溴麝香草酚藍比色法測定葉下珠生物堿的含量

1、溴麝香草酚藍比色法測定葉下珠生物堿的含量作者：鄧光輝 胡煒 劉榕城 張桂華 農(nóng)林【摘要】目的測定葉下珠中總生物堿的含量。方法以溴麝香草酚藍為顯色劑于415 nm波長處測定吸光度。結果苦參堿在0.0040.02 mgml范圍內(nèi)線性關系良好（r=0.997 54）；其與溴麝香草酚藍所形成的離子對產(chǎn)物在6 h內(nèi)穩(wěn)定；平均加樣回收率為98.65(RSD=1.98)。結論該方法簡單、快速、準確，可用于生藥及產(chǎn)品的生物堿質(zhì)量控制。 【關鍵詞】溴麝香草酚藍 比色法 葉下珠 生物堿葉下珠(別名珍珠草)為大戟科葉下珠屬中的一種草本植物，具有清肝明目、解毒消腫的功效，常用于 治療 腹瀉下痢、尿路感染、小兒疳積、肝

2、炎、腎炎等疾病，其化學成分主要有生物堿和黃酮兩大類。生物堿是存在于生物體內(nèi)的含氮有機化合物，大多數(shù)存在于植物中，目前已分離到三千余種，其中近百種具有很強的生理活性1。 現(xiàn)代 藥理研究表明，生物堿具有抗腫瘤、抗炎、抗心律失常等方面的作用2,3 ,其在醫(yī)藥和農(nóng)藥方面的應用已引起人們的廣泛關注。對天然生物堿的生物活性、提取、精制、鑒定方法等方面的研究多見報道4。目前總生物堿的含量測定有重量法、酸堿滴定法、分光光度法?？紤]到生物堿的結構，本文采用酸性染料比色法，以苦參堿為對照品，對不同產(chǎn)地來源的葉下珠中的總生物堿進行了含量測定，建立了葉下珠中總生物堿含量的測定方法。 1 材料與儀器JP600型變輻桿式

3、超聲波萃取器（武漢嘉鵬 電子 有限公司）；916型紫外-可見分光光度計（澳大利亞GBC公司），分析天平（上海第三分析儀器廠），酸度計，苦參堿 ( 中國 藥品生物制品檢定所)，溴麝香草酚藍和其余試劑均為分析純。葉下珠，購自廣西、云南、廣東。 2 方法 2.1 儲備溶液的配置精確稱取苦參堿標準品10 mg，用95乙醇溶解后定容于50 ml的容量瓶，搖勻，備用。2.2 對照品溶液的配置移取“2.1”項下儲備溶液5.00 ml于50 ml容量瓶，定容，搖勻，備用。2.3 樣品溶液的制備取葉下珠粉碎成粗粉，精確稱取5 g，加入0.5%的乙酸溶液200 ml，浸泡24 h，超聲波提取30 min過濾，往濾

4、液中加入氫氧化鈉溶液至中性，過濾。沉淀用95乙醇溶解后定容于50 ml容量瓶中，備用。 3 結果 3.1 條件的優(yōu)選3.1.1 最大吸收波長的確定移取對照品溶液2.00 ml，置于125 ml的分液漏斗中，加入pH=7.5的磷酸鹽緩沖液5.00 ml，加入0.025%的溴麝香草酚藍1.00 ml，加入氯仿10.00 ml，振搖1 min，靜置30 min，分取氯仿層于具塞錐形瓶中，用無水氯化鈣干燥5 min，以5.00 ml蒸餾水加pH=7.5的磷酸鹽緩沖，加0.025%的麝香草酚藍，加氯仿的萃取溶液作為參比，在360550 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，結果顯示溶液在415 nm波長處有最大吸收。

5、3.1.2 pH值的確定移取對照品溶液2.00 ml，按照“3.1.1”項下方法分別加入pH為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的磷酸鹽緩沖液，結果顯示：當加入的磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀的濃度分別為0.008 mol/L和0.030 mol/L（pH=7.5）時，溶液的吸光度最大，所以實驗選擇pH為7.5的磷酸鹽緩沖溶液。3.1.3 溴麝香草酚藍用量的確定移取對照品溶液5.00 ml，按照“3.1.1”項下方法分別加入0.025%的麝香草酚藍1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml，結果顯示，當加入的麝香草酚藍體積為4.00 ml時，溶液吸光度最大，所以實驗選擇溴麝香草酚藍的用

6、量為4. 00 ml。3.2 標準曲線的繪制移取苦生堿對照品溶液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml，置于125 ml的分液漏斗中，加入二次蒸餾水至5.00 ml，加入pH=7.5的磷酸鹽緩沖液5.00 ml，加入0.05%的溴麝香草酚藍4.00 ml，加入氯仿10.00 ml，振搖1 min， 靜置30 min，分取氯仿層于具塞錐形瓶中，用無水氯化鈣干燥5 min，分別在415 nm波長處測定吸光度。以濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程A=-0.026 3+25.675C（r=0.997 54），苦參堿檢測濃度在0.0040.02 mg/ml

7、范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關系。3.3 穩(wěn)定性實驗移取對照品溶液2.00 ml，按“3.1.1”項下方法在415 nm波長處測定吸光度。并在室溫下每隔1 h測定1次吸光度，連續(xù)測定6次，結果表明，苦生堿與溴麝香草酚藍的顯色產(chǎn)物在6 h內(nèi)穩(wěn)定，其RSD=1.65。3.4 精密度實驗分別移取2.00 ml對照品溶液3份，按“3.1.1”方法在415 nm波長處測定吸光度，RSD=1.2。3.5 加樣回收實驗移取樣品溶液(廣西武鳴樣品)1.00 ml，按照“3.1.1”方法測定總生物堿的含量。在樣品溶液中加入3.00 ml的苦參堿對照品溶液后測定吸光度， 計算 總生物堿含量，進行加樣回收實驗。平行測

8、定3次。樣品溶液體積1.00 ml，生物堿平均含量0.059 07 mg，加入量0.060 00 mg，平均回收率98.65%，RSD=1.98%。3.6 總生物堿的測定將6種不同產(chǎn)地來源的葉下珠藥材粉，按照實驗方法測定總生物堿含量。結果見表1。表1 不同產(chǎn)地來源葉下珠中總生物堿含量測定結果（略） 4 結論由于葉下珠中生物堿成分易溶于酸性溶液，因此采用0.5醋酸作為提取液，結合超聲波提取方法，可以保證藥材中生物堿成分的完全提取。根據(jù)在一定pH介質(zhì)中，生物堿類與氫離子生成陽離子，酸性染料在此條件下解離成陰離子，兩者發(fā)生離子對反應，定量結合生成有色絡合物，該絡合物可被有機溶劑定量萃取的原理，本實驗用苦參堿作為標準物質(zhì)在pH=7.5的緩沖溶液中與溴麝香草酚藍定量顯色，從而求得葉下珠中總生物堿的含量。pH環(huán)境對顯色反應影響顯著。本實驗中使苦參堿與溴麝香草酚藍分別在pH為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的磷酸鹽緩沖液中反應后測定吸光度，結果表明，當在pH為7.5的磷酸鹽緩沖液中，顯色反應達到最佳?！?參考文獻 】 1 劉喜綱, 劉翠哲, 常金花. 應用酸性比色法測定總生物堿的含量J. 中國 藥房, 2007, 18(11): 875.2 李金陵, 程愛民, 荊宇紅，等. 重要苦參抗腫瘤作用的實驗研究J.中國腫瘤