Nov12細胞衰老分子機理研究進展

1、1 生命科學永恒的主題生命科學永恒的主題 v “衰老”老年病老年病 百病之源百病之源。v老年病老年病 發(fā)病率發(fā)病率 老年性癡呆（ad） 65歲老人1/20 85歲以上老人 v人一生中醫(yī)療費人一生中醫(yī)療費 2/3用于晚年用于晚年 ？ 健康、長壽健康、長壽2000年年（第五次）我國人口普查我國人口普查 65歲歲 老人老人=總?cè)丝诳側(cè)丝?0% 約約1.2億億65歲以上人口： 714 法國需114年 中國需 27年 （美國人口局，（美國人口局，u.s. census bureau預測）預測）2因老而衰： 預防老年病 造福個人與家庭 節(jié)約社會財富 解放生產(chǎn)力弄清衰老機理弄清衰老機理，可有的放矢有的放矢,

2、提出因應舉措提出因應舉措， 提高延衰效能。老年病種類繁多老年病種類繁多（老年性癡呆（老年性癡呆,帕金森病等神經(jīng)退行性疾病帕金森病等神經(jīng)退行性疾病,老年老年 糖尿病、骨質(zhì)疏松、心、腦血管、呼吸等系統(tǒng)疾患糖尿病、骨質(zhì)疏松、心、腦血管、呼吸等系統(tǒng)疾患,以及腫瘤以及腫瘤） 表現(xiàn)有別表現(xiàn)有別 發(fā)病各異發(fā)病各異3。 4如今，全球生命科學研究最熱的三個領(lǐng)域是：全球生命科學研究最熱的三個領(lǐng)域是： 衰老、肥胖和癌癥，衰老在其中獨占鰲頭。衰老在其中獨占鰲頭。 人類對衰老的探究幾乎從封建社會建立以來，就有所記載，然而，人類對衰老的探究幾乎從封建社會建立以來，就有所記載，然而，真正進入科學研究衰老的范疇，還是近真正進

3、入科學研究衰老的范疇，還是近2020年的事。年的事。 現(xiàn)在，國內(nèi)外科學家對衰老的研究主要集中在哪些方面？從哪些現(xiàn)在，國內(nèi)外科學家對衰老的研究主要集中在哪些方面？從哪些角度進行研究？科學家都取得了怎樣的成就？角度進行研究？科學家都取得了怎樣的成就？ 生命世界衰老的科學研究策劃案 03 30, 2006 生命世界中國科學院主管，中國科學院植物研究所、中國植物學會和高等教育出版社聯(lián)合主辦 5 各組織器官功能隨年齡增加呈線型進行性下降各組織器官功能隨年齡增加呈線型進行性下降406080100406080100功能百分比（）功能百分比（）年齡（年歲）年齡（年歲）神經(jīng)傳導速度神經(jīng)傳導速度心臟輸出指數(shù)心臟輸

4、出指數(shù)腎小球濾過速度腎小球濾過速度最大呼吸容量最大呼吸容量0.4%0.8%1.0%1.1% 人為什么會衰老？人為什么會衰老？ 6統(tǒng)計資料表明：子女的壽命常與雙親的壽命有關(guān)； 各種動物的最高壽限相當恒定。 衰老進程由環(huán)境衰老進程由環(huán)境（外因）（外因）與遺傳與遺傳（內(nèi)因）（內(nèi)因） 兩大因素決定兩大因素決定71992年世界衛(wèi)生組織年世界衛(wèi)生組織 人的壽命決定因素人的壽命決定因素 遺傳因素遺傳因素 15%社會經(jīng)濟因素社會經(jīng)濟因素 10%醫(yī)療服務技術(shù)醫(yī)療服務技術(shù) 8%氣候因素氣候因素 7%生活習慣、衛(wèi)生行為、精神面貌、保健意識等生活習慣、衛(wèi)生行為、精神面貌、保健意識等 60%？the results o

5、f human twin studies suggest that only 20-30% of the variation in survival to an age of about 85 years is determined by genetics a. m. herskind et al., hum genet 97, 319 , 19968平均壽命主要與環(huán)境相關(guān)平均壽命主要與環(huán)境相關(guān)；物種最高壽限與遺傳相關(guān)物種最高壽限與遺傳相關(guān)。不良環(huán)境可作用于遺傳物質(zhì)或其產(chǎn)物不良環(huán)境可作用于遺傳物質(zhì)或其產(chǎn)物 影響衰老進程影響衰老進程。 段建明等段建明等 （duan jm, et al.） int

6、l j biochem cell biol 37 (2005) 14071420 （基因?qū)勖挠绊憠勖挠绊懀┚€蟲線蟲(c. elegans )研究首次嚴格證明：單基因突變即可影響壽命。嚴格證明：單基因突變即可影響壽命。clk 基因與daf-2基因基因雙突變，突變，線蟲壽命延長壽命延長5 5倍倍。 基因?qū)λダ线M程的主導性基因?qū)λダ线M程的主導性9人類人類“長壽基因的探索長壽基因的探索 puca, aa （ childrens hosp ）與與perls, thomas（ boston univ ）等等（proc. natl. acad. sci. usa, 2001）報道：報道： 分析分析13

