè)空白對照一孔，30分鐘內(nèi)完成測定，并記錄結(jié)果）。 4乙肝六項操作乙肝六項操作HBSAg (雙抗體夾心法)結(jié)果判斷與分析結(jié)果判斷與分析 臨界值（C.O.）的計算：Cutoff臨界值=陰性對照孔OD值N2.1，陰性對照OD均值大于0.05時按實際OD值計算，小于0.05時以0.05計算。 結(jié)果判定：樣品OD值S/C.O=1者為HBsAg陽性樣品OD值S/C.O1者為HBsAg陰性 5乙肝六項操作乙肝六項操作HBeAb檢測（檢測（ELISA)競爭法競爭法 一一.試劑準(zhǔn)備同上試劑準(zhǔn)備同上 二.HBeAb操作 加樣：分別用加樣器在對照孔中加入陰、陽性對照血清各50l于

4、相應(yīng)孔中。 加酶：分別在每孔中加入酶標(biāo)記抗體50l，輕輕混勻。 溫育：置37溫育30分鐘，室溫平衡5分鐘。 洗滌：用洗滌液充分洗滌5次，洗滌完扣干（每次應(yīng)保持30-60秒的浸泡時間）。 顯色：每孔加入底物A、B各50l，輕拍混勻，置37暗處15分鐘。 終止：每孔加終止液50l，混勻。 三.HBeAb測定用酶標(biāo)儀單波長450nm或雙波長450/630nm測定各孔OD值（用單波長測定時需設(shè)空白對照一孔，30分鐘內(nèi)完成測定，并記錄結(jié)果）。 6乙肝六項操作乙肝六項操作HBeAb檢測（檢測（ELISA)競爭法競爭法 四四 .結(jié)果判斷與分析結(jié)果判斷與分析 臨界值（C.O.）的計算： 臨界值（陰性對照孔OD

5、值N+陽性對照孔OD值P）0.5， 結(jié)果判定：樣品OD值S/C.O1者為HBeAb陰性 注意：注意：加底物顯色，顯色的強(qiáng)弱與待測標(biāo)本中HBeAb的含量成反比。 7乙肝六項操作乙肝六項操作HBCAb測定（競爭法）測定（競爭法） 原理原理 在微孔條上預(yù)包被，被純化乙肝核心抗原（HBcAg），配以酶標(biāo)記抗體（HbcAb-HRP）及TMB等其它試劑，采用競爭抑制法原理檢測人血清（或血漿）中乙肝核心抗體（HBcAb）。 8乙肝六項操作乙肝六項操作HBCAb測定（競爭法）測定（競爭法）試劑準(zhǔn)備同上試劑準(zhǔn)備同上加樣加樣：每測定孔加入50l樣品。對照孔中加入陰、陽性對照血清各50l。作為臨床診斷依據(jù)，必須將原

6、倍血清樣品按1：30稀釋后再檢驗，稀釋液應(yīng)采用生理鹽水；（作為流行病學(xué)調(diào)查依據(jù)，使用原倍血清檢驗）。加酶加酶：每孔加入酶標(biāo)記抗體50l，輕拍混勻。育溫：育溫：置37溫育30分鐘，室溫平衡5分鐘。洗滌洗滌：用洗滌液充分洗滌5次，洗滌完扣干（每次應(yīng)保持30-60秒的浸泡時間）。顯色：顯色：每孔加入底物A、B各50l，輕拍混勻，置37暗處30分鐘。終止：終止：每孔加終止液50l，混勻。測定：測定：用酶標(biāo)儀單波長450nm或雙波長450/630nm測定各孔OD值（用單波長測定時需設(shè)空白對照一孔，30分鐘內(nèi)完成測定，并記錄結(jié)果）。結(jié)果判斷與分析結(jié)果判斷與分析臨界值（臨界值（C.O.）的計算：）的計算：臨

