熒光顯微技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用

1、圖21 BNPTU的合成過程以及與汞離子反應(yīng)以后結(jié)構(gòu)的變化。23汞離子熒光探針BNPTU (3)用氮烯丙基取代原來的氮丁基，使得BNPTU比原來的熒光探針具有更好的溶解度。BNPTU在乙腈中的溶解度是9x10-4 M，在水和乙腈的混合溶液(vv=l9)中的溶解度是510-5M，而原來化合物的溶解度只有現(xiàn)在的10。同時，BNPTU在水中的溶解速度也大大的得到了提高，使得它更適用于生物環(huán)境中的應(yīng)用。 (4)靈敏度比其他同類探針有大大提高，可以探測到ppb的水平。 (5)具有很高的離子選擇性。 (6)具有很小的生物毒性。 在本文中，為了書寫方便，將BNPTU定義為l，當(dāng)它與汞離子發(fā)生反應(yīng)后，其結(jié)構(gòu)我

2、們把它定義為2。我們將在下面章節(jié)中詳細(xì)討論l和2的一些特性以及他們在生物細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)用。 通過激光掃描共焦顯微鏡，我們首先觀察吞噬了1和Hg2+的細(xì)胞的熒光圖像。因為1和2的熒光光譜峰值分別在550 nm和495nm附近，所以我們選用505550nm的濾色片來濾去激發(fā)光和680nm左右的葉綠素的熒光。通過光譜分析(見圖33)可知，細(xì)胞內(nèi)的熒光分布主要是2產(chǎn)生的(可能含有少量未反應(yīng)的1)，2在細(xì)胞內(nèi)的三維分布如圖32(A)所示，其中主圖展示的是細(xì)胞內(nèi)X-Y平面的熒光分布，主圖右側(cè)和下面顯示的則是X-Z與Y-Z的剖面圖。我們可以看到2在細(xì)胞中的分布是比較均勻的。同時我們測量了細(xì)胞的DIC (diff

3、erential interference contrast)圖像，來觀察其形態(tài)圖32(C)則是(A)和(B)的合并。通過觀察熒光像可以確實證明細(xì)胞吞噬了探針和Hg2+。我們同時觀察了用來做對比的只吞噬了1的細(xì)胞，得到了相似的熒光像。圖32(A)細(xì)胞內(nèi)2的熒光圖像。主要的那副圖像展示的是細(xì)胞內(nèi)XY平面的分布，右側(cè)和下面的則是XZ與Y的剖面 (B)DIC圖像 (c)圖像A和B的合并33單光子激發(fā)和雙光子激發(fā)的比較。 研究可知，l和2的雙光子吸收截面分別為41士04和134士18，而riboflavin和FAD的雙光子吸收截面分別為123和0035，探針的雙光子吸收截面遠(yuǎn)大于細(xì)胞內(nèi)主要熒光物質(zhì)黃素

4、的雙光子吸收截面。因此，使用雙光子激發(fā)，必定可以得到更好的信噪比，從而來提高探測的靈敏度。為此我們將探針的單光子、雙光子光譜和細(xì)胞自體熒光的光譜進(jìn)行了對比，我們通過前面得到的細(xì)胞熒光像。選擇某一微區(qū)測量得到的熒光光譜如圖33所示。其中。曲線1表示未經(jīng)汞離子孵化的細(xì)胞中的1的光譜，曲線2表示用汞離子孵化后的細(xì)胞中的2的光譜，曲線3為細(xì)胞的自體熒光光譜。圖33細(xì)胞中探針的單光子激發(fā)(A)和雙光子激發(fā)(B)的熒光光譜。其中曲線1表示1(110-7M)孵化的細(xì)胞中的探針熒光光譜，曲線2表示用1(110-7M)和Hg2+(210-6M)孵化的細(xì)胞中的探針熒光光譜，曲線3是細(xì)胞的自體熒光光譜。 我們可以從

5、圖33(A)中看到，1和2發(fā)出的熒光只比其自體熒光大5倍左右。也就是說，如果我們繼續(xù)降低1或者在細(xì)胞內(nèi)的濃度，那么它所發(fā)出的熒光就會被生物體的自體熒光所干擾，這就是單光子激發(fā)所帶來的局限性。反觀雙光子熒光(圖33(B)，對于只吞噬了l(1x10-7 M)的細(xì)胞，其熒光光譜的峰值在538士3 nm；而同時吞噬了1(1x10-7M)和Hg2+(2x10-6M)的細(xì)胞，其熒光光譜的峰值在503士2 nm。兩者的熒光會有大約35m的藍(lán)移，與單光子激發(fā)類似。但是，從圖中可以很清晰的看到，雙光子激發(fā)的探針熒光比自體熒光大15倍左右。也就是說,如果用雙光子激發(fā)可以大大提高信噪比，對探測生物體中的汞是非常有利

6、的。 因此可見，如果探針具有較大的雙光子吸收截面，那么它將會在復(fù)雜的生物環(huán)境中有著更廣闊的應(yīng)用。 34結(jié)論 我們首次成功地將一種新的汞離子探針BNPTU，運(yùn)用于對活體細(xì)胞中微量汞離子的檢測。在檢測汞離子的時候，BNPTU顯示的是光譜變化，這可以在很大程度上避免由于復(fù)雜的生物環(huán)境帶來的濃度分布不均勻所產(chǎn)生的測量上的影響。同時它具有很高的雙光子吸收截面，雙光子激發(fā)對于生物探測有很多優(yōu)越性，能夠屏蔽很多其他物質(zhì)的干擾，具有較大的穿透深度和較小的細(xì)胞傷害等。這個探針還有很好的溶解度和溶解速度。使得其更適用于生物環(huán)境中的應(yīng)用。 因為我們需要培育細(xì)胞進(jìn)行汞離子的吞噬。所以取適量裸藻細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，在室溫下

7、離心3 min(2000 rmin)，洗滌3次去除培養(yǎng)物質(zhì)。令純凈的細(xì)胞沉降物與適量去離子水混合，然后再注入事先設(shè)計好濃(CH3CO2)Hg溶液。將樣品放在先前的培養(yǎng)環(huán)境下,讓細(xì)胞吞噬汞離子24小時。另外取一批干凈的細(xì)胞同時培養(yǎng)，以作對比。 將裸藻細(xì)胞和含有(CH3CO2)Hg的懸浮液，在室溫下離心3 min(2000 rmin)，用PBS洗滌3次來去除溶液中的雜質(zhì)和殘余的汞離子。然后再將洗好的吞噬了汞離子的細(xì)胞和作對比的細(xì)胞分別放在預(yù)先設(shè)計好濃度的BNPTU的溶液中在室溫下培育05小時。最終離心3 min(2000 rmin)，用PBS洗滌3次來去除溶液中BNPTU。這樣，細(xì)胞就可以用來做熒光成像和光譜分析的測試了。 我們的最終目標(biāo)就是利用熒光探針來探測生物細(xì)胞中的微量汞離子。因此探針的低毒性顯得尤為重要。通過顯微鏡觀察，吞噬了BNPTU的裸藻細(xì)胞三天后仍然沒有顯示出任何形態(tài)