7、7組組 (308人人)長壽同胞，百歲老人血樣長壽同胞，百歲老人血樣發(fā)現(xiàn)：四號染色體發(fā)現(xiàn)：四號染色體 d4s1564 (d代表代表dna, d后的數(shù)字表示染色體號后的數(shù)字表示染色體號,s代代表節(jié)段表節(jié)段segment,s后的數(shù)字表示微衛(wèi)星在染色體上的編號后的數(shù)字表示微衛(wèi)星在染色體上的編號) 位點與眾不同，位點與眾不同，可能含有可能含有“長壽基因長壽基因”。 perls： 一年以后見分曉一年以后見分曉 ？10sebastiani p, et al.genetic signatures of exceptional longevity in humans. 老壽星老壽星的的遺傳特征遺傳特征 scie

8、nce 2010 jul 21. epub1055（ centenarians）：1267 （controls）分析結(jié)果：建立了以150 snps (single-nucleotide polymorphisms)為基礎(chǔ)的 分類模型。 該模型用于另一組（百歲老人及其對照）：正確率 77% 。芯片分析顯示：按差異snp（或遺傳特征 ）不同組合，可將90%的百歲老人分成19個群體。一種組合可能與某一老年病(e.g., dementia, hypertension, and cardiovascular disease)易感性有關(guān)，或可由此將健康老人的表型分成不同亞型。 新英格蘭百歲老人研究中心新英

9、格蘭百歲老人研究中心(new england centenarian study) 11細胞模型相互配合，可補細胞模型相互配合，可補衰老的實驗性研究成果累累12v細胞細胞 生物生物的的基本構(gòu)成單位基本構(gòu)成單位v細胞衰老細胞衰老 老年病發(fā)病老年病發(fā)病的的共同基礎(chǔ)共同基礎(chǔ)（人胚細胞可傳人胚細胞可傳60-70代，代，50歲成人細胞只能傳歲成人細胞只能傳1020代代）v理想狀態(tài)：理想狀態(tài)：人類細胞衰老模型與動物實驗相輔相成人類細胞衰老模型與動物實驗相輔相成動物整體實驗相配合，可取長補短，相輔相成。動物整體實驗相配合，可取長補短，相輔相成。13 細胞衰老 （cell senescence） 生物衰老的基

10、本單位生物衰老的基本單位 老年病發(fā)病的共同基礎(chǔ)老年病發(fā)病的共同基礎(chǔ)細胞衰老細胞衰老老年退行性變老年退行性變功能衰退功能衰退 增殖能力下降增殖能力下降細胞數(shù)減少細胞數(shù)減少臟器萎縮臟器萎縮 細胞衰老細胞衰老是造成個體衰老的主要原因之一。是造成個體衰老的主要原因之一。 14 體外培養(yǎng)人類細胞衰老模型體外培養(yǎng)人類細胞衰老模型在在研究人類衰老研究人類衰老方面，具方面，具有有不可取代不可取代的優(yōu)點：的優(yōu)點：無模式動物存在種族差異的缺點無人體實驗取材難，操作難，周期長等缺點m. kuro-o(texas大學) “cell senescence has been suggested to be directl

11、y related to senescence of living organism, including humans.” cellular & molecular life sciences 57(2000):695-69715衰老機制復雜，單一的衰老相關(guān)指標難以準衰老機制復雜，單一的衰老相關(guān)指標難以準 確、特異地評估衰老程度。確、特異地評估衰老程度。 組建一套定量的細胞衰老生物學年齡指征組建一套定量的細胞衰老生物學年齡指征 準確定量細胞衰老程度，可準確定量細胞衰老程度，可1、研究各種因素對衰老進程的影響、研究各種因素對衰老進程的影響2、檢驗藥物抗衰作用，為中藥現(xiàn)代化提供技術(shù)、檢驗藥物抗衰

12、作用，為中藥現(xiàn)代化提供技術(shù) 支撐。支撐。16分子水平分子水平 細胞衰老指征細胞衰老指征 端粒長度端粒長度 細胞體外增殖能力細胞體外增殖能力 晚期糖基化終末產(chǎn)物晚期糖基化終末產(chǎn)物 衰老相關(guān)衰老相關(guān)-半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性 dna損傷修復能力損傷修復能力 dna甲基化程度甲基化程度 線粒體線粒體dna片段缺失片段缺失17我國端粒與人類細胞衰老相關(guān)性的研究我國端粒與人類細胞衰老相關(guān)性的研究端粒長度：端粒長度： 人類體細胞的計人類體細胞的計時器。每增加時器。每增加1 1代齡，端粒代齡，端粒長度減少約長度減少約49 bp49 bp。中國人外周血淋巴細胞的端粒長中國人外周血淋巴細胞的端粒長度每年平均

13、縮短度每年平均縮短35 bp35 bp。(張宗玉等，生物化學雜志,1995)southern blotstelomere lengths+細胞越老，端粒越短，細胞越老，端粒越短，電泳時電泳時跑得越快跑得越快18人胚成纖維細胞體外培養(yǎng)代齡與細胞增殖速度的關(guān)系人胚成纖維細胞體外培養(yǎng)代齡與細胞增殖速度的關(guān)系 細胞的體外增殖能力細胞的體外增殖能力 廣泛應用于衰老研究。growth curves mtt assay19人胚肺二倍體成纖維細胞人胚肺二倍體成纖維細胞(綠色者為衰老細胞綠色者為衰老細胞)衰老相關(guān)衰老相關(guān)半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性衰老細胞衰老細胞年輕細胞年輕細胞sa-gal staining