7、界值陰性對照孔OD值N0.5（未稀釋臨界值陰性對照孔OD值N0.3）結(jié)果判定：樣品OD值S/C.O1者為HBcAb陰性 注意：注意：加底物顯色，顯色的強(qiáng)弱與待測標(biāo)本中HBCAb的含量成反比。 9乙肝六項操作乙肝六項操作HBCAb-lgM(捕獲法）捕獲法） 測定原理測定原理 采用兔抗人HbcAg- IgM包被固相載體反應(yīng)板，加入待測標(biāo)本，同時加入HbcAg-HRP，當(dāng)標(biāo)本中存在HbcAb時，該HbcAb-IgM與包被HbcAg結(jié)合并與酶結(jié)合形成HBcAg-HbcAb-HBcAg-HRP復(fù)合物，加入TMB底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之則無顯色反應(yīng)。 10乙肝六項操作乙肝六項操作HBCAb-lgM(捕獲法）

8、捕獲法） 操作步驟操作步驟 1.待測樣品用生理鹽水作1:1000稀釋，每孔加人稀釋樣品100微升，設(shè)陰、陽性對照各2孔，每孔加人陰性對照(或陽性對照) 各100微升(或2滴)，并設(shè)空白對照1孔，封板，置37 孵育20分鐘。2.手工洗板:棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)3次后拍干。洗板機(jī)洗板：選擇洗滌3次程序洗板后拍干。3.每孔加入HBcAg30微升(或1滴)，酶結(jié)合物50微升(或1滴)(空白對照孔除外)，充分混勻，封板，置37孵育20分鐘4.手工洗板:棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)5次后拍干。洗板機(jī)洗板:選擇洗滌5次程序洗板后拍干。5.每孔加顯色劑A液

9、，顯色劑B液各50微升(或l滴) 充分混勻，封板，置37 孵育10分鐘。6.每孔加人終止液50微升(或1滴)，混勻。7.用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長450nm(建議使用雙波長的酶標(biāo)儀比色，參考波長630nm )，先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。記錄結(jié)果）。 11乙肝六項操作乙肝六項操作HBCAg-lgM(捕獲法）捕獲法） 8. 結(jié)果判斷與分析結(jié)果判斷與分析 8.1 臨界值（C.O.）的計算：臨界值陰性對照孔OD值N4，陰性對照OD均值小于0.05時以0.05計算，大于0.05時應(yīng)實際OD值計算。 8.2 結(jié)果判定：樣品OD值S/C.O=1者為陽性 樣品OD值S/C.O1者為陰性 9. 質(zhì)量控制質(zhì)量

10、控制：每次均應(yīng)有陰陽對照，其OD值應(yīng)在要求范圍內(nèi)。 12乙肝六項操作乙肝六項操作HBCAb-lgM(捕獲法）捕獲法） 10.參考值范圍：參考值范圍： 參考值cut-off value(COV)=陰性對照平均OD值x 4 陰性對照OD值低于0.050作0.050計算，高于0.050按實際OD值計算。 示例1： 陰性對照孔1 COV: 0.016. 陰性對照孔2 COV: 0.010. 0.05040.200 示例2： 陰性對照孔 COV: 0.056 陰性對照孔 COV: 0.060 （0.056+0.060）/240.232 13ELISA法檢測乙肝六項的法檢測乙肝六項的注意事項注意事項 及結(jié)

11、果分析及結(jié)果分析 酶聯(lián)免疫吸附試驗(簡稱 ELISA 法)檢測乙型肝炎免疫學(xué)標(biāo)志物問世以來， 由于測定靈敏高 、特異好和操作簡便等諸多優(yōu)點， 具有實用性和可操作性 ，并廣泛應(yīng)用于各類醫(yī)院實驗室 ，作為檢測乙肝血清標(biāo)志物的首選 ，但通過對臨床乙肝六項檢測的觀察、 存在不同血清物質(zhì)變化及各種影響因素 ，直接或間接的影響檢驗結(jié)果的正確表達(dá) 。綜合資料和實踐 ，作如下探討： 141 樣本的采集與處理影響樣本的采集與處理影響1.1 樣本離心處理不全， 使得標(biāo)本嚴(yán)重溶血及混有紅細(xì)胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈 ，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白，具有過氧化物酶樣的活性， 催化底物顯色造成假陽性， 溶血標(biāo)本禁

