早孕因子的生物學(xué)機(jī)制及其作用

1、早孕因子的生物學(xué)機(jī)制及其作用 10-04-21 14:23:00 編輯：studa20作者：修曉娜 ，史遠(yuǎn)剛，關(guān)偉軍，馬月輝【關(guān)鍵詞】 早孕因子 早孕因子（early pregnancy factor,EPF）是存在于妊娠早期母體血清中的一種免疫抑制因子，被認(rèn)為是熱休克蛋白家族成員伴侶蛋白10（Cpn10）的同系物，在細(xì)胞外發(fā)揮效應(yīng)，具有免疫抑制和生長因子的作用，嗣后發(fā)現(xiàn)它還對損傷修復(fù)過程及一些惡性腫瘤的生長起到支持作用。可用玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)（RIT）做生物學(xué)鑒定。但由于其檢測方法RIT的復(fù)雜性及檢測效率低等問題，EPF的應(yīng)用受到了極大限制。近年隨著單克隆抗體（McAb）技術(shù)的不斷進(jìn)展，EPF

2、的檢驗(yàn)不僅可作為人類及家畜超早期妊娠診斷的指標(biāo)，而且對預(yù)測流產(chǎn)和早期胚胎死亡，迅速鑒定胚胎移植效果以及盡早評價(jià)公畜的繁殖能力都有重要意義。并且EPF對于預(yù)測早期胚胎發(fā)育情況，幫助了解妊娠母體對胚胎的識別、免疫耐受和受精檢測等機(jī)制提供了可能。我們希望能夠制備出EPF特異性McAb，用于超早孕診斷，以及流產(chǎn)和某些惡性腫瘤的早期診斷及預(yù)后判斷。 1早孕因子的來源長期以來，人們對EPF的來源及結(jié)構(gòu)做了多方面的研究，認(rèn)為有一種卵因子在受精后開始誘導(dǎo)產(chǎn)生EPF。Lash等1在不同體外條件如:胚胎培養(yǎng)基（ECM）、血小板激活因子（PAF）及皮質(zhì)顆粒釋放培養(yǎng)基（CGRM）下刺激動(dòng)情期小鼠的卵巢及輸卵管以觀察是

3、否有EPF的產(chǎn)生，并用RIT檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種情況均可檢測到EPF活性，該作用可完全被BN52021（一種PAF拮抗劑）阻斷，認(rèn)為PAF即系這種由受精卵釋放的促使EPF合成起始的卵因子。他們還發(fā)現(xiàn)，卵巢對上述三種刺激均有反應(yīng)，而輸卵管則無，表明了卵巢是產(chǎn)生EPF的最初場所。EPF的產(chǎn)生具有兩個(gè)階段也是人們所共同支持的觀點(diǎn)，第一階段為著床前期，為了確定第二階段是在著床時(shí)還是在囊胚期，Lash等2利用紅鹿受精卵在輸卵管內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間較長這一特性，通過監(jiān)測其血清內(nèi)EPF活性變化，證實(shí)EPF的合成與囊胚形成密切相關(guān)。Ito等3對胎牛、小牛、動(dòng)情期牛及妊娠期牛血清與體外受精的牛卵細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，用RIT檢測

4、EPF活性，結(jié)果顯示EPF活性來源于受精卵細(xì)胞。Aranha等4以35S-蛋氨酸標(biāo)記從孕母體內(nèi)獲取的淋巴細(xì)胞并培養(yǎng)使其增生，發(fā)現(xiàn)在妊娠期間淋巴細(xì)胞內(nèi)蛋白合成增加，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)其中一種具有EPF活性的分子。實(shí)驗(yàn)組35S-蛋氨酸在淋巴細(xì)胞中含量明顯高于對照組，且在妊娠前兩個(gè)階段呈逐漸增高的趨勢，在妊娠晚期降到接近對照組的水平。表明EPF有可能來源于孕婦外周血的淋巴細(xì)胞。有學(xué)者利用類固醇激素誘導(dǎo)培養(yǎng)動(dòng)情期小鼠卵巢及輸卵管檢測是否有EPF合成，以探知卵巢激素對EPF合成的重要意義。發(fā)現(xiàn)在17-雌二醇、孕激素及睪酮存在條件下對動(dòng)情期小鼠卵巢及輸卵管進(jìn)行培養(yǎng)，無EPF合成，而在ECM及PAF條件下培養(yǎng)經(jīng)17