14、20 dna損傷修復能力損傷修復能力 隨增齡而下降隨增齡而下降comet assay彗星試驗彗星試驗（單細胞凝膠電泳） 尾長尾長(m) ；尾面積；尾面積/總面積總面積(%) 尾越長，尾越長，%越高，損傷越重越高，損傷越重21 晚期糖基化終末產(chǎn)物晚期糖基化終末產(chǎn)物 蛋白質(zhì)糖基化與大分子交聯(lián)，逐漸脫水，形成的一種具有黃棕色熒光的產(chǎn)物。determination of age (advanced glycation end product)22從分子水平組建一套從分子水平組建一套 為國際所承認的為國際所承認的 細胞衰老生物學指征。細胞衰老生物學指征。我室在國外刊物的部分相關(guān)論文我室在國外刊物的部分相

15、關(guān)論文：duan jm, int j biochem cell biol, 2005, 37:1407-1420zheng wj, et al. j biol chem 2004,279:31524-31532guo sz, et al. exp cell res 2004,298:465-472 huang y, et al. j cell physiol, 2004, 201: 483-491. zhang xw, et al. oncogene 2003, 22 : 2405-2416 wang pc, et al. mech age dev 2003,124: 1025-1034 du

16、an jm, et al. j biol chem 2001 276: 48325-48331.li jh, et al. mech age dev 1995,80:25-34. tang zq , et al. mech age dev 1994,73:57-67. 基因水平基因水平 細胞衰老指征？細胞衰老指征？231.5%1.0%0.5%-0.5%-1.0%-1.5% 2.0倍 2.5倍 3.0倍用cdna芯片檢測人二倍體成纖維細胞衰老基因表達譜的變化hgec-40s: 含4096條人類基因，衰老表達差異較大的基因有117種。24細胞衰老的基因表達譜研究 衰老細胞與年輕細胞基因（衰老細胞與

17、年輕細胞基因（4096條）芯片條）芯片雜交信號強度散點圖雜交信號強度散點圖-2-巨球蛋白巨球蛋白 在4096條人類基因的cdna微陣列表達譜中發(fā)現(xiàn)年輕和衰老細胞中表達變表達變化在化在5 5倍以上的基因倍以上的基因有有6 6種。種。其中-2-2-巨球蛋巨球蛋白基因白基因不僅在衰老的成纖維細胞表達明顯增高，在年輕細胞中的表達水平亦較其它5種基因高，易檢出，易定量。 青老25衰老過程中基因表達譜的變化衰老過程中基因表達譜的變化4096種中表達變化幅度種中表達變化幅度2.5倍的基因倍的基因46種種。下調(diào)的基因：參與細胞周期的基因等。下調(diào)的基因：參與細胞周期的基因等。上調(diào)的基因：細胞外基質(zhì)有關(guān)基因等。上

18、調(diào)的基因：細胞外基質(zhì)有關(guān)基因等。挑選表達變化大的基因，以挑選表達變化大的基因，以rt-pcr技術(shù)對其再技術(shù)對其再檢測。檢測。26 衰老時表達下降的衰老時表達下降的4種基因種基因27 衰老時表達增強的衰老時表達增強的5種基因種基因優(yōu)選優(yōu)選28衰老過程中衰老過程中-2-巨球蛋白、巨球蛋白、p16ink 4a和和p21waf1基因表達與代齡關(guān)系基因表達與代齡關(guān)系-2-巨球蛋白p16ink4ap21waf1將將-2-巨球蛋白，巨球蛋白，與眾所公認的細胞衰老與眾所公認的細胞衰老時表達增強的基因時表達增強的基因p16ink4a及及p21waf1相比相比較，從中選出最適合作較，從中選出最適合作為衰老標志物的

19、基因為衰老標志物的基因29northern blot 檢測檢測2bs細胞衰老過程中細胞衰老過程中 -2-巨球蛋白巨球蛋白（alpha-2- macroglobulin, 2m）的基因表達情況的基因表達情況gapdh2m代齡代齡 28 42 52 62細胞衰老標志基因的選定細胞衰老標志基因的選定30結(jié)論：-2-巨球蛋白基因表達巨球蛋白基因表達，與體外培養(yǎng)倍增次數(shù)線性關(guān)系良線性關(guān)系良好好，易檢出，易定量易檢出，易定量是一項很好的衰老生物學標志，并有望用于檢測整體水平或組織細胞的衰老。 馬馬 宏等宏等（ma h , et al）exp gerontol 2004 31衰老細胞核出現(xiàn)“衰老相關(guān)衰老相關(guān)

20、異染色質(zhì)聚集位點異染色質(zhì)聚集位點”（senescence- associated heterochromatic foci，sahf） 染色質(zhì)在核中的分布，呈點狀聚集而非均一分布染色質(zhì)在核中的分布，呈點狀聚集而非均一分布 李 倩 等：sahf細胞衰老生物學新標志細胞衰老生物學新標志 。 生物化學與生物物理進展 2007,34:1123-1128. 32 1尋找影響細胞衰老的新基因?qū)ふ矣绊懠毎ダ系男禄?發(fā)現(xiàn)：延緩衰老的csig與rdl 證明：導入csig或rdl基因可延長細胞壽命。 2研究各種因素研究各種因素（如氧自由基）（如氧自由基）對衰老進程的影響對衰老進程的影響 3用于研究已知基因?qū)?/p>

