等電聚焦電泳法測定蛋白質的等電點

1、等電聚焦電泳法測定蛋白質的等電點 實驗三 等電聚焦電泳法測定蛋白質的等電點一、實驗目的 了解等電聚焦的原理。通過蛋白質等電點的測定，掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直管式等電聚焦電泳技術。二、實驗原理 等電聚焦（Isoelectric focusing，簡稱IEF）是六十年代中期出現(xiàn)的新技術。近年來等電聚焦技術有了新的進展，已迅速發(fā)展成為一門成熟的近代生化實驗技術。目前等電聚焦技術已可以分辨等電點（pI）只差0.001pH單位的生物分子。由于其分辨力高，重復性好，樣品容量大，操作簡便迅速，在生物化學、分子生物學及臨床醫(yī)學研究中得到廣泛的應用。 蛋白質分子是典型的兩性電解質分子。它在大于其等電點的pH環(huán)境中

2、解離成帶負電荷的陰離子，向電場的正極泳動，在小于其等電點的pH環(huán)境中解離成帶正由荷的陽離子，向電場的負極泳動。這種泳動只有在等于其等電點的pH環(huán)境中，即蛋白質所帶的凈電荷為零時才能停止。如果在一個有pH梯度的環(huán)境中，對各種不同等電點的蛋白質混合樣品進行電泳，則在電場作用下，不管這些蛋白質分子的原始分布如何，各種蛋白質分子將按照它們各自的等電點大小在pH梯度中相對應的位置處進行聚焦，經(jīng)過一定時間的電泳以后，不同等電點的蛋白質分子便分別聚焦于不同的位置 。這種按等電點的大小，生物分子在pH梯度的某一相應位置上進行聚焦的行為就稱為“等電聚焦”。等電聚焦的特點就在于它利用了一種稱為兩性電解質載體的物質

3、在電場中構成連續(xù)的pH梯度，使蛋白質或其他具有兩性電解質性質的樣品進行聚焦，從而達到分離、測定和鑒定的目的。 兩性電解質載體，實際上是許多異構和同系物的混合物，它們是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在3001000之間。常用的進口兩性電解質為瑞典Pharmacia-LKB公司生產(chǎn)的Ampholine 和Pharmalyte，價格昂貴。國產(chǎn)的有中國軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所和上海生化所生產(chǎn)的兩性電解質，價格便宜，質量尚佳。兩性電解質在直流電場的作用下，能形成一個從正極到負極的pH值逐漸升高的平滑連續(xù)的pH梯度。若不同的pH值的兩性電解質的含量與pI值的分布越均勻，則pH梯度的線性就越好。

4、對Ampholine兩性電解質的要求是緩沖能力強，有良好的導電性，分子量要小，不干擾被分析的樣品等。 在聚焦過程中和聚焦結束取消了外加電場后，如保持pH梯度的穩(wěn)定是極為重要的。為了防止擴散，穩(wěn)定pH梯度，就必須加入一種抗對流和擴散的支持介質，最常用的這種支持介質就是聚丙烯酰胺凝膠。當進行聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳時，凝膠柱內即產(chǎn)生pH梯度，當?shù)鞍踪|樣品電泳到凝膠柱內某一部位，而此部位的pH值正好等于該蛋白質的等電點時，該蛋白質即聚焦形成一條區(qū)帶，只要測出此區(qū)帶所處部位的pH值，即為其等電點。電泳時間越長，蛋白質聚焦的區(qū)帶就越集中，越狹窄，因而提高了分辨率。這是等電聚焦的一大優(yōu)點，不像一般的其他

5、電泳，電泳時間過長則區(qū)帶擴散。所以等電聚焦電泳法不僅可以測定等電點，而且能將不同等電點的混合的生物大分子進行分離和鑒定。 早期的等電聚焦電泳是垂直管式的，其特點是體系是封閉的，不與空氣接觸，可防止樣品氧化。近年來，又發(fā)展了超薄層水平板式等電聚焦電泳。此法的優(yōu)點是加樣數(shù)量多，節(jié)省兩性電解質，電泳后固定、染色、干燥都十分迅速簡便，其最大優(yōu)點是防止了電極液的電滲作用而引起正負兩極pH梯度的漂變。 測定pH梯度的方法有四種： 1. 將膠條切成小塊，用水浸泡后，用精密pH試紙或進口的細長pH復合電極測定pH值，然后作圖。 2. 用表面pH微電極直接測定膠條各部分的pH值，然后作圖。3. 用一套已知不同的

6、pI值的蛋白質作為標準，測定pH梯度的標準曲線。4. 將膠條于70冰凍后切成1mm的薄片，加入0.5ml 0.01M KCl，用微電極測其pH。三、儀器和用具 1. 電泳儀 2. 垂直管式園盤電泳槽一套 3. 注射器與針頭 4. 移液管：10ml、5ml、2ml、1ml、0.1ml 5. 小燒杯若干 6. 培養(yǎng)皿一套 7. 直尺 8. 小刀 9. 精密pH試紙和帶細長復合pH電極的pH計 10. 塑料薄膜和橡皮筋四、試劑 1. 丙烯酰胺 2. 甲叉雙丙烯酰胺 3. 兩性電解質Ampholine（40%，pH3.59.5） 4. 過硫酸胺（催化劑） 5. TEMED（四甲基乙二胺）（加速劑） 6

