實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測課件

1、實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌質(zhì)粒DNADNA的提取及檢測的提取及檢測基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒掌握堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNADNA的原理和方法。的原理和方法。 掌握離心機(jī)、移液器、震蕩培養(yǎng)箱的正確使用方法。掌握離心機(jī)、移液器、震蕩培養(yǎng)箱的正確使用方法。 了解不同構(gòu)型的質(zhì)粒了解不同構(gòu)型的質(zhì)粒DNADNA在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)速率的在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)速率的差異。差異。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體外的能夠自主復(fù)制的環(huán)狀質(zhì)粒是存在

2、于細(xì)菌染色體外的能夠自主復(fù)制的環(huán)狀DNA分子。大小在分子。大小在1200kb之間，質(zhì)粒之間，質(zhì)粒DNA通常通常以游離狀態(tài)持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外（在一定的條以游離狀態(tài)持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外（在一定的條件下又會(huì)可逆地整合到寄主染色體上），隨著染色件下又會(huì)可逆地整合到寄主染色體上），隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。由體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。由于質(zhì)粒于質(zhì)粒DNA自身具有復(fù)制原點(diǎn)、可攜帶外源基因、自身具有復(fù)制原點(diǎn)、可攜帶外源基因、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、拷貝數(shù)高、帶有選擇性標(biāo)記等特點(diǎn)，使轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、拷貝數(shù)高、帶有選擇性標(biāo)記等特點(diǎn)，使得質(zhì)粒成為基因工程中最常用的得質(zhì)粒成為基因工程中最常

3、用的DNA載體。載體。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 l質(zhì)粒質(zhì)粒DNA分子具有分子具有3種不同的構(gòu)型：種不同的構(gòu)型：SC構(gòu)型構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)形：共價(jià)閉合環(huán)形DNA（cccDNA），質(zhì)粒的），質(zhì)粒的兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)；兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)；OC構(gòu)型構(gòu)型：開環(huán)：開環(huán)DNA（ocDNA），質(zhì)粒的兩條多核苷），質(zhì)粒的兩條多核苷酸鏈中一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈存在一酸鏈中一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈存在一處至多處斷裂；處至多處斷裂；L構(gòu)型構(gòu)型：線性：線性DNA（linear DNA），質(zhì)粒），質(zhì)粒DNA發(fā)生雙發(fā)生雙鏈斷裂而形成線性分

4、子。鏈斷裂而形成線性分子。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 l同一質(zhì)粒同一質(zhì)粒DNA的不同構(gòu)型盡管相對分子質(zhì)量相同，的不同構(gòu)型盡管相對分子質(zhì)量相同，但在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳遷移率卻是不同的。一但在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳遷移率卻是不同的。一般情況下，泳動(dòng)速率由快至慢依次為：超螺旋質(zhì)粒般情況下，泳動(dòng)速率由快至慢依次為：超螺旋質(zhì)粒（SC）、線性質(zhì)粒（）、線性質(zhì)粒（L）、開環(huán)質(zhì)粒（）、開環(huán)質(zhì)粒（OC）。）。l質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取方法較多，要根據(jù)宿主菌和質(zhì)粒的的提取方法較多，要根據(jù)宿主菌和質(zhì)粒的特性選擇適合的提取方法。目前常用的質(zhì)粒提取方法特性選擇適合的提取方法。目前常用的質(zhì)粒提

5、取方法有：有：堿裂解法堿裂解法、煮沸法煮沸法。l幾種方法的提取流程是一樣的：培養(yǎng)細(xì)菌擴(kuò)增質(zhì)粒幾種方法的提取流程是一樣的：培養(yǎng)細(xì)菌擴(kuò)增質(zhì)粒收集菌體裂解細(xì)胞收集菌體裂解細(xì)胞分離和純化質(zhì)粒分離和純化質(zhì)粒DNA。 實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測堿裂解法實(shí)驗(yàn)原理堿裂解法實(shí)驗(yàn)原理 利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線狀的染色體與線狀的染色體DNA片段在拓?fù)鋵W(xué)上片段在拓?fù)鋵W(xué)上的差異進(jìn)行分離。的差異進(jìn)行分離。SDS使細(xì)胞崩解，釋放內(nèi)含物，蛋白質(zhì)變性形使細(xì)胞崩解，釋放內(nèi)含物，蛋白質(zhì)變性形成蛋白質(zhì)成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。同時(shí)，在復(fù)合物。同時(shí)，在pH12.012.5的堿性條件下，線的堿性條件下