21、胞衰老的影響用于研究已知基因?qū)毎ダ系挠绊?發(fā)現(xiàn)：已知基因tom1可加速衰老，抑制可延長細胞壽命 證明：基因?qū)肟捎绊懠毎ダ希杉铀?，也可延緩?4檢驗藥物抗衰作用，為中藥現(xiàn)代化提供技術(shù)支撐檢驗藥物抗衰作用，為中藥現(xiàn)代化提供技術(shù)支撐 細胞衰老指征細胞衰老指征的的應用應用 33 為驗證我室建立的衰老指標評價體系，評估抗衰為驗證我室建立的衰老指標評價體系，評估抗衰新藥，我們研究了黃芪新藥，我們研究了黃芪堿堿hdtic的抗衰作用。的抗衰作用。 檢驗藥物抗衰作用，為中藥現(xiàn)代化提供技術(shù)支撐檢驗藥物抗衰作用，為中藥現(xiàn)代化提供技術(shù)支撐能否確定被試物的 延衰作用？能否比較被試物延衰作用的細微差別？34黃芪

22、堿黃芪堿 同分異構(gòu)體 以公認有延緩衰老作用的以公認有延緩衰老作用的肌肽肌肽（carnosine）為）為陽性對照，以上述生物學指征進行定量比較。陽性對照，以上述生物學指征進行定量比較。 成果應用成果應用結(jié)構(gòu)差異（黃芪堿黃芪堿1）（黃芪堿黃芪堿2）（a）hdtic-1， (b)hdtic-235黃芪堿黃芪堿的抗衰效應強于肌肽（的抗衰效應強于肌肽（carnosinecarnosine） 黃芪堿（黃芪堿（hdtic）可）可延長細胞壽命延長細胞壽命20代（代（ cpds）成果應用成果應用（黃芪堿黃芪堿1）（黃芪堿黃芪堿2）36 黃芪堿黃芪堿可減慢端可減慢端粒粒（kb數(shù)）縮短速度縮短速度2828代代555

23、5代代對照對照8.93 0.547.01 0.430.1m黃芪堿黃芪堿1 18.93 0.548.08 0.49成果應用成果應用37陽性陽性(綠色綠色)率率隨代齡的增加而增加隨代齡的增加而增加黃芪堿黃芪堿可降低衰老相關(guān)可降低衰老相關(guān)半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性（ 28代代）（ 55代）代）1.0m黃芪堿黃芪堿-2 （ 56代）代）成果應用成果應用0.1m黃芪堿黃芪堿-1 （ 58代）代）38 dna損傷修復能力損傷修復能力 隨增齡下降隨增齡下降修復良好修復不良黃芪堿黃芪堿可提高可提高dna損傷修復能力損傷修復能力 成果應用成果應用衰衰 尾長尾長(m) 面積面積/總面積總面積(%) 對照對照 1

24、22.426.21 92.123.25 0.1m黃芪堿黃芪堿-1 80.575.44 70.827.51 1.0m黃芪堿黃芪堿-2 81.839.37 73.146.34 尾越長，尾越長，%越高，越高，損傷越重損傷越重39黃芪堿黃芪堿的抗衰效應強于肌肽（的抗衰效應強于肌肽（carnosinecarnosine）黃芪堿黃芪堿1的抗衰效應強于的抗衰效應強于黃芪堿黃芪堿2黃芪堿黃芪堿（hdtic）可）可減少晚期糖基化終末產(chǎn)物（減少晚期糖基化終末產(chǎn)物（ ages）（代齡代齡）（黃芪堿黃芪堿1）（黃芪堿黃芪堿2） 王培昌王培昌等 （ wang pc , et al）mech age dev 2003 c

25、hin med j 2008 dna cell biol 2010 成果應用成果應用40人類人類細胞衰老相關(guān)基因細胞衰老相關(guān)基因的的研究研究 41細胞衰老基因通路細胞衰老基因通路 rb p21cip1 p27kip1 p16ink4a p53 pten細細 胞胞 衰衰 老老42 人類細胞衰老相關(guān)基因研究人類細胞衰老相關(guān)基因研究p16ink4a43kiyone 等等(1998）認為：認為： p16活性活性與與端粒長度是決定人類細胞復制性衰老的關(guān)鍵。端粒長度是決定人類細胞復制性衰老的關(guān)鍵。 p16為何能影響細胞衰老？為何能影響細胞衰老？ 我研究室工作：p16是如何影響端粒長度與衰老進程的？是如何影

26、響端粒長度與衰老進程的？ 是否影響了端粒酶的活性？是否影響了端粒酶的活性？抑制p16表達，可使可使 細胞壽命細胞壽命 （60余代余代 80余代）余代） 端?？s短減慢端?？s短減慢 結(jié)論： 基因干預可影響細胞衰老進程基因干預可影響細胞衰老進程44端端粒粒平平均均長長度度 (kb)年年輕輕 8.34抑抑制制 8.18增增強強 7.12衰衰老老 6.78抑制抑制 p16，端?？s短端粒縮短減慢減慢增強增強 p16，端?？s短端?？s短加快加快是否影響了端粒酶的活性？是否影響了端粒酶的活性？45抑制抑制 p p1616，并未活化，并未活化端粒酶端粒酶46抑制抑制 p16 ，dna修復能力增強修復能力增強抑制抑

27、制 p16 ，dna修復能力增強修復能力增強47 抑制抑制p16，延緩細胞衰老的可能機制，延緩細胞衰老的可能機制 減少減少 細胞周期細胞周期 蛋白激酶蛋白激酶( (cdk4）活性高）活性高 被磷酸化，失去活性被磷酸化，失去活性 轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子e2f活性高活性高多種多種生命必需基因能表達生命必需基因能表達 維持維持細胞細胞增殖速度增殖速度, ,維持維持dnadna損傷修復能力損傷修復能力 端?？s短較慢端?？s短較慢, ,延緩細胞衰老延緩細胞衰老（需證明rb是否磷酸化?。?8段建明等段建明等（ duan jm, et al.） ， j. biol. chem. 2001western blot抑制