12、用。 151.2 正常血液采集后半個小時至兩小時開始凝固， 有時工作中為了快速檢測 ，常會在血液未開始凝固時 ，即強(qiáng)行離心分離血清 。特別是在冬天 使得血清中殘留部分纖維蛋白原，在 ELISA 測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白凝塊附著在酶標(biāo)反應(yīng)孔壁內(nèi)使得不易洗掉 易造成假陽(陰)性、 影響結(jié)果 。因此血液標(biāo)本采集后要使其充分凝固后再分離血清，標(biāo)本離心時 ，可加大離心轉(zhuǎn)速 ，延長離心時間 或者要節(jié)約時間就用帶分離膠的采血管采集標(biāo)本。 161.3 血清標(biāo)本應(yīng)避免細(xì)菌污染， 細(xì)菌的一些內(nèi)源性酶本身會對相應(yīng)酶作標(biāo)記測定方法產(chǎn)生干擾。1.4 標(biāo)本儲存時間不宜過長， 應(yīng)新鮮 4 保存不宜超過7天 ，以

13、免因標(biāo)本中的 IgG 聚合導(dǎo)致本底加深 甚至假陽性，影響判斷結(jié)果。 172 試劑的影響試劑的影響2.1 試劑盒在運輸中時間太長 ，溫度過高會使顯色偏淡，靈敏度偏低 ，要求試劑盒應(yīng)存放于 2 -8 冰箱中，從冷藏環(huán)境中取出的試劑盒、全部瓶裝試劑以及待測標(biāo)本所需的微孔反應(yīng)板，都應(yīng)預(yù)先在室溫下平衡后，再開啟使用 。余者應(yīng)及時封存于冰箱。不同批號試劑盒中的組份、不能進(jìn)行交叉使用 ，包括試劑瓶蓋，相互交叉使用 ，有可能出現(xiàn)顯色淺或本底高 ，花板情況。 所以不同試劑瓶蓋不能混淆，試劑盒不要使用超過有效期。 182.2 不同廠家出產(chǎn)的試劑特異性和敏感性不相同。 有的廠家酶標(biāo)板空間 A 值差 15% ，標(biāo)記酶

14、活性及顯色液的穩(wěn)定性較差，使用劣質(zhì)試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽性或假陰性 。選擇高質(zhì)量的試劑是保證檢驗結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一 193 操作技術(shù)的影響操作技術(shù)的影響3.1 加樣吸嘴的潔凈和吸液量的準(zhǔn)確性直接影響結(jié)果 ，移液器吸量不足 ，移液抽吸排放太快， 吸頭內(nèi)壁掛液太多或內(nèi)壁不清潔， 所以要定期校正移液器， 吸頭要配套， 每次裝吸頭要吻合緊密， 移液不宜過快， 排放應(yīng)完全 ，盡可能使用同一移液器和裝緊吸頭移液時用力及抽吸速度均勻一致 加樣后要充分混勻 ，在 100 ul和 50 ul的移液不精密度應(yīng) 在1%范圍以內(nèi)， 分別在99 -101 ul和 49.5- 50.5 ul之間。 203.2 溫浴影響

15、96 孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別 ，易產(chǎn)生邊緣效應(yīng) ，抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對溫度要求嚴(yán)格， 標(biāo)本要貼好密封膜 ，防止水蒸氣和污物浸入， 放置 37 水浴箱時 ，應(yīng)讓反應(yīng)孔底部 2/3 浸入水中， 才能減少受熱不均 避免邊緣效應(yīng) ，干浴與水浴存在明顯的差異 ，盡可能使用水浴 ，并控制好水浴時間。 213.3 洗滌是 ELISA 法操作的重要環(huán)節(jié)， 洗滌液的配制要嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作 ，不能用自來水代替蒸餾水配制 因為自來水中的次氯酸鈉會影響結(jié)果 ，手洗易交叉污染 盡量使用洗板機(jī)洗滌， 血清中殘留的纖維蛋白或洗滌瓶，未經(jīng)常清洗而留有的污垢 ，結(jié)晶易使洗板機(jī)針孔全堵塞或半堵塞 ，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底

