禽病實(shí)驗(yàn)室診斷課件

1、禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷實(shí)驗(yàn)室診斷一、血清學(xué)試驗(yàn)一、血清學(xué)試驗(yàn)(一一)凝集試驗(yàn)?zāi)囼?yàn) 1.直接凝集試驗(yàn)直接凝集試驗(yàn)?zāi)磻?yīng)即細(xì)菌、紅細(xì)胞凝集反應(yīng)即細(xì)菌、紅細(xì)胞(Hb)等顆粒性抗等顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體在電解質(zhì)參與下原與相應(yīng)的抗體在電解質(zhì)參與下,抗原顆?？乖w粒相互凝集形成團(tuán)塊相互凝集形成團(tuán)塊,這種現(xiàn)象稱為凝集反應(yīng)。這種現(xiàn)象稱為凝集反應(yīng)。參與反應(yīng)的抗體稱為凝集素參與反應(yīng)的抗體稱為凝集素,抗原稱凝集原?？乖Q凝集原。常有平板法、試管法、玻片法及微量凝集常有平板法、試管法、玻片法及微量凝集法等。法等。 禽病實(shí)驗(yàn)室診斷(1)平板凝集試驗(yàn)平板凝集試驗(yàn)取潔凈玻板一塊取潔凈玻板一塊,用蠟筆按試驗(yàn)要求劃

2、成數(shù)用蠟筆按試驗(yàn)要求劃成數(shù)個(gè)方格個(gè)方格,并注明待檢血樣的號碼并注明待檢血樣的號碼;用生理鹽水用生理鹽水倍比稀釋血清倍比稀釋血清,加入抗原加入抗原,用牙簽用牙簽(或火柴棍或火柴棍之類之類)自血清量最少自血清量最少(血清稀釋度最高血清稀釋度最高)的一的一格起格起,將血清與抗原混勻?qū)⒀迮c抗原混勻,注意抗原用前搖勻注意抗原用前搖勻,并置室內(nèi)并置室內(nèi),使其溫度達(dá)使其溫度達(dá)20以上?；旌贤戤呉陨?。混合完畢用酒精燈稍微加溫用酒精燈稍微加溫,使達(dá)使達(dá)30左右左右,58min內(nèi)記錄結(jié)果。內(nèi)記錄結(jié)果。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷按下列標(biāo)準(zhǔn)記錄反應(yīng)強(qiáng)度：按下列標(biāo)準(zhǔn)記錄反應(yīng)強(qiáng)度：:出現(xiàn)大的凝集塊出現(xiàn)大的凝集塊,液體完全透明。液體

3、完全透明。 :有明顯凝集片有明顯凝集片,液體幾乎完全透明液體幾乎完全透明,即即75%凝集。凝集。:有可見凝集片有可見凝集片,液體不甚透明液體不甚透明,即即50%的凝集。的凝集。:液體混濁液體混濁,有小的顆粒狀物有小的顆粒狀物,即即25%凝集。凝集。:液體均勻混濁液體均勻混濁,即不凝集。即不凝集。該法為一種定量方法該法為一種定量方法,常用于檢測待檢血清中的相應(yīng)抗體及其效常用于檢測待檢血清中的相應(yīng)抗體及其效價(jià)。如一般以以上血清最高稀釋度為該血清的凝集價(jià)。也用價(jià)。如一般以以上血清最高稀釋度為該血清的凝集價(jià)。也用定性作為禽病陽性判定定性作為禽病陽性判定,協(xié)助臨床診斷及流行病學(xué)的調(diào)查。協(xié)助臨床診斷及流行

4、病學(xué)的調(diào)查。注意：注意：每次試驗(yàn)須用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清作對照。每次試驗(yàn)須用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清作對照。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷(2)試管凝集試驗(yàn)試管凝集試驗(yàn)既可用已知抗原既可用已知抗原(細(xì)菌混懸液細(xì)菌混懸液)檢測待檢血清檢測待檢血清,又可用陽性血清檢測又可用陽性血清檢測待檢抗原。待檢抗原。每份血清用每份血清用4支試管支試管,另取另取3支對照管。支對照管。用用0.5%石炭酸生理鹽水將被檢血清稀釋成四個(gè)稀釋度。第石炭酸生理鹽水將被檢血清稀釋成四個(gè)稀釋度。第5管管中不加血清中不加血清,設(shè)為抗原對照。第設(shè)為抗原對照。第6管中加管中加1:25稀釋的陽性血清稀釋的陽性血清0.5ml個(gè)陽性血清對照。第個(gè)陽性血清