28、抑制 p16 年輕年輕 對照對照 中年中年 衰老衰老49p16 影響細胞衰老機制影響細胞衰老機制 抑制抑制p16表達表達 cdk4活性活性 rbrb蛋白（磷酸化蛋白（磷酸化 ）活性活性 e2f活性保持活性保持多種多種生命必需基因表達生命必需基因表達 dna修復能力維持修復能力維持端?？s短較慢端粒縮短較慢（與端粒酶活性無關(guān)與端粒酶活性無關(guān)） 延緩衰老延緩衰老，細胞壽命細胞壽命 增強增強p16基因表達基因表達 rb 保持活力，保持活力，dna修復能力修復能力 端?？s短加快端粒縮短加快,衰老衰老 ，細胞壽命細胞壽命50結(jié)論：結(jié)論：p p16基因基因是細胞衰老遺傳控制是細胞衰老遺傳控制程序中的主要環(huán)節(jié)

29、程序中的主要環(huán)節(jié), , 可影響可影響dnadna損傷修復能力與損傷修復能力與端粒長度端粒長度 。它調(diào)節(jié)。它調(diào)節(jié)rbrb蛋白的活性而起作蛋白的活性而起作用。用。 （-2-巨球蛋白基因無此作用巨球蛋白基因無此作用）51薛麗香等薛麗香等 （ xue lx, et al.） febs lett 2004, 564 :199-204 p16高表達高表達 (細胞衰老細胞衰老)細胞衰老相關(guān)基因細胞衰老相關(guān)基因p2152入選“2002年中國十大科技進展”53cawthon r.m等（2003）端粒長短與人的壽命有關(guān)端粒長短與人的壽命有關(guān)，發(fā)現(xiàn)血細胞端粒短的人壽命短。心臟病心臟病病死率是端粒長的人3.18倍，傳

30、染病傳染病病死率是端粒長的人8.54倍。nakashima h等（2004）發(fā)現(xiàn)：人血白細胞端粒長度端粒長度與心血管內(nèi)皮損傷，動脈粥樣硬化動脈粥樣硬化的關(guān)系密切。demerath ew等（2004）報道：端粒短與老年糖尿病糖尿病，創(chuàng)傷愈創(chuàng)傷愈合合慢，免疫免疫功能下降，易生腫瘤腫瘤有關(guān)。端粒長度與老年病易感性有關(guān)？端粒長度與老年病易感性有關(guān)？細胞衰老細胞衰老不能替代整體衰老，但與整體衰老有關(guān)，與老與整體衰老有關(guān)，與老年常見多發(fā)病有關(guān)。年常見多發(fā)病有關(guān)。細胞衰老細胞衰老與與整體衰老整體衰老有關(guān)有關(guān)54老年人群的老年人群的p16基因多態(tài)性與體能（基因多態(tài)性與體能（physical function）

31、顯著相關(guān)。顯著相關(guān)。 melzer, d; frayling, tm; murray, a, et al. （英、意、美）a common variant of the p16(ink4a) genetic region is associated with physical function in older people mech ageing dev 128（5-6）: 370-377，2007 938 (aged 65-80 years)例英國老人，rs2811712 snp minor allele (located between the shared p16(ink4a)/arf

32、 locus and p15(ink4b) was associated with reduced physical impairment. first direct evidence ： p16 (ink4a)/arf/p15(ink4b) genetic region and senescence machinery are active in physical ageing in heterogeneous human populations. 55p16在細胞衰老時表達在細胞衰老時表達 ，如成纖維細胞、角質(zhì)細胞、上皮細胞、t淋巴細胞、內(nèi)皮細胞、黑色素細胞,甚至可高于年輕時10倍以上。

33、p16表達變化與整體衰老表達變化與整體衰老相關(guān)。人體衰老時它的表達在皮膚中人體衰老時它的表達在皮膚中隨增齡持續(xù)增強，隨增齡持續(xù)增強，維氏綜合征病人的皮膚維氏綜合征病人的皮膚成纖維細胞p16ink4a高于常人（davis t, 2004 ）ressler s, et al. p16(ink4a) is a robust in vivo biomarker of cellular aging in human skin. aging cell 5 (5): 379-389，200656 p16ink4a表達表達 是老年人造血功能是老年人造血功能 的重要原因的重要原因干細胞衰老影響組織的維持與修復。

34、干細胞衰老影響組織的維持與修復。老年人的骨髓對細胞毒耐受性差，易衰竭老年人的骨髓對細胞毒耐受性差，易衰竭。研究表明：研究表明：老年鼠造血干細胞更新能力老年鼠造血干細胞更新能力 ，分化時間長，易凋亡。，分化時間長，易凋亡。敲除p16/p19，衰老的上述不利影響減輕，有利于組織在衰老時的損傷修復。janzen v, et al.（ harvard univ ）stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16ink4a nature. 443 (7110): 421-426，200657 干細胞衰老與干細胞衰

35、老與p16表達增強密切相關(guān)表達增強密切相關(guān)年輕小鼠敲除p16后對其造血干細胞功能（免疫表型，歸巢能力，增殖能力，自我更新能力）無影響，老年小鼠敲除老年小鼠敲除p16造造血干細胞功能血干細胞功能 顯著顯著（優(yōu)于同齡鼠）（優(yōu)于同齡鼠）。janzen, v; forkert, r; fleming, he, et al. stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16(ink4a) nature 443（7110）: 421-426，200658胰島再生能力與胰島再生能力與p16ink4a表達水平有關(guān)表達水