16、， 導(dǎo)致花板而造成假陽性或假陰性 ，所以操作洗板機(jī)過程中要不時觀察洗板機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢情況 ，及時糾正調(diào)整， 洗板機(jī)要做好維護(hù)保養(yǎng)， 不用時應(yīng)用去離子水清洗幾遍。 223.4 顯色劑應(yīng)避光保存 滴加顯色劑 A 、B 時 ，順序不能顛倒 ，注意不要漏加， 顯色時間要嚴(yán)格控制， 可用計時器來計時，保證準(zhǔn)確， 肉眼判斷結(jié)果時， 顯色淺不易觀察， 影響結(jié)果準(zhǔn)確性， 必須使用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果， 以保證結(jié)果一致性 ，滴加終止液后隨著時間的增加， 吸光度值逐漸下降， 而且濃度越高其吸光度隨時間下降越快， 可能會產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果，建議在終止反應(yīng)后立即比色。 234 鉤狀效應(yīng)鉤狀效應(yīng)(Hook)影響影響隨

17、著 ELISA 一步法的應(yīng)用 ，在日常工作中會發(fā)現(xiàn) HBsAg陰性而 HBeAg 陽性的現(xiàn)象 ，其原因就是當(dāng)標(biāo)本中的抗原濃度過高時產(chǎn)生的鉤狀效應(yīng) (Hook)現(xiàn)象 ，從而出現(xiàn)假陰性造成真陽性的漏檢， 即隨著被測物濃度增高反而顯色減弱甚至不顯色， 往往造成假陰性結(jié)果 ，采用同步稀釋測定或用線性范圍高的乙肝六項定量法可以減少 Hook 效應(yīng)的發(fā)生。 24有學(xué)者認(rèn)為大約 40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì) ，可以不同程度影響檢測結(jié)果 ，常見的干擾物質(zhì)有： 類風(fēng)濕因子、 補(bǔ)體、異嗜性抗體 、治療性抗體 、溶菌酶、總蛋白濃度等， 某些自身抗體都會影響結(jié)果造成假陽性。5.干擾物質(zhì)的影響 256 藥物

18、的影響藥物的影響 高效價的乙肝免疫球蛋白會與表面抗原形成復(fù)合物,影響 HBsAg 的檢出,所以一些 HBsAg 陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后,HBsAg 檢測會呈陰性反應(yīng),導(dǎo)致乙肝兩對半少見模式的出現(xiàn)。為預(yù)防乙肝，部分 HBsAg 陰性人群在接種乙肝疫苗后的 1 2 周內(nèi)，血清中可檢出 HBsAg 成分，形成一過性HBsAg 陽性，這可能是乙肝疫苗主要成分是 HBsAg，建議接種乙肝疫苗后 1 個月內(nèi)不應(yīng)作 HBsAg 檢測。 總之,沒有嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)控,沒有規(guī)范的操作規(guī)程,結(jié)果判定用肉眼而不用儀器,操作隨意(如試劑自冰箱取出后不復(fù)溫,溫育時不封板,洗板后無扣板過程),試劑、儀器、器材(如微量移

19、液器)質(zhì)量差等。而對一些操作細(xì)節(jié)(如溫育時間的控制)的忽視都可能導(dǎo)致結(jié)果的不同。乙肝六項檢測必須排除各種影響因素的干擾，才能為臨床提供正確可靠的檢測依據(jù)。 26乙肝表面抗原前S1HBSAg前S1：1.主要存在于完整乙肝病毒表面 ,2.肝細(xì)胞膜上存在有前S1蛋白受體 ,3.誘導(dǎo)乙肝病毒吸附在肝細(xì)胞表面 , 4.促使病毒進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi). 27乙肝核心抗體臨床意義 乙型肝炎核心抗體乙型肝炎核心抗體是人體感染乙型肝炎病毒后第一個出現(xiàn)的抗體,是人體感染乙型肝炎病毒血清學(xué)標(biāo)志物之一.乙型肝炎核心抗體又可分為乙型肝炎核心抗體IgM（抗HBc.IgM）和乙型肝炎核心抗體IgG(抗HBc.IgG)兩種,前者隨AL

