微生物的實驗室培養(yǎng)1

1、微生物包括哪五類：微生物包括哪五類：真菌真菌原生動物原生動物特點：特點：結構都相當簡單結構都相當簡單, ,個體多數十分微小個體多數十分微小. .通通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結構的甚至沒有細胞結構. .且體內一般不含有葉綠且體內一般不含有葉綠素素. .不能進行光合作用不能進行光合作用. . 原核生物界原核生物界 原生生物界原生生物界真菌界真菌界病毒界病毒界一、培養(yǎng)基的概念、種類及營養(yǎng)要素一、培養(yǎng)基的概念、種類及營養(yǎng)要素1概念：人們按照微生物對概念：人們按照微生物對_的不的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質。同需求，配制出供

2、其生長繁殖的營養(yǎng)基質。2種類：按照培養(yǎng)基的形態(tài)劃分。種類：按照培養(yǎng)基的形態(tài)劃分。(1)液體培養(yǎng)基：配制成的液體培養(yǎng)基：配制成的_狀態(tài)的基質。狀態(tài)的基質。營養(yǎng)物質營養(yǎng)物質液體液體(2)固體培養(yǎng)基：配制成的固體培養(yǎng)基：配制成的_狀態(tài)的基質。在液狀態(tài)的基質。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑，如瓊脂，制成瓊脂固體培體培養(yǎng)基中加入凝固劑，如瓊脂，制成瓊脂固體培養(yǎng)基，是實驗室中最常用的培養(yǎng)基之一，微生物在養(yǎng)基，是實驗室中最常用的培養(yǎng)基之一，微生物在其上面生長，可形成肉眼可見的其上面生長，可形成肉眼可見的_，主要用于，主要用于微生物的分離、鑒定等。微生物的分離、鑒定等。固體固體菌落菌落按照培養(yǎng)基的物理性質劃分按照培

3、養(yǎng)基的物理性質劃分液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長半固體培養(yǎng)基：無動力 有動力(彌散固體培養(yǎng)基：菌落固體培養(yǎng)基：菌落按照培養(yǎng)基的化學成分劃分按照培養(yǎng)基的化學成分劃分選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物鑒定培養(yǎng)基：鑒定所培養(yǎng)生物的類型2、培養(yǎng)基配制原則： （1）目的要明確：根據微生物的種類、培養(yǎng)目的等確定配制培養(yǎng)基的種類，因為不同的微生物對培養(yǎng)物質的需求不同。 （2）營養(yǎng)要協(xié)調：注意各種營養(yǎng)物質的濃度和比例。 （3）pH要適宜：各種微生物適宜生長的

4、pH范圍不同。 細菌pH為：6.5-7.5； 放線菌pH為：7.5-8.5； 真菌pH為：5.0-6.0。3、培養(yǎng)基的營養(yǎng)構成 不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水水、碳源碳源、和、和氮源氮源、無機鹽無機鹽等營養(yǎng)物質，另等營養(yǎng)物質，另外還需要滿足微生物生長對外還需要滿足微生物生長對pH、特殊特殊營養(yǎng)物質營養(yǎng)物質,例如例如:生長因子生長因子(即細菌生長必即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物需，而自身不能合成的化合物,如維生如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。 特別提示特別提示(1)

5、微生物最常用的碳源是糖類，尤其微生物最常用的碳源是糖類，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是銨鹽、硝酸鹽。是葡萄糖；最常利用的氮源是銨鹽、硝酸鹽。(2)對異養(yǎng)微生物來說，含對異養(yǎng)微生物來說，含C、H、O、N的有機物的有機物既是碳源，又是氮源、能源。既是碳源，又是氮源、能源。(3)有些培養(yǎng)基不需要添加生長因子，生物自己能有些培養(yǎng)基不需要添加生長因子，生物自己能合成；而絕大多數微生物培養(yǎng)需要加入生長因子，合成；而絕大多數微生物培養(yǎng)需要加入生長因子，原因是他們缺乏合成這些物質所需要的酶或合成原因是他們缺乏合成這些物質所需要的酶或合成能力有限。能力有限。pH 特殊營養(yǎng)物質特殊營養(yǎng)物質 氧氣氧氣 維生素維生素

6、 酸性酸性 中性或微堿性中性或微堿性 無氧無氧 二、無菌技術二、無菌技術1獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是防止獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是防止_的入的入侵，具體操作如下：侵，具體操作如下：(1)對實驗操作的對實驗操作的_、操作者的衣著和手進行清、操作者的衣著和手進行清潔和消毒。潔和消毒。(2)將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。等器具進行滅菌。(3)為避免周圍環(huán)境中為避免周圍環(huán)境中_的污染，實驗操作的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。應在酒精燈火焰附近進行。(4)實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與_相