6、，線狀的染色體狀的染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA雖然氫鍵斷裂，但兩雖然氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈仍然相互盤繞而緊密結(jié)合在一起。加入條互補(bǔ)鏈仍然相互盤繞而緊密結(jié)合在一起。加入pH4.8的醋酸鉀高的醋酸鉀高鹽緩沖液使鹽緩沖液使pH降低后，質(zhì)粒降低后，質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈由于彼此靠近而迅的兩條互補(bǔ)鏈由于彼此靠近而迅速準(zhǔn)確地復(fù)性，而線狀的染色體速準(zhǔn)確地復(fù)性，而線狀的染色體DNA由于核苷酸鏈較長且兩條互由于核苷酸鏈較長且兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，不能迅速復(fù)性，它們相互聚集形成網(wǎng)狀結(jié)補(bǔ)鏈彼此已完全分開，不能迅速復(fù)性，它們相互聚集形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并與變性的蛋白質(zhì)及細(xì)胞碎片等纏繞在一起

7、。通過離心，染構(gòu)，并與變性的蛋白質(zhì)及細(xì)胞碎片等纏繞在一起。通過離心，染色體色體DNA網(wǎng)狀聚合物便與蛋白質(zhì)網(wǎng)狀聚合物便與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物及不穩(wěn)定的大分子一復(fù)合物及不穩(wěn)定的大分子一起沉淀下來，而留在上清液中的質(zhì)粒起沉淀下來，而留在上清液中的質(zhì)粒DNA可用苯酚、氯仿進(jìn)一步可用苯酚、氯仿進(jìn)一步抽提純化，通過異丙醇沉淀后可收集質(zhì)粒抽提純化，通過異丙醇沉淀后可收集質(zhì)粒DNA。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 電泳電泳：帶電荷的物質(zhì)在電場中向與自身電荷相反：帶電荷的物質(zhì)在電場中向與自身電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。的電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。在在pH8.0的電泳緩沖液體系中，的電

8、泳緩沖液體系中，DNA分子帶負(fù)電分子帶負(fù)電荷，當(dāng)它處于一個(gè)穩(wěn)定的電場中時(shí)，從負(fù)極向正荷，當(dāng)它處于一個(gè)穩(wěn)定的電場中時(shí)，從負(fù)極向正極泳動(dòng)，遷移速度與極泳動(dòng)，遷移速度與其相對分子質(zhì)量的對數(shù)成反其相對分子質(zhì)量的對數(shù)成反比（僅適于線性分子）。比（僅適于線性分子）。通過與已知濃度和相對分子質(zhì)量大小的標(biāo)準(zhǔn)通過與已知濃度和相對分子質(zhì)量大小的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進(jìn)行對照電泳，觀察其帶型和遷移距離，即片段進(jìn)行對照電泳，觀察其帶型和遷移距離，即可獲得未知樣品的濃度、純度和相對分子質(zhì)量?？色@得未知樣品的濃度、純度和相對分子質(zhì)量。 瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器及

9、試劑實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器及試劑 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 prok2系列質(zhì)粒系列質(zhì)粒 主要儀器和用具主要儀器和用具 超凈工作臺(tái)、振蕩培養(yǎng)箱超凈工作臺(tái)、振蕩培養(yǎng)箱 、微量移液器、微量移液器、 離心機(jī)、渦旋離心機(jī)、渦旋振蕩器、制冰機(jī)、振蕩器、制冰機(jī)、 離心管架、離心管架、1.5mL離心管、離心管、吸頭、吸頭、PE手手套、套、儲(chǔ)冰盒、儲(chǔ)冰盒、電泳槽、電源、電泳槽、電源、微波爐、凝膠成像系統(tǒng)。微波爐、凝膠成像系統(tǒng)。 實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測 試劑試劑（1 1）溶液溶液：50 mmol/L 50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖 25 mmol/L TrisHCl 25 mmol/L TrisHCl（pH