36、平有關(guān)小鼠實驗小鼠實驗：衰老 胰島p16表達 （其他細胞周期抑制物無此現(xiàn)象 ）p16轉(zhuǎn)基因鼠 衰老快，胰島細胞增殖能力 毒物 胰島 愈老、生存率愈低愈老、生存率愈低 毒素作用后，胰島不可再生毒素作用后，胰島不可再生 p16表達; 生存率與年齡無關(guān)生存率與年齡無關(guān) 毒素作用后，胰島可再生毒素作用后，胰島可再生結(jié)論結(jié)論p16表達表達 老年鼠老年鼠 胰島增殖和再生能力胰島增殖和再生能力重要原因重要原因 p16(ink4a) induces an age-dependent decline in islet regenerative potential nature 443 : 453-457, 20

37、06 univ north carolina,harvard medical school 59骨關(guān)節(jié)炎(老年病)軟骨細胞p16表達p16特異sirna轉(zhuǎn)染導致的p16基因沉默可有效抑制關(guān)節(jié)軟骨細胞衰老，恢復其功能，增強軟骨細胞dna合成與膠原蛋白合成能力。 （ zhou hw, et al. rheumatology.2004, 43: 555-）p16不僅與細胞衰老有關(guān)，與整體衰老亦有關(guān)。不僅與細胞衰老有關(guān)，與整體衰老亦有關(guān)。60 p16表達調(diào)控研究表達調(diào)控研究61綠色熒光蛋白量與其熒光強度成正比綠色熒光蛋白量綠色熒光蛋白量與其熒光強度成與其熒光強度成正比正比-280-622區(qū)段青，老差別

38、的變化最大區(qū)段青，老差別的變化最大不同長度 p16調(diào)控區(qū) 的 啟動活性分析 62d d n n a a 上上 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄 因因 子子 結(jié)結(jié) 合合 位位 置置 的的 確確 定定(f o o t p r in t in g )np(g)0 80 120 80 120 c y 0 g+adnase i footprinting of the region from 622 to 288 of the p16 promoter. the fragment was 3 end labeled (coding strand) and incubated with nuclear extracts of y

39、oung and senescent cells. aliquots of the probes were chemically treated as for maxam-gilbert sequencing of g+a residues to give markers. a, b and c indicated three dnase i protection regionsabcp16p16基因翻譯起基因翻譯起始信號始信號atgatg以遠以遠上游上游 -491 -491 -485 bp -485 bp 處存在處存在我們稱為我們稱為itse (ink4a transcription sil

40、ence element,p16,p16轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄沉寂元件錄沉寂元件) )的的負調(diào)控元件。負調(diào)控元件。63結(jié)果：人結(jié)果：人2bs2bs細胞細胞p16p16基因上游存在一個由基因上游存在一個由gaaggtgaaggt構(gòu)成的負調(diào)控元構(gòu)成的負調(diào)控元件件itse，且發(fā)現(xiàn)，且發(fā)現(xiàn)年輕細胞有年輕細胞有24kda蛋白與負調(diào)控元件蛋白與負調(diào)控元件結(jié)合結(jié)合，抑制，抑制p16p16表達表達，衰老細胞缺乏此蛋白質(zhì)。衰老細胞缺乏此蛋白質(zhì)。 用缺失突變刪除該元件，能否使用缺失突變刪除該元件，能否使p16表達增強？表達增強？- -6 63 30 0c ct tt ta ag gt tc cg gt ta a c ca ag

41、gg gt tg ga at tt tt t c cg ga at tt tt tc ct tc cg g g gt tg gg gg gg gc ct tc ct t c ca ac ca aa ac ct ta ag gg g- -5 58 80 0 a aa aa ag ga aa at ta ag gt t t tt tt tg gc ct tt tt tt tt t c ct tt ta at tg ga at tt ta a a aa aa ag ga aa ag ga aa ag g c cc ca at ta ac ct tt tt tc c - -5 53 30 0 c cc

42、 ct ta at tg ga ac ca ac c c ca aa aa ac ca ac cc cc cc c g ga at tt tc ca aa at tt tt t g gg gc ca ag gt tt ta ag gg g a aa ag gg gt tt tg gt ta at t- -4 48 80 0 c cg gc cg gg ga ag gg ga aa a g gg ga aa aa ac cg gg gg gg g c cg gg gg gg gg gc cg gg ga a t tt tt tc ct tt tt tt tt ta a a ac ca ag ga

43、 ag gt tg ga aa a - -4 43 30 0 c cg gc ca ac ct tc ca aa aa a c ca ac cg gc cc ct tt tt tg g c ct tg gg gc ca ag gg gc cg g g gg gg gg ga ag gc cg gc cg g g gc ct tg gg gg ga ag gc ca a - -3 38 80 0 g gg gg ga ag gg gc cc cg gg g a ag gg gg gc cg gg gt tg gt t g gg gg gg gg gg gc ca ag gg g t tg gg

44、gg gg ga ag gg ga ag g c cc cc ca ag gt tc cc ct tc c- -3 33 30 0 c ct tt tc cc ct tt tg gc cc c a aa ac cg gc ct tg gg gc ct t c ct tg gg gc cg ga ag gg gg g c ct tg gc ct tt tc cc cg gg g c ct tg gg gt tg gc cc cc cc c- -2 28 80 0 c cg gg gg gg gg ga ag ga ac c c cc ca aa ac cc ct tg gg gg g g gc