5、對照。第7管中加管中加1:25稀釋的陰性血清稀釋的陰性血清0.5ml作作為陰性對照。為陰性對照。各管中加入用各管中加入用0.5%石炭酸生理鹽水稀釋石炭酸生理鹽水稀釋20倍的抗原倍的抗原0.5ml,并并充分混勻。充分混勻。放入放入37下作用下作用410h,取出后放室溫取出后放室溫1824h觀察并記錄結(jié)果。觀察并記錄結(jié)果。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷棄去棄去1.5禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷(二二)免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP) 抗原與相應(yīng)的抗體在含有電解質(zhì)的瓊抗原與相應(yīng)的抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中會自由擴(kuò)散脂凝膠中會自由擴(kuò)散,

6、形成肉眼可見的沉淀形成肉眼可見的沉淀帶稱為免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)帶稱為免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(沉淀試驗(yàn)沉淀試驗(yàn))。 可用已知抗原沉淀未知抗體可用已知抗原沉淀未知抗體,也可用已知也可用已知抗體測定未知抗原抗體測定未知抗原,特異性強(qiáng)特異性強(qiáng),可用于禽流感可用于禽流感(AI)、禽霍亂、雞白痢、馬立克、禽霍亂、雞白痢、馬立克(MD)、傳、傳染性法氏囊炎染性法氏囊炎(IBD)、傳染性支氣管炎、傳染性支氣管炎(IB)、傳染性鼻炎傳染性鼻炎(IC)、傳染性腦脊髓炎、傳染性腦脊髓炎(AE)、病毒性關(guān)節(jié)炎病毒性關(guān)節(jié)炎(REO)、雞包涵體肝炎、雞包涵體肝炎(IBH)等的診斷。等的診斷。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷1.瓊脂的制備方法瓊脂的制

7、備方法 瓊脂凝膠中含瓊脂凝膠中含1%的優(yōu)質(zhì)瓊脂的優(yōu)質(zhì)瓊脂粉、粉、0.1%石炭酸、石炭酸、8%NaCl,水浴加熱水浴加熱至全溶至全溶,分裝于三角瓶中分裝于三角瓶中,于于4條件下條件下冷藏備用。用前將其置入沸水浴中融冷藏備用。用前將其置入沸水浴中融化化,待溫度下降至待溫度下降至5060時(shí)倒入培養(yǎng)時(shí)倒入培養(yǎng)皿中皿中(或玻片上或玻片上),厚度為厚度為35mm 。然后。然后打孔打孔(孔直徑孔直徑4mm,孔距孔距34mm)。結(jié)束。結(jié)束后在火焰上輕輕烘烤后在火焰上輕輕烘烤(封底封底),即可加樣。即可加樣。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷2.操作方法：操作方法：用已知抗用已知抗 原測定血清抗體時(shí)原測定血清抗體時(shí),中中 央孔加入

8、已知抗原央孔加入已知抗原, 1、4孔加陽性血清對照孔加陽性血清對照, 2、3、5、6孔加待檢血孔加待檢血 清清;用已知陽性血清測用已知陽性血清測 未知抗原時(shí)未知抗原時(shí),中央孔加中央孔加 已知陽性血清已知陽性血清, 1、4孔孔 加已知抗原對照加已知抗原對照,2、3、 5、6孔加待檢抗原材料孔加待檢抗原材料 (加滿即可加滿即可,不可外溢不可外溢)。 然后加蓋然后加蓋,置于置于37恒恒 溫箱中反應(yīng)溫箱中反應(yīng)2448h后觀察。后觀察。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷(三三)血凝血凝(HA)和血凝抑制試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)1.原原 理理正副粘病毒科的病毒正副粘病毒科的病毒(如如ND、AI、IB、EDS-

9、76等等)可凝集紅細(xì)胞可凝集紅細(xì)胞,而特而特異性抗體可抑制這種凝集異性抗體可抑制這種凝集,即凝集抑即凝集抑制。制。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷2.HA的操作方法的操作方法:112孔先加孔先加50LpH為為7.2的的0.01molmol/LPBS液或生理鹽水液或生理鹽水;第第1孔中加入孔中加入50L抗原抗原(如如ND病毒病毒)振蕩混勻振蕩混勻;逐級稀釋至第逐級稀釋至第11孔時(shí)棄去孔時(shí)棄去50L,第第12孔不加抗原孔不加抗原,做為紅細(xì)胞對照做為紅細(xì)胞對照;112孔各加孔各加0.5%雞紅細(xì)胞懸液雞紅細(xì)胞懸液50L,振蕩振蕩1530s,使其混勻使其混勻,靜置于靜置于37作作用用2040min觀察結(jié)果觀察結(jié)果; 待對