7、接觸。相接觸。外來雜菌外來雜菌空間空間微生物微生物周圍的物品周圍的物品旁欄思考題旁欄思考題1無無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？其他外來微生物污染外，還有什么目的？解析解析許多微生物對人類是有害的，因此實許多微生物對人類是有害的，因此實驗室中無菌技術還能有效避免操作者自身被微生驗室中無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。物感染。答案答案無無菌技術還能有效避免操作者自身被菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。微生物感染。2消毒和滅菌消毒和滅菌(1)消毒消毒概念：使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物概念：使用較為溫和

8、的物理或化學方法僅殺死物體表面或體表面或_一部分對人體有危害的微生物一部分對人體有危害的微生物(不不包括芽孢和孢子包括芽孢和孢子)。常用方法：常用方法：_消毒法、巴氏消毒法、化學藥消毒法、巴氏消毒法、化學藥劑消毒法等。劑消毒法等。(2)滅菌滅菌概念：使用強烈的理化因素殺死物體內外概念：使用強烈的理化因素殺死物體內外_的的微生物。微生物。常用方法：灼燒滅菌、干熱滅菌、常用方法：灼燒滅菌、干熱滅菌、_滅滅菌。菌。內部內部煮沸煮沸所有所有高壓蒸汽高壓蒸汽(1)消消毒和滅菌的區(qū)別毒和滅菌的區(qū)別 （2 2）常用的消毒、滅菌手段）常用的消毒、滅菌手段 (2)滅菌所依據的原理基本都是使菌體內的蛋白質和核滅菌

9、所依據的原理基本都是使菌體內的蛋白質和核酸發(fā)生變性，從而達到殺菌的效果。酸發(fā)生變性，從而達到殺菌的效果。(3)消毒時一般不能殺死微生物的芽孢的原因是：芽孢消毒時一般不能殺死微生物的芽孢的原因是：芽孢是細胞生長發(fā)育后期，在細胞內形成的一個圓柱或橢圓是細胞生長發(fā)育后期，在細胞內形成的一個圓柱或橢圓形形 、厚壁、含水量極低、抗逆性很強的休眠體，它抗、厚壁、含水量極低、抗逆性很強的休眠體，它抗熱、抗化學藥物、抗靜水壓的能力極強。熱、抗化學藥物、抗靜水壓的能力極強。思維激活思維激活1 用用酒精擦拭實驗者手臂屬消毒還是滅酒精擦拭實驗者手臂屬消毒還是滅菌？菌？70%與與95%的酒精，哪一種效果更好？為什的酒

10、精，哪一種效果更好？為什么？么？提示提示酒精擦拭屬化學消毒，酒精消毒時，酒精擦拭屬化學消毒，酒精消毒時，70%的酒精殺菌效果最好。原因是：濃度過高，使菌的酒精殺菌效果最好。原因是：濃度過高，使菌體表面蛋白質凝固成一層保護膜，乙醇分子不能體表面蛋白質凝固成一層保護膜，乙醇分子不能滲入其中；濃度過低，殺菌力減弱。滲入其中；濃度過低，殺菌力減弱。1、器具的滅菌2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存三、純化大腸桿菌的無菌操作三、純化大腸桿菌的無菌操作本實驗使用本實驗使用_固體培養(yǎng)基進行大腸固體培養(yǎng)基進行大腸桿菌的純化培養(yǎng)，可分成桿菌的純化培養(yǎng)，可分成_和

11、純化大和純化大腸桿菌兩個階段進行。腸桿菌兩個階段進行。牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基1制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(1)制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的步驟：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的步驟： 稱量稱量 倒平板。倒平板。(2)倒平板的過程：倒平板的過程：在火焰旁右手拿錐形瓶，左手在火焰旁右手拿錐形瓶，左手 。右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過 。左手將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培左手將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，左手立刻養(yǎng)皿，左手立刻 。待平板冷卻凝固后，將平板待平板冷卻凝固后，將平板 放置，使皿

12、蓋放置，使皿蓋在下、皿底在上。在下、皿底在上。計算計算溶化溶化滅菌滅菌拔出棉塞拔出棉塞火焰火焰蓋上皿蓋蓋上皿蓋倒過來倒過來1制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基計計算：依據牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方比例，計算：依據牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方比例，計算配制算配制100 mL 的培養(yǎng)基時，各種成分的用量的培養(yǎng)基時，各種成分的用量 稱量：牛肉膏比較黏稠，可用稱量紙稱取，牛稱量：牛肉膏比較黏稠，可用稱量紙稱取，牛肉膏和蛋白胨都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱肉膏和蛋白胨都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后要及時蓋上瓶蓋后要及時蓋上瓶蓋無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中