45、cg ga ac ct tt tc ca ag g g gg gg gt tg gc cc ca ac ca a t tt tc cg gc ct ta aa ag gt t - -2 23 30 0 g gc ct tc cg gg ga ag gt tt t a aa at ta ag gc ca ac cc ct t c cc ct tc cc cg ga ag gc ca a c ct tc cg gc ct tc ca ac ca a g gc cg gt tc cc cc cc ct tt t - -1 18 80 0 g gc cc ct tg gg ga aa aa ag g

46、a at ta ac cc cg gc cg gg gt t c cc cc ct tc cc ca ag ga ag g g ga at tt tt tg ga ag gg gg g a ac ca ag gg gg gt tc cg gg g - -1 13 30 0 a ag gg gg gg gg gc ct tc ct t t tc cc cg gc cc ca ag gc ca a c cc cg gg ga ag gg ga aa ag g a aa aa ag ga ag gg ga ag gg g g gg gc ct tg gg gc ct tg gg g -8 80 0

47、t tc ca ac cc ca ag ga ag gg g g gt tg gg gg gg gc cg gg ga a c cc cg ga ag gt tg gc cg gc c t tc cg gg gc cg gg gc ct tg g c cg gg ga ag ga ag gg gg gg g- -3 30 0 t ta ag ga ag gc ca ag gg gc c a ag gc cg gg gg gc cg gg gc c g gg gg gg ga ag gc ca ag gc c a at tg g rsaismai5-oligo3-oligothe partial

48、 sequence of p16ink4apromoter y o14.4kda20.1kda30.0kda43.0kda67.0kda94.0kdasouthwestern blotting of the region from 622 to 288 of the p16 promoter. end-labeled probe was hybridized with nuclear extracts of young and senescent 2bs cells, which were separated by sds-page electrophoresis and transfered

49、to nitrocellulose membrane. a 24kda binding protein was observed only in young cells and 15.5kda binding protein could be detected in both cells.64100100172.05172.0559.7559.750 05050100100150150200200relative seap activityrelative seap activitypseap-3mutpseap-5mutpseap-870定點缺失突變證明：定點缺失突變證明：itseitse是

50、負調(diào)控元件是負調(diào)控元件以分泌型堿性磷酸以分泌型堿性磷酸酶（酶（seap） 活性活性體現(xiàn)啟動活性體現(xiàn)啟動活性刪除前刪除前刪除后刪除后年輕細胞的年輕細胞的p16基因調(diào)控區(qū)在刪除基因調(diào)控區(qū)在刪除-522 -482后后啟動活性反而增高啟動活性反而增高 65發(fā)現(xiàn)序列為gaaggt的負調(diào)控元件，位于p16基因翻譯起始信號atg以遠上游-491-485bp處。發(fā)現(xiàn)p16的負轉(zhuǎn)錄因子（分子量約2.4萬）。汪維等汪維等（ wang w, et al.） ： j biol chem.2001, 276(52), 48655-48661 66負負 汪維等汪維等（ wang w, et al.） ： j biol c

51、hem.2001, 276：48655 鄭文婕等鄭文婕等（zheng wj , et al.）： j biol chem.2004,279 : 31524（間接間接負負調(diào)調(diào) id1） 吳軍峰等吳軍峰等（wu jf , et al.） ： plos one 2007, 2: e164 （直接直接正調(diào)正調(diào) sp1） 黃菁等黃菁等（huang j, et al.）： plos one 2008, 3: e1710. （間接間接負負調(diào)調(diào) sirt1） 甘起霓等甘起霓等（gan qn, et al.） ： j cell sci 2008,121:2235 （直接直接正調(diào)正調(diào) ppar ） 周瑞等周瑞等（

52、zhou r , et al.） ： nucleic acids res 2009, 37:5183 （間接間接負負調(diào)調(diào) lsh） 李紅凱等李紅凱等（li, hk, et al.）： oncogene 2010, jun 28網(wǎng)刊（直接直接正調(diào)正調(diào) hbp1） 黃昱等黃昱等（huang y,et al. ） ：cell mol life sci 2010, aug 25網(wǎng)刊（直接直接負負調(diào)調(diào) b-myb）67 影響影響mrna穩(wěn)定性穩(wěn)定性的的rna結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白 hur （直接負調(diào)直接負調(diào) ） auf1 （直接負調(diào)直接負調(diào) ） auf1與與hur與與p16的的mrna 非翻譯區(qū)結(jié)合結(jié)合,促降

53、解。促降解。 衰老時衰老時， p16的mrna穩(wěn)定性 。 王文恭等王文恭等（ wang wg, et al.） embo reports 2005 ,6:1 常娜等常娜等（ chang n, et al.） mol cell biol 2010 , 30:3875mir-24可抑制可抑制p16翻譯翻譯（lal a, et al ）plos one 2008,3: e1864 （直接負調(diào)直接負調(diào)） 68細胞衰老相關(guān)新基因的研究細胞衰老相關(guān)新基因的研究 69tom1是一種溶酶體相關(guān)基因，在細胞衰老時高表達是一種溶酶體相關(guān)基因，在細胞衰老時高表達 。首次揭示：首次揭示：tom1tom1基因與細胞衰老