10、8.0pH8.0） 10 mmol/L EDTA 10 mmol/L EDTA（pH8.0pH8.0） 滅菌后滅菌后44保存保存（2 2）溶液溶液：0.2mol/L NaOH0.2mol/L NaOH 1% SDS 1% SDS（pHpH值值12.612.6）（3 3）溶液溶液：5mol/L KAc 60ml5mol/L KAc 60ml 冰乙酸冰乙酸 11.5ml11.5ml 水水28.5ml28.5ml（pH4.8pH4.8）（4 4）LBLB培養(yǎng)基培養(yǎng)基（5 5）瓊脂糖瓊脂糖（7 7）1 1TAETAE電泳緩沖液電泳緩沖液（pH 8.0pH 8.0）：）：10 mmol/LTrisCl1

11、0 mmol/LTrisCl 1 1 mmol/L EDTAmmol/L EDTA （8 8）上樣緩沖液（溴酚藍(lán)上樣緩沖液（溴酚藍(lán)（9 9） 溴化乙錠（溴化乙錠（1mg/ml1mg/ml）實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟1. 1. 菌體的培養(yǎng)與收集菌體的培養(yǎng)與收集（1 1）從）從LBLB平板上挑細(xì)菌單菌落，接種于平板上挑細(xì)菌單菌落，接種于5ml5ml附加相應(yīng)抗生附加相應(yīng)抗生素的素的LBLB液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基中，37250r/min37250r/min，過夜培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)（用對（用對數(shù)期的菌液提取質(zhì)粒得率高，即測定培養(yǎng)液的數(shù)期的菌液提取質(zhì)粒得率高，即測定培養(yǎng)液的ODO

12、D620620=0.2=0.20.60.6時(shí)為對數(shù)期的菌液。也可取時(shí)為對數(shù)期的菌液。也可取1/1001/100的過夜的過夜菌液，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)菌液，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)2.5h2.5h，此時(shí)菌液達(dá)對數(shù)期）。，此時(shí)菌液達(dá)對數(shù)期）。（2 2）取）取1.2ml1.2ml菌液放在菌液放在1.5ml1.5ml的離心管中，的離心管中，5000r/min 45000r/min 4離心離心10min10min，棄上清，棄上清（上清液中含有細(xì)菌生長過程中的代（上清液中含有細(xì)菌生長過程中的代謝廢物和脫落的細(xì)胞壁成分，會(huì)影響到質(zhì)粒的質(zhì)量與內(nèi)謝廢物和脫落的細(xì)胞壁成分，會(huì)影響到質(zhì)粒的質(zhì)量與內(nèi)切酶酶切的效果。所以離心收集細(xì)菌時(shí)，上

13、清液應(yīng)去除切酶酶切的效果。所以離心收集細(xì)菌時(shí)，上清液應(yīng)去除干凈，最好用干凈，最好用STESTE或生理鹽水再懸浮漂洗菌體或生理鹽水再懸浮漂洗菌體）。收集菌）。收集菌體后選擇以下方法提取質(zhì)粒。體后選擇以下方法提取質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟2.2.質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提?。▔A裂解法）的提?。▔A裂解法）將收集的細(xì)菌沉淀懸浮于將收集的細(xì)菌沉淀懸浮于100l100l冰預(yù)冷的冰預(yù)冷的溶液溶液中，強(qiáng)中，強(qiáng)烈振蕩混勻；烈振蕩混勻；加入加入200ul200ul新配的新配的溶液溶液于細(xì)菌懸液中，迅速顛倒離心管于細(xì)菌懸液中，迅速顛倒離心管5 5次（不應(yīng)振蕩），以混合內(nèi)容物，室溫放置

14、次（不應(yīng)振蕩），以混合內(nèi)容物，室溫放置5min5min或冰上或冰上放置放置3min.3min.加入加入150l150l預(yù)冷的預(yù)冷的溶液溶液，蓋緊管口，顛倒離心管，蓋緊管口，顛倒離心管5 51010次，使溶液次，使溶液在黏稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，隨后將在黏稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，隨后將管置于冰上管置于冰上5 510min10min。 實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 12 000 rpm12 000 rpm離心離心10 min10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一新離心管，將上清液轉(zhuǎn)移至另一新離心管中。中。 加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，