10、照孔中的紅細(xì)胞全部沉入孔底中待對照孔中的紅細(xì)胞全部沉入孔底中間間,即可判定各即可判定各 孔的紅細(xì)胞孔的紅細(xì)胞凝集情況凝集情況,以病毒最大的稀釋度孔出現(xiàn)以病毒最大的稀釋度孔出現(xiàn)100%凝集現(xiàn)象者為這個(gè)病凝集現(xiàn)象者為這個(gè)病毒的凝集價(jià)毒的凝集價(jià),即一個(gè)血凝單位。即一個(gè)血凝單位。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷3.HI的操作方法的操作方法:111孔先加孔先加25L稀釋液稀釋液;1孔中加入孔中加入25L待檢血清待檢血清(或已知陽性血清或已知陽性血清);逐級稀逐級稀釋至第釋至第10孔時(shí)棄去孔時(shí)棄去,第第11孔不加血清孔不加血清,為陰為陰性對照第性對照第12孔不加血清和抗原孔不加血清和抗原,為紅細(xì)

11、胞對為紅細(xì)胞對照照;111孔各加孔各加25L4單位抗原單位抗原,振蕩振蕩30秒秒,37作用作用20min;112孔各加孔各加0.5%紅紅細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液,振蕩振蕩1min,37作用作用2030min觀觀察結(jié)果察結(jié)果;待第待第11抗原對照孔的紅細(xì)胞均勻抗原對照孔的紅細(xì)胞均勻鋪在管壁上鋪在管壁上(100%凝集凝集)時(shí)時(shí),檢查孔中完全不檢查孔中完全不凝集為該血清的血凝抑制價(jià)。凝集為該血清的血凝抑制價(jià)。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷4. HA和和HI試驗(yàn)的應(yīng)用試驗(yàn)的應(yīng)用用于用于AI、ND、IB、EDS-76等等病毒的鑒定病毒的鑒定 這些病毒都能使家禽的紅細(xì)胞發(fā)這些病毒都能使家禽的紅細(xì)胞發(fā)生

12、凝集生凝集, ,然后用然后用特定特定的抗體來抑制的抗體來抑制, ,若出現(xiàn)凝集抑制則可確定是該種病若出現(xiàn)凝集抑制則可確定是該種病毒。毒。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷HI試驗(yàn)可用于發(fā)病禽群的診斷試驗(yàn)可用于發(fā)病禽群的診斷 比如用比如用ND疫苗免疫過的雞群中疫苗免疫過的雞群中,ND抗體水平為抗體水平為78lg2,最高不超過最高不超過10lg2,其其群體中抗體水平呈正態(tài)分布群體中抗體水平呈正態(tài)分布,10lg2以上的以上的僅占僅占10%以下以下,4lg2以下的僅占以下的僅占1%。而被。而被ND強(qiáng)毒感染并發(fā)病的雞群中強(qiáng)毒感染并發(fā)病的雞群中,HI抗體可高抗體可高達(dá)達(dá)1113lg2,并且雞群中的抗體水平不呈并且雞群中的抗體水

13、平不呈正態(tài)分布正態(tài)分布,10lg2以上的占以上的占25%,4lg2以下以下的占的占1030%。同時(shí)結(jié)合其它診斷方法以。同時(shí)結(jié)合其它診斷方法以確診。確診。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷可以進(jìn)行抗體檢測可以進(jìn)行抗體檢測 可檢測家禽的血清抗體或卵可檢測家禽的血清抗體或卵黃抗體黃抗體(母源抗體母源抗體),對禽群的免疫狀態(tài)對禽群的免疫狀態(tài)進(jìn)行評價(jià)進(jìn)行評價(jià),以指導(dǎo)免疫。首次進(jìn)行以指導(dǎo)免疫。首次進(jìn)行ND免疫時(shí)免疫時(shí),母源抗體母源抗體(半衰期為半衰期為5d)水平應(yīng)水平應(yīng)在在3lg2時(shí)進(jìn)行時(shí)進(jìn)行,以后再免時(shí)應(yīng)在以后再免時(shí)應(yīng)在45lg2之間時(shí)進(jìn)行之間時(shí)進(jìn)行,過高時(shí)則會產(chǎn)生過高時(shí)則會產(chǎn)生免疫干擾免疫干擾,過低則易發(fā)病。過低則易發(fā)病

14、。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷可檢測抗體效價(jià)可檢測抗體效價(jià) 可檢測高免血清或高免卵可檢測高免血清或高免卵黃的抗體效價(jià)黃的抗體效價(jià), ,從而對其進(jìn)行質(zhì)量從而對其進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。高免血清或高免卵黃的抗評價(jià)。高免血清或高免卵黃的抗體效價(jià)體效價(jià)在在9lg2以上以上時(shí)時(shí), ,才可用于傳才可用于傳染病的緊急預(yù)防或發(fā)病早期的治染病的緊急預(yù)防或發(fā)病早期的治療。療。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷二、病原學(xué)檢查二、病原學(xué)檢查1.病料的采集病料的采集 應(yīng)從發(fā)病早期比較典型的應(yīng)從發(fā)病早期比較典型的病例中采集病例中采集, ,通常在有顯著病變的通常在有顯著病變的不同器官