5、-雌二醇、孕激素二者預(yù)處理的相同組織則可檢測到EPF活性，證實(shí)EPF的合成起始主要依賴于一個(gè)合適的激素環(huán)境5。 2早孕因子分泌機(jī)制和作用機(jī)制 2.1分泌機(jī)制關(guān)于EPF的分泌機(jī)制已報(bào)道了幾種假設(shè)，其中以Lash等及Orozco等的研究最為權(quán)威。Lash等6在不同體外條件如胚胎培養(yǎng)基（ECM）、血小板激活因子（PAF）及皮質(zhì)顆粒釋放培養(yǎng)基（CGRM）下刺激動(dòng)情期小鼠的卵巢及輸卵管時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種情況均可檢測到EPF活性，該作用可完全被BN52021（一種PAF 拮抗劑） 阻斷，認(rèn)為PAF即是這種由受精卵釋放的促使EPF合成起始的“卵因子”。他們還發(fā)現(xiàn)，卵巢對上述三種刺激均有反應(yīng)，而輸卵管則無，表明

6、了卵巢是產(chǎn)生EPF的最初場所。Orozco等7給成年雌鼠注射合成的PAF，1 h內(nèi)動(dòng)物血清表現(xiàn)出EPF活性，推測源于胚胎的PAF可能就是觸發(fā)著床前產(chǎn)生血清EPF的動(dòng)因。而在ECM及PAF條件下培養(yǎng)經(jīng)17-雌二醇、孕激素二者預(yù)處理的相同組織，可檢測到EPF活性，證實(shí)EPF的合成起始主要依賴于一個(gè)合適的激素環(huán)境。妊娠時(shí)產(chǎn)生的EPF的來源不同，早期EPF（母體EPF）系在植入（pre-implantation） 及圍植入（peri-implantation）時(shí)產(chǎn)生，而晚期（胎兒性EPF）則自圍植入期開始一直持續(xù)至妊娠中期，但對附植前血清EPF的體內(nèi)來源說法不一，而普遍認(rèn)為EPF的產(chǎn)生與卵巢、輸卵管、

7、受精卵、胎盤、垂體等有關(guān)。 2.2作用機(jī)制在EPF作用機(jī)制的研究中，科學(xué)家們也做出了許多成績。EPF通過至少兩種淋巴因子EPF-S1和EPF-S2的調(diào)節(jié)發(fā)揮作用，前者是受主要組織相容性復(fù)合物（MHC）限制的，后者不受MHC的限制，并且已經(jīng)分離純化出EPF-S1的類似物，具有生物活性，EPF-S1可誘導(dǎo)產(chǎn)生EPF-S2?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為EPF是熱休克蛋白家族成員伴侶蛋白10（Cpn10）的同系物，但Somodevilla Torres等8證實(shí)Cpn10和EPF在作用機(jī)制上有區(qū)別。在Lewis鼠的皮膚移植實(shí)驗(yàn)中，在移植部位注射rEPF后，能延長皮膚的存活時(shí)間，表明EPF具有免疫抑制的調(diào)節(jié)作用，抑制了機(jī)

8、體的免疫排斥作用9。Zhang等用rEPF處理患有腦脊髓炎（exper imental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的小鼠，進(jìn)行分析檢測，發(fā)現(xiàn)EPF抑制了細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)，并可減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，提出EPF可呈劑量依賴性地抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）的識別相，EPF也可誘導(dǎo)非黏附性的Thy12+ 、Lyt- 、Lyt2+調(diào)節(jié)細(xì)胞（即抑制細(xì)胞），EPF的免疫效應(yīng)不受MHC所限制，小鼠在胚胎植入前給予抗EPF抗體，可減少植入數(shù)，提示EPF在生殖過程的這一階段具有重要意義。EPF有調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)作用10，11，抗CD4+能

9、抑制綿羊紅細(xì)胞和其在T細(xì)胞上受體的相互作用，EPF是通過抗CD4+來發(fā)揮其抑制作用的。在小鼠實(shí)驗(yàn)中表明它具有抑制遲發(fā)型過敏反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)它會對一些淋巴細(xì)胞有約束作用，推測它通過約束CD4+T細(xì)胞來發(fā)揮作用。經(jīng)分離T細(xì)胞和單核細(xì)胞，并用EPF標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)EPF會約束CD4+、CD8+、CD14+和CD56+NK細(xì)胞，但是EPF作用的細(xì)胞表面分子仍沒有研究清楚。 3早孕因子的生物學(xué)作用 3.1在生長調(diào)節(jié)中的作用在發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞也可產(chǎn)生EPF后，人們就推測EPF可能與細(xì)胞分裂有關(guān)，有促進(jìn)細(xì)胞生長的功能。有以下幾方面的研究結(jié)果來驗(yàn)證這一觀點(diǎn):（1）在體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可分泌EPF，并與細(xì)胞生長