7、. 磷酸 7. NaOH 8. 三氯乙酸（TCA）五、溶液配制 1. 丙烯酰胺貯液（30%丙烯酰胺，交聯(lián)度2.6%）：，30g丙烯酰胺和0.8g甲叉雙丙烯酰胺溶于H2O，定容至100ml，濾去不溶物后存于棕色瓶，4可保存數(shù)月。（全班公用）（另一配方為29.1g 丙烯酰胺和0.9g 甲叉雙丙烯酰胺溶于H2O，定容至100ml，交聯(lián)度為3.0%）。 2. 兩性電解質Amphline（40%）的加入量為：50ml /ml 膠液。 3. 過硫酸胺：配成1mg/ml的濃度，當天配制，配100ml全班公用。膠液中的加入量為0.5mg/ml膠液。 4. TEMED：膠液中的加入量為1ml/ml膠液。 5.

8、蛋白質樣品：選用兩種等電點相差較大的蛋白質，每根垂直管中每種蛋白質的加樣量控制在100mg。蛋白質樣品配制成各為5mg/ml的濃度。配2.5ml全班公用。 6. 固定液：10%的三氯乙酸，每組配50ml。7. 陽極電極液：0.1M H3PO4 3.4ml 濃磷酸（85%）加H2O至500ml，每個電泳槽用500ml。 8. 陰極電極液：0.5M NaOH 2g NaOH 加H2O溶解至500ml，每個電泳槽用500ml。六、操作步驟 1. 配膠 膠濃度 5.0% 4.8% 5.0%膠液總體積 8ml 10ml 12ml丙烯酰胺貯液 1.33ml 1.60ml 2.0mlAmpholine 0.

9、40ml 0.50ml 0.60mlTEMED 0.008ml 0.010ml 0.012ml蛋白質樣品 0.080ml 0.100ml 0.120mlH2O 2.26ml 2.79ml 3.27ml過硫酸銨(1mg/ml) 4.0ml 5.0ml 6.0ml 裝管數(shù) 4支 5支 6支 過硫酸銨是膠聚合的催化劑，因此最后加入，加畢，立即搖勻，因膠很快就會聚合，必須立即裝管。通?；瘜W聚合的膠液，需在過硫酸銨加入前進行減壓抽氣處理，本實驗將此抽氣步驟省略并不影響實驗結果。 2. 裝管 每個學生裝兩支管，每組裝四支。先用肥皂洗手，然后將圓盤電泳槽的玻璃管洗凈，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在試管

10、架上，用移液管將配好的膠液移入管內，（每根玻璃管的容量約為1.51.8ml）,液面加至距管口1mm處，用注射器輕輕加入少許H2O，進行水封，以消除彎月面使膠柱頂端平坦。膠管垂直聚合約30分鐘，聚合完成時可觀察到水封下的折光面。3. 裝槽和電泳用濾紙條吸去膠管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，將膠管垂直插入圓盤電泳槽內，調節(jié)好各管的高度，記下管號。每支管約1/3在上槽，2/3在下槽。上槽加入500ml 0.1M H3PO4，下槽加入500ml 0.1M NaOH，淹沒各管口和電極，用注射器或滴管吸去管口的氣泡。上槽接正極，下槽接負極，開啟電泳儀，恒壓160V，聚焦2至3小時，至電流近于零不

11、再降低時，停止電泳。4. 剝膠 取下膠管，用H2O 將膠管和兩端洗2次，用注射器沿管壁輕輕插入針頭，在轉動膠管和內插針頭的同時分別向膠管兩端注入H2O少許，膠條即自行滑出，若不滑出可用洗耳球輕輕擠出。膠條置于小培養(yǎng)皿內，記住正極端為“頭”，負極端為“尾”，若分不清時，可用pH試紙鑒定，酸性端為正，堿性端為負。 5. 固定取2支膠條置于一個小培養(yǎng)皿內，倒入10%三氯乙酸溶液至沒過膠條，進行固定，約半小時后，即可看到膠條內蛋白質的白色沉淀帶。固定完畢，倒出固定液，用直尺量出膠條長度“L2”和正極端到蛋白質白色沉淀帶中心（即聚焦部位）的長度“L”。固定后的膠條可在康強860紫外/可見分光光度計上用280nm或238nm波長作凝膠掃描，然后用掃描圖作相應的測量和計算。6. 測定pH梯度 將放在另一個培養(yǎng)皿內未固定的膠條，用直尺量出待測pH膠條的長度“L1”。按照由正極至負極的順序，用鑷子和小刀依次將膠條切成10mm長的小段，分別置于小試管中，加入1ml H2O，浸泡半小時以上或過夜，用仔細校正后的帶細長pH復合電極的pH計測出每管浸出液的pH值。七、數(shù)據(jù)處理 1. 以膠條長度（mm）為橫座標，pH值為縱座標作圖，得到一條pH梯度曲線。所測每管的pH值為10mm膠條的pH的混合平均