54、相關(guān)。基因與細胞衰老相關(guān)。促進促進tom1表達可加速衰老，表達可加速衰老，引起引起p16及及p21表達表達。如抑制之，結(jié)果相反。如抑制之，結(jié)果相反。 加速衰老的加速衰老的tom1 (target of myb)郭淑貞郭淑貞等等（ guo sz et al.） exp cell res 2004,298:465-47270rdl基因基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有延緩衰老作用具有延緩衰老作用 發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)分子中存在著發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)分子中存在著“衰老相關(guān)結(jié)構(gòu)域衰老相關(guān)結(jié)構(gòu)域”這種作用可能是通過這種作用可能是通過抑制抑制細胞衰老主導基因細胞衰老主導基因 p16的表達而實現(xiàn)的表達而實現(xiàn)延緩衰老的延緩衰老

55、的rdl（replicative senescence down-regulated leo1-like）趙亮等趙亮等（ zhao l, et al.） faseb j 2005,19: 521-532 71csig蛋白定位于核仁；蛋白定位于核仁；在組織中廣泛表達，在組織中廣泛表達，心臟、骨骼肌、胎盤中表達較高；心臟、骨骼肌、胎盤中表達較高；隨細胞增齡表達下降；隨細胞增齡表達下降；具有延緩細胞衰老的作用。具有延緩細胞衰老的作用。 csig通過抑制通過抑制pten的合成，延緩衰老。的合成，延緩衰老。 馬利偉等馬利偉等 （ ma lw, et al.） mol cell biol 2008，28:

56、 6290-6301 延緩衰老的延緩衰老的csig (cellular senescence-inhibited gene) 72整體衰老與細胞衰老分子整體衰老與細胞衰老分子連接點的研究連接點的研究 73酵母中發(fā)現(xiàn)的“ 長壽基因長壽基因” sir （silencing information regulator） 該基因產(chǎn)物sir2（依賴依賴nad+去乙酰化酶去乙?；?）具有延壽作用具有延壽作用 維持染色體穩(wěn)定性維持染色體穩(wěn)定性提高提高dna修復能力修復能力阻止染色體外環(huán)形阻止染色體外環(huán)形dna形成形成7475人類人類sir同源基因同源基因該家族有7個成員，包括sirt（silent mat

57、ing type information regulation 2 homolog）1-7。其中sirt1具有酵母sir2的相似功能耗氧量耗氧量 調(diào)節(jié)脂代謝調(diào)節(jié)脂代謝氧化、放射損傷耐受性氧化、放射損傷耐受性 對人類是否也有延壽作用？對人類是否也有延壽作用？76sirt1可延緩細胞衰老進程可延緩細胞衰老進程sirt1或或resveratrol處理處理 p16、p27表達表達 rb磷酸化磷酸化 細胞衰老細胞衰老 sirt1表達表達 （翻譯（翻譯 ） ppar 細胞衰老細胞衰老 ppar 表達表達 細胞衰老細胞衰老 sirt1 ppar 表達表達 細胞衰老細胞衰老 人二倍體成纖維細胞研究人二倍體成纖

58、維細胞研究甘起霓等甘起霓等（gan qn , et al.） j cell sci 2008, 28: 6290-6301. 黃菁等黃菁等（huang j, et al. ） plos one 2008, 3(3): e1710.77cr（熱量限制）（熱量限制）sirt1huang j, et al. plos one 2008ppar senescence gan qn , et al. j cell sci 2008p16 ink4 熱量限制熱量限制延緩衰老延緩衰老的的分子機理分子機理young +- + 促表達- - 抑表達-han, lm, et al. nucleic acids r

59、es 2010 78結(jié)語結(jié)語衰老并非單一基因決定，而是一連串基因激活和阻抑及其通衰老并非單一基因決定，而是一連串基因激活和阻抑及其通過各自產(chǎn)物相互作用的結(jié)果，環(huán)境損傷因素可影響遺傳控制過各自產(chǎn)物相互作用的結(jié)果，環(huán)境損傷因素可影響遺傳控制體系，加速衰老。體系，加速衰老。對衰老進程起作用的基因，多數(shù)是日常生命活動有關(guān)基因?qū)λダ线M程起作用的基因，多數(shù)是日常生命活動有關(guān)基因。（解旋酶 、核纖層蛋白a 、p16、p21、p53、 klotho 、 daf 、clk ） 可對衰老進程起作用的基因未必在細胞正常衰老進程起作用?？蓪λダ线M程起作用的基因未必在細胞正常衰老進程起作用。 （如端粒酶基因、p53 ）

60、衰老時高表達的基因未必是對衰老進程起作用的基因。衰老時高表達的基因未必是對衰老進程起作用的基因。（2m ） 在體外通過基因重組在體外通過基因重組“長壽基因長壽基因”與與“衰老基因衰老基因”是可以相是可以相互轉(zhuǎn)變的?；マD(zhuǎn)變的。79展望展望 如何將從模式生物發(fā)現(xiàn)的衰老相關(guān)基因如何將從模式生物發(fā)現(xiàn)的衰老相關(guān)基因 與人類衰老相聯(lián)系？與人類衰老相聯(lián)系？ 如何將早老癥相關(guān)基因與正常衰老相聯(lián)如何將早老癥相關(guān)基因與正常衰老相聯(lián) 系？系？ 如何將細胞衰老相關(guān)基因與整體衰老相如何將細胞衰老相關(guān)基因與整體衰老相 聯(lián)系？聯(lián)系？ 機理研究機理研究 衰老相關(guān)基因絕非一種，探索衰老相關(guān)新基因衰老相關(guān)基因絕非一種，探索衰老相