10、時(shí)相有關(guān)，細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入分化階段時(shí)，產(chǎn)生的EPF明顯減少。當(dāng)腫瘤細(xì)胞與不同濃度的EPF單克隆抗體共同培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的存活率隨抗體濃度增加而降低。同一研究還證實(shí)了EPF可與淋巴細(xì)胞相互作用，激活免疫抑制因子，抑制免疫。因此腫瘤的發(fā)生可能是EPF免疫抑制和生長調(diào)節(jié)活性共同作用的結(jié)果。（2）在維持胚胎活性中的作用。Athanasas Platsis等12通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在受精后第3天，使用EPF抗體的所有小鼠中，體內(nèi)的胚胎沒發(fā)生同樣情況。近期，同一研究小組還發(fā)現(xiàn)在胚胎植入前期對母鼠使EPF抗體可導(dǎo)致植入失敗，且胚泡滋養(yǎng)層細(xì)胞生長明顯受到抑制13。（3）1994年Ouinn等14在小鼠進(jìn)行肝臟

11、部分切除術(shù)8 h后的血清中檢測到EPF，術(shù)后48 h達(dá)到高峰。如果術(shù)后18 h用抗體主動(dòng)免疫小鼠，結(jié)果殘余肝臟對3H胸苷的攝取量明顯下降，說明在肝細(xì)胞增生期間，EPF對DNA合成和細(xì)胞分裂很重要。這些證據(jù)提示，EPF可能是通過自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生的一種生長因子，并且參與正常細(xì)胞的增殖過程。然而有關(guān)其發(fā)揮調(diào)節(jié)生長功能機(jī)制的研究還未見報(bào)道。 3.2在生殖免疫學(xué)中的意義鄧松華等15為探討EPF活性物對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響及其在胎母免疫中的作用，用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化法觀察EPF對后者的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它能抑制淋巴細(xì)胞DNA合成，即抑制它的增殖，并呈一定劑量依賴性。根據(jù)近年來的文獻(xiàn)報(bào)道，其作用機(jī)制主要有以

12、下幾方面:（1）EPF直接抑制淋巴細(xì)胞DNA的合成。（2）EPF結(jié)合在淋巴細(xì)胞上，刺激它產(chǎn)生可溶性抑制因子。其中的兩種已被初步認(rèn)識，分別命名為EPF-S1T和EPF-S2。（3）EPF可抑制某些細(xì)胞因子的產(chǎn)生。IL-2主要由CD4+和CD8+細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖與分化，是機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)中重要的細(xì)胞因子，因此IL-2的檢測已成為評價(jià)機(jī)體免疫功能狀態(tài)的指標(biāo)之一9。體外實(shí)驗(yàn)，EPF能抑制IL-2產(chǎn)生，且抗胸腺細(xì)胞球蛋白（ATG）能增強(qiáng)這種抑制作用。IL-2活性水平的降低可能參與EPF對淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用16。（4）黏附分子的表達(dá)下降。2000年，Zhang等17用rEPF治療Lewis小

13、鼠的多發(fā)性硬化癥的動(dòng)物模型（EAE），可緩解其臨床癥狀。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，用rEPF治療與用Vehicle治療相比，脊髓實(shí)質(zhì)中CD4+與CD8+細(xì)胞滴度降低;用rEPF治療后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的白細(xì)胞相關(guān)功能抗原-1（LFA-1），血管黏附分子-4（VLT-4）和型補(bǔ)體受體（Mac-1）以及免疫球蛋白超家族中的粘連分子細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子（VCAM-1）都受到抑制。這些黏附分子的減少使T細(xì)胞激活失去了必要的協(xié)同刺激信號，影響了淋巴細(xì)胞的增殖。Igarashi18對早孕因子對生殖免疫的作用總結(jié)為: （1）EPF可劑量依賴性地抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）的識別相。（2）E