15、和不同部位采取不同器官和不同部位采取, ,如發(fā)生如發(fā)生AIAI時(shí)的氣管粘膜、肺、腦等組織時(shí)的氣管粘膜、肺、腦等組織, ,高熱期的血液。高熱期的血液。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷2.病料的涂病料的涂(抹抹)片鏡檢片鏡檢 用有顯著病變的不同器官、不用有顯著病變的不同器官、不同部位涂同部位涂( (抹抹) )數(shù)片數(shù)片, ,固定染色后鏡固定染色后鏡檢?？蓪哂刑卣餍螒B(tài)的病原微生檢?？蓪哂刑卣餍螒B(tài)的病原微生物或蟲卵作出診斷。物或蟲卵作出診斷。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷3.病料的處理病料的處理 每克組織中加入每克組織中加入510ml滅菌滅菌生理鹽水研磨生理鹽水研磨(若為病毒性病料若為病毒性病料,可于每可于每ml研磨液中加青、鏈霉素

16、研磨液中加青、鏈霉素各各1000IU),之后于之后于4下作用下作用24h,或或37下作用下作用1h,然后以然后以1500轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/min離心離心15min,取上清液取上清液作為接種、培養(yǎng)材料。作為接種、培養(yǎng)材料。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷4.病原的培養(yǎng)和鑒定病原的培養(yǎng)和鑒定 細(xì)菌、真菌、螺旋體等細(xì)菌、真菌、螺旋體等可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)。而病毒由可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)。而病毒由于沒有完整的酶系統(tǒng)于沒有完整的酶系統(tǒng), ,不能在無不能在無生命的培養(yǎng)基中生長生命的培養(yǎng)基中生長, ,可用禽胚、可用禽胚、動物或組織進(jìn)行培養(yǎng)。病原培養(yǎng)動物或組織進(jìn)行培養(yǎng)。病原培養(yǎng)后后, ,根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特性、動物接

17、種試驗(yàn)及免疫血清學(xué)性、動物接種試驗(yàn)及免疫血清學(xué)試驗(yàn)等方法作出鑒定。試驗(yàn)等方法作出鑒定。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷5.動物接種試驗(yàn)動物接種試驗(yàn) 選擇對該種傳染病病原體最選擇對該種傳染病病原體最敏感敏感的的SPF動物進(jìn)行人工感染試動物進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。將病料用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行人驗(yàn)。將病料用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行人工接種工接種,然后根據(jù)對不同動物的然后根據(jù)對不同動物的致病力、發(fā)病后的癥狀和病理變致病力、發(fā)病后的癥狀和病理變化特點(diǎn)來診斷?；攸c(diǎn)來診斷。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽病實(shí)驗(yàn)室診斷禽場疫病的撲滅措施禽場疫病的撲滅措施一、診斷和疫情報(bào)告一、診斷和疫情報(bào)告 本場診斷確診后向

18、臨近場本場診斷確診后向臨近場及時(shí)通報(bào)及時(shí)通報(bào), ,烈性傳染病要上報(bào)政府烈性傳染病要上報(bào)政府部門部門, ,以確定封鎖、隔離區(qū)域。以確定封鎖、隔離區(qū)域。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷二、封鎖、隔離與消毒 疫區(qū)封鎖疫區(qū)封鎖, ,家禽及其產(chǎn)品禁止家禽及其產(chǎn)品禁止進(jìn)出進(jìn)出, ,疫區(qū)嚴(yán)格消毒疫區(qū)嚴(yán)格消毒, ,糞便無害化處糞便無害化處理理, ,沒有發(fā)病的禽群沒有發(fā)病的禽群, ,增加帶禽消毒增加帶禽消毒的次數(shù)的次數(shù), ,疫情報(bào)告結(jié)束后疫情報(bào)告結(jié)束后, ,全場消毒全場消毒, ,當(dāng)檢測合格后當(dāng)檢測合格后, ,方可解除封鎖。方可解除封鎖。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷三、處理病死禽 防止病原擴(kuò)散和污染防止病原擴(kuò)散和污染, ,一般要一般要進(jìn)行深埋、焚燒、化制等處理。嚴(yán)進(jìn)行深埋、焚燒、化制等處理。嚴(yán)禁出售和運(yùn)出疫區(qū)禁出售和運(yùn)出疫區(qū), ,能治療的及時(shí)能治療的及時(shí)治療。治療。禽病實(shí)驗(yàn)室診斷四、緊急免疫接種 在禽場或其鄰近地區(qū)發(fā)生在禽場或其鄰近地區(qū)發(fā)生傳染病時(shí)傳染病時(shí), ,為迅速控制和撲滅疫病為迅速控制和撲滅疫病,