15、室溫靜置10 min10 min。 12 000 rpm12 000 rpm離心離心10 min10 min，棄上清。，棄上清。 加入加入500 l500 l 70 70乙醇，蓋緊管蓋，顛倒并旋轉(zhuǎn)離心管乙醇，蓋緊管蓋，顛倒并旋轉(zhuǎn)離心管以洗滌沉淀。以洗滌沉淀。 12 000 rpm12 000 rpm離心離心2 min2 min，用移液器吸走上清，打開管蓋，用移液器吸走上清，打開管蓋于室溫下放置于室溫下放置10-15 min10-15 min，使酒精揮發(fā)干凈。，使酒精揮發(fā)干凈。 待沉淀干燥后，加入待沉淀干燥后，加入50 l50 l TE TE緩沖液溶解質(zhì)粒緩沖液溶解質(zhì)粒DNADNA。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌

16、質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測3.3.瓊脂糖凝膠電泳檢測（瓊脂糖凝膠電泳檢測（合并下次一起電泳合并下次一起電泳） （1）凝膠制備凝膠制備 取瓊脂糖取瓊脂糖0.8g0.8g，加入，加入100ml100ml的的1 1TAETAE電泳緩沖液，配成濃電泳緩沖液，配成濃度為度為0.8%0.8%的瓊脂糖凝膠。的瓊脂糖凝膠。微波爐加熱煮沸，使瓊脂糖完全溶微波爐加熱煮沸，使瓊脂糖完全溶解（注意不要濺出）。解（注意不要濺出）。待凝膠溶液冷卻至待凝膠溶液冷卻至 6060左右時(shí)，加左右時(shí)，加入溴化乙錠至終濃度為入溴化乙錠至終濃度為0.5g0.5gmlml，倒進(jìn)制膠模具中。，倒進(jìn)制膠模具中。 室溫下待凝膠溶液完全凝固，小

17、心取出梳子，將帶有凝膠室溫下待凝膠溶液完全凝固，小心取出梳子，將帶有凝膠的模具的模具放置于電泳槽中。放置于電泳槽中。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測 （2 2）上樣上樣 在在DNADNA樣品中加入樣品中加入1 16 6體積的上樣緩沖液，充分混勻。用體積的上樣緩沖液，充分混勻。用移液器將移液器將DNADNA樣品加入樣品孔中。樣品加入樣品孔中。 （3 3）電泳電泳 接通電泳槽與電泳儀的電源，一般正極為紅色，負(fù)極為黑接通電泳槽與電泳儀的電源，一般正極為紅色，負(fù)極為黑色，色，DNADNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)。電壓降選擇為樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)。電壓降選擇為l l5V5Vcmcm（長

18、度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算），電泳的時(shí)間根據(jù)不（長度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算），電泳的時(shí)間根據(jù)不同的膠濃度與膠長度而異。同的膠濃度與膠長度而異。 （4 4）觀察結(jié)果觀察結(jié)果 電泳結(jié)束后取出膠膜，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照電泳結(jié)束后取出膠膜，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照, ,觀察。對觀察。對比標(biāo)準(zhǔn)比標(biāo)準(zhǔn)DNADNA條帶和未知條帶和未知DNADNA條帶，觀察其帶型和遷移距離，條帶，觀察其帶型和遷移距離，即可獲得未知樣品的濃度、純度和相對分子質(zhì)量大小。即可獲得未知樣品的濃度、純度和相對分子質(zhì)量大小。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測稱瓊脂糖稱瓊脂糖加加TAE加熱溶解加熱溶解加加EB灌膠灌膠凝固凝固放入電泳槽放入電泳槽加溴酚藍(lán)加溴酚藍(lán)點(diǎn)樣點(diǎn)樣電泳電泳觀察拍照觀察拍照質(zhì)粒質(zhì)粒DNA DNA 電泳檢測過程示意圖電泳檢測過程示意圖質(zhì)粒質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取與電泳檢測注意事項(xiàng)注