20、T升高而不斷增長.大約在乙型肝炎病毒感染后1-2個月時,隨者ALT升高而不斷增長.大約在乙型肝炎病毒感染后1-2個月時,隨之產(chǎn)生的便是乙型肝炎核心抗體IgG. 目前認(rèn)為,抗HBc.IgM是乙型肝炎病毒新近感染或持續(xù)復(fù)制的標(biāo)志,這種抗體持續(xù)陽性提示疾病遷延,而抗HBc.IgG的持續(xù)存在只能說明以往有過乙型肝炎病毒感染.因此,乙型肝炎核心抗體IgM和IgG平行檢測,有助于對急性乙型肝炎與隱匿型乙型肝炎和乙型肝炎病毒攜帶者急性發(fā)作之間的鑒別.約有20%急性乙型肝炎病人的血清中查不到乙型肝炎表面抗原,而乙型肝炎核心抗體IgM可陽性,而且與病情變化相一致,病情恢復(fù),乙型肝炎核心抗體IgM陰轉(zhuǎn).當(dāng)病情重新

21、活動時,ALT重新出現(xiàn)異常時,乙型肝炎核心抗體IgM亦重新出現(xiàn)陽性,滴度上升.所以說, 乙型肝炎核心抗體IgM是用來評價乙型肝炎病情的較好指標(biāo) 28常見乙肝六項檢驗結(jié)果的解釋 29HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAbHBcAb- lgM簡要意義簡要意義乙型肝炎表乙型肝炎表面抗面抗原原乙型肝炎表乙型肝炎表面抗面抗體體乙型肝炎乙型肝炎e抗抗原原乙型肝炎乙型肝炎e抗抗體體乙型肝炎核乙型肝炎核心抗心抗體體乙型肝炎核心乙型肝炎核心抗體抗體lgMHBsAg是乙肝病毒標(biāo)志物，陽性提示乙肝攜帶；是乙肝病毒標(biāo)志物，陽性提示乙肝攜帶；HBeAg、HBcAb- lgM 陽性提示乙肝病毒復(fù)制活躍陽性提示

22、乙肝病毒復(fù)制活躍,傳染性強(qiáng)傳染性強(qiáng),是治是治療療效評價的重要指標(biāo)；療療效評價的重要指標(biāo)；HBsAb、HBeAb陽性提示機(jī)體陽性提示機(jī)體產(chǎn)生免疫力抵抗病毒，趨于恢復(fù)。產(chǎn)生免疫力抵抗病毒，趨于恢復(fù)。-沒有乙肝病毒感染，不具備免疫力沒有乙肝病毒感染，不具備免疫力-+-接種疫苗，乙肝恢復(fù)，具備免疫力接種疫苗，乙肝恢復(fù)，具備免疫力+-表面抗原攜帶；急性乙肝病毒感染潛伏期后期表面抗原攜帶；急性乙肝病毒感染潛伏期后期+-+-+急性乙肝早期，病毒復(fù)制，有傳染性強(qiáng)急性乙肝早期，病毒復(fù)制，有傳染性強(qiáng)+-+-+急慢性乙肝，病毒復(fù)制，有傳染性強(qiáng)急慢性乙肝，病毒復(fù)制，有傳染性強(qiáng)+-+-急慢性乙肝，沒有傳染性或傳染性弱急慢性乙肝，沒有傳染性或傳染性弱+-+-急慢性乙肝，沒有傳染性或傳染性弱急慢性乙肝，沒有傳染性或傳染性弱+-+急慢性乙肝，病毒復(fù)制有傳染性，乙型肝炎急慢性乙肝，病毒復(fù)制有傳染性，乙型肝炎E抗原變異抗原變異-+-乙肝核心抗隱性攜帶，有乙肝既往有感染史乙肝核心抗隱性攜帶，有乙肝既往有感染史-+-急性乙肝恢復(fù)期或既往有感染史急性乙肝恢復(fù)期或既往有感染史-+-+-乙肝恢復(fù)期或既往有輕度乙肝病毒感染史乙肝恢復(fù)期或既往有輕度乙肝病毒感染史+-+-慢乙肝病毒感染攜帶，沒有傳染性或傳染性弱慢