14、PF可誘導(dǎo)非黏附性的Thy12+ 、Lyt-、Lyt2+調(diào)節(jié)細(xì)胞，即抑制細(xì)胞。（3）EPF的免疫效應(yīng)不受主要組織相容性復(fù)合物（MHC）所限制。（4）小鼠在胚胎植入前給予抗EPF抗體，可減少植入數(shù)，提示EPF在生殖過程的這一階段具有重要意義。 3.3作為腫瘤鑒別Mehta等19報(bào)道患滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的孕婦血清中可檢出EPF樣活性物質(zhì)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)僅在絨毛膜癌患者血清中可檢測出，而葡萄胎患者血清中卻未測出，提示檢測EPF有助于鑒別葡萄胎及絨癌。Rolfe等20報(bào)道睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者血清中可測出EPF或EPF樣活性物（tEPF），而健康男性對照者均未測出。由此看來，EPF并非孕婦特有，即某些生殖細(xì)胞腫瘤

15、患者血清中亦存在。 4早孕因子的檢測與分離 4.1檢測EPF的檢出是用抗淋巴球血清（ALS）的RIT，其含量用RIT值的高低來衡量。 4.1.1原理在補(bǔ)體存在下，淋巴細(xì)胞可與異源紅細(xì)胞形成玫瑰花環(huán)。而ALS能夠抑制花環(huán)的形成。當(dāng)加入ALS后花環(huán)的形成數(shù)是未加ALS的75時(shí)，ALS的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)10-8取以2為底的對數(shù)所得值即RIT。EPF能抑制玫瑰花環(huán)的形成，故被檢樣品中含有EPF就能減少ALS的量而形成同樣多的花環(huán)，即RIT增高。EPF含量越多，RIT值也越高。一般，RIT12者為EPF陽性，RIT12者為EPF陰性。依此原理可以檢測孕畜和未孕畜血清或組織中的EPF。 4.1.2玫瑰花

16、環(huán)抑制試驗(yàn)的可靠性在用花環(huán)抑制試驗(yàn)檢測EPF時(shí)，只有T細(xì)胞的某一亞群預(yù)先不經(jīng)處理，添加紅細(xì)胞后立即形成的自然花環(huán)（Ea花環(huán)）才有意義。但這一亞群淋巴細(xì)胞占T細(xì)胞總數(shù)較低，豬中約為10。雖然用物理或化學(xué)的方法可以提高花環(huán)形成率，但經(jīng)處理的淋巴細(xì)胞在檢測EPF時(shí)沒有意義。許多物質(zhì)，如免疫抑制藥物、精漿、HCG、甲胎蛋白和巨球蛋白等均能抑制自然花環(huán)的形成。此外，能破壞淋巴細(xì)胞形態(tài)和代謝完整性的制劑如神經(jīng)氨酸鹽、三氫化合物、肝素、去污劑等，甚至在有Ca2+、Mg2+等無機(jī)離子存在時(shí)，都能影響此測定系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。Koch等（1985）對以前測定EPF的方法稍加改進(jìn)測定豬的EPF，假陽性率為8.9，假陰性

17、率為12.5。Morton等采集懷孕1個(gè)月的綿羊40個(gè)樣品，只有來自同一只羊的兩個(gè)樣品EPF呈假陰性，而未孕羊的所有樣品RIT值都在未孕范圍內(nèi)。一般說來，花環(huán)抑制試驗(yàn)分析未孕血清比懷孕血清更為可靠。測未孕血清時(shí)重復(fù)性較好，批內(nèi)變異系數(shù)為6.8，而測懷孕血清時(shí)重復(fù)性較差，批內(nèi)變異系數(shù)為23.8。在用花抑制試驗(yàn)測定EPF時(shí)，用單克隆抗體替代ALS有望對此法做一改進(jìn)，可以比較不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果。因EPF無種屬特異性，測定系統(tǒng)可通用。 4.2分離到目前為止，已做了試圖將母體和胎兒EPF分離的各種試驗(yàn)。Clarke等（1982）和Wilson（1983）將妊娠母羊血清作材料，用離子交換和凝膠層析分離，得到分子量為20 000和67 000的多肽，分子量為20 000的物質(zhì)是胎兒（后期）EPF活性高的部分。為分離母體（早期）的EPF，Cavanach培養(yǎng)液中培養(yǎng)5天，從培養(yǎng)基中分離到分子量為21 000的EPF，此物質(zhì)中90具有生物活性。這些來自母體EPF與胎兒EPF和來自腫瘤的某些物質(zhì)具有相似性質(zhì)，分子量20 00021 000，并具有相互的免疫交叉反應(yīng)；但在化學(xué)性質(zhì)方面