13、培養(yǎng)的溫室中培養(yǎng)2448小時，以檢查滅菌是否徹底。小時，以檢查滅菌是否徹底。倒平板倒平板:微生物培養(yǎng)中有關實驗操作的注意事項微生物培養(yǎng)中有關實驗操作的注意事項1倒平板操作倒平板操作(1)培養(yǎng)基滅菌后，需冷卻至培養(yǎng)基滅菌后，需冷卻至50 左右時才能倒平左右時才能倒平板，原因是瓊脂在板，原因是瓊脂在44 以下凝固。以下凝固。(2)培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，不要完全培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，不要完全打開。打開。(3)整個操作過程要在酒精燈火焰旁進行，避免雜整個操作過程要在酒精燈火焰旁進行，避免雜菌污染。菌污染。(4)平板冷凝后要倒置的原因：防止皿蓋上的冷凝平板冷凝后要倒置的原因：防止皿蓋

14、上的冷凝水落入培養(yǎng)基，造成污染。水落入培養(yǎng)基，造成污染。(5)若倒平板時，培養(yǎng)基濺在皿蓋和皿底之間的部若倒平板時，培養(yǎng)基濺在皿蓋和皿底之間的部位，這個平板應丟棄。位，這個平板應丟棄。倒平板操作討論題倒平板操作討論題1培培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時，左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？溫度？答案答案可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。進行倒平板了。2為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰

15、？為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答案答案通通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。染培養(yǎng)基。3平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，為什么要將平板倒置？答案答案平平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。4在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿

16、底之間的部位，這個平板還能用來濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答案答案空空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。養(yǎng)微生物。（二）、純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法 平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面. 在數次畫線后,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.菌落： 單個或少數細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一單個或少數細

17、菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結構的子細胞群體，叫做菌個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結構的子細胞群體，叫做菌落落。 菌落是鑒定菌種的重要依據。菌落是鑒定菌種的重要依據。菌落細菌的菌落特征因種而異 霉菌的菌落特征因種而異菌落接種環(huán)接種針 平板劃線的操作方法交叉劃線法連續(xù)劃線法 1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？ 答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的

18、末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。 2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。 3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 答：劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。涂布器 涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？

19、應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。四、課題成果評價 （一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點， (在肉湯培養(yǎng)基上，大腸桿菌菌落呈白色，為圓形，光滑有光澤，邊緣整齊)則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現了其他菌落，(在某培養(yǎng)基上出現了3種特征不同的菌落，原因有培養(yǎng)基滅菌不徹底或雜菌感染等。)則說明接種過程中，無菌

20、操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。（三）是否進行了及時細致的觀察與記錄 培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發(fā)現這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學生良好的科學態(tài)度與習慣。31培養(yǎng)未接種培養(yǎng)基的作用是培養(yǎng)未接種培養(yǎng)基的作用是對照對照，若有菌落形成，說明培養(yǎng)，若有菌落形成，說明培養(yǎng)基滅菌不徹底。基滅菌不徹底。32在肉湯培養(yǎng)基上，大腸桿菌菌落呈在肉湯培養(yǎng)基上，大腸桿菌菌落呈白白色，為圓形，光滑有光色，為圓形，光滑有光澤，邊緣整齊。澤，邊緣整齊。33培養(yǎng)培養(yǎng)12h和和24h后的菌落大小后的菌落大小不同不同（相同、不同）；菌落

21、分（相同、不同）；菌落分布位置布位置相同相同（相同、不同）。原因是時間越長，菌落中細菌繁殖（相同、不同）。原因是時間越長，菌落中細菌繁殖越多，菌落體積越大；菌落的位置不動，但菌落數增多。越多，菌落體積越大；菌落的位置不動，但菌落數增多。34在某培養(yǎng)基上出現了在某培養(yǎng)基上出現了3種特征不同的菌落，原因有培養(yǎng)基滅菌種特征不同的菌落，原因有培養(yǎng)基滅菌不徹底或雜菌感染等。不徹底或雜菌感染等。n結果分析與評價n課題延伸（P20）1、臨時保藏法對象：溫度： 缺點： 2、甘油管藏法： 對象： 溫度：頻繁使用的菌種 4（冰箱） 容易被污染或產生變異 長期保存的菌種 -20（冷凍箱） 本課題知識小結:【典例解析】 例1關微生物營養(yǎng)物質的敘述中，正確的是A.是碳源的物質不可能同時是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機物只提供無機鹽 D.無機氮源也能提供能量 解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A