X射線晶體衍射技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)檢測

1、2021-7-281 X射線晶體衍射技術(shù) 在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)測定中的應(yīng)用 2021-7-282 Definition of X-ray Diffraction X X射線晶體結(jié)構(gòu)分析射線晶體結(jié)構(gòu)分析是使用是使用X X射線作為物理射線作為物理 工具，以晶體作為研究對象，晶體結(jié)構(gòu)作工具，以晶體作為研究對象，晶體結(jié)構(gòu)作 為研究結(jié)果的一種方法。為研究結(jié)果的一種方法。 包含兩個方面的內(nèi)容：包含兩個方面的內(nèi)容：X X射線和晶體。射線和晶體。 2021-7-283 Introduction of X-ray Diffraction X-射線衍射法是測定蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的極其重要方法。射線衍射法是測定蛋白質(zhì)晶體結(jié)

2、構(gòu)的極其重要方法。 通過通過X-射線衍射法（射線衍射法（X-ray diffraction method）可間接）可間接 地研究蛋白質(zhì)晶體的空間結(jié)構(gòu)。對晶體結(jié)構(gòu)的研究將幫地研究蛋白質(zhì)晶體的空間結(jié)構(gòu)。對晶體結(jié)構(gòu)的研究將幫 助人們從原子的水平上了解物質(zhì)。助人們從原子的水平上了解物質(zhì)。 雖然，生物大分子雖然，生物大分子X射線晶體學(xué)是揭示分子結(jié)構(gòu)與功能射線晶體學(xué)是揭示分子結(jié)構(gòu)與功能 的科學(xué)。但目前還的科學(xué)。但目前還沒有一種工具能夠用它直接觀察到蛋沒有一種工具能夠用它直接觀察到蛋 白質(zhì)內(nèi)部的原子和基團的排列白質(zhì)內(nèi)部的原子和基團的排列。 2021-7-284 X-ray發(fā)展歷史發(fā)展歷史 1895年，倫琴年

3、，倫琴(Rontgen)發(fā)現(xiàn)了發(fā)現(xiàn)了X-ray; 1913年布拉格父子用年布拉格父子用X射線衍射法對氯化鈉、氯化鉀晶體進行了射線衍射法對氯化鈉、氯化鉀晶體進行了 測定，指出晶體衍射圖可以確定晶體內(nèi)部的測定，指出晶體衍射圖可以確定晶體內(nèi)部的原子原子（或分子）間的（或分子）間的 距離和排列。因此獲諾貝爾獎。距離和排列。因此獲諾貝爾獎。 1951年，加利福尼亞理工學(xué)院的泡令和科里提出，年，加利福尼亞理工學(xué)院的泡令和科里提出，-構(gòu)型的構(gòu)型的多肽多肽 鏈鏈呈螺旋形，通過呈螺旋形，通過X射線確定，組成蛋白質(zhì)的都是射線確定，組成蛋白質(zhì)的都是L-型型氨基酸氨基酸。 1953年克里克、沃森在年克里克、沃森在X射

4、線衍射資料的基礎(chǔ)上，提出了射線衍射資料的基礎(chǔ)上，提出了DNA三三 維結(jié)構(gòu)的模型。獲維結(jié)構(gòu)的模型。獲1962年生理或醫(yī)學(xué)諾貝爾獎。年生理或醫(yī)學(xué)諾貝爾獎。 1959年佩魯茨和肯德魯對血紅蛋白和肌血蛋白進行結(jié)構(gòu)分析，解年佩魯茨和肯德魯對血紅蛋白和肌血蛋白進行結(jié)構(gòu)分析，解 決了決了三維空間結(jié)構(gòu)三維空間結(jié)構(gòu),獲獲1962年諾貝爾化學(xué)獎年諾貝爾化學(xué)獎. X射線衍射技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方面起到了推動作用射線衍射技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方面起到了推動作用 NaCl 晶體 結(jié)構(gòu) 2021-7-285 X-射線結(jié)構(gòu)分析法射線結(jié)構(gòu)分析法（X-光衍射法）光衍射法） 工作原理工作原理： 由由X-射線管射線管產(chǎn)生的各種波長的

5、產(chǎn)生的各種波長的X-射線，經(jīng)過射線，經(jīng)過濾波器濾波器 （如鎳片等）得到一定波長的單色（如鎳片等）得到一定波長的單色X-射線；射線； 單色單色X-射線通過射線通過晶體晶體，產(chǎn)生，產(chǎn)生衍射線衍射線，用照相機記錄下，用照相機記錄下 來，得到來，得到衍射圖衍射圖； 然后，通過對衍射斑點的然后，通過對衍射斑點的位置位置與與強度強度的測定與計算，的測定與計算， 并參照化學(xué)分析的結(jié)果，就可確定晶體結(jié)構(gòu)。并參照化學(xué)分析的結(jié)果，就可確定晶體結(jié)構(gòu)。 2021-7-286 基本原理 根據(jù)晶體中原子重復(fù)出現(xiàn)的周期性結(jié)構(gòu)根據(jù)晶體中原子重復(fù)出現(xiàn)的周期性結(jié)構(gòu)。當。當X-射線穿過晶體的原射線穿過晶體的原 子平面層時，只要原子

6、層的距離子平面層時，只要原子層的距離d與入射角的與入射角的X-射線波長射線波長、入射、入射 角角之間的關(guān)系能滿足之間的關(guān)系能滿足布拉格布拉格(Bragg)方程式：方程式： 2d sin=n( n =1,2,3,) 則反射波可以互相疊加而產(chǎn)生衍射，形成復(fù)雜的衍射圖譜。不同則反射波可以互相疊加而產(chǎn)生衍射，形成復(fù)雜的衍射圖譜。不同 物質(zhì)的晶體形成各自獨特的物質(zhì)的晶體形成各自獨特的X-射線衍射圖。根據(jù)記錄下來的衍射射線衍射圖。根據(jù)記錄下來的衍射 圖譜，經(jīng)過復(fù)雜的數(shù)學(xué)處理，可推知晶體中原子的分布和分子的圖譜，經(jīng)過復(fù)雜的數(shù)學(xué)處理，可推知晶體中原子的分布和分子的 空間結(jié)構(gòu)?？臻g結(jié)構(gòu)。 d d 平行光束平行光

7、束 原子層原子層 2021-7-287 晶體的衍射晶體的衍射 X X射線晶體結(jié)構(gòu)分析是利用晶體的射線晶體結(jié)構(gòu)分析是利用晶體的X X射線衍射現(xiàn)象來射線衍射現(xiàn)象來 測定晶體及分子的結(jié)構(gòu)。測定晶體及分子的結(jié)構(gòu)。 通常通常X X射線衍射可簡單理解為當一束平行的射線衍射可簡單理解為當一束平行的X X射線投射線投 射到晶體上時，大部分入射線穿過晶體沿原方向前進，射到晶體上時，大部分入射線穿過晶體沿原方向前進， 而部分射線卻偏離了入射方向。而部分射線卻偏離了入射方向。 X射線源 入射線 晶體 衍射線 2021-7-288 Protein Structure By X-RayCrystallography O

8、btain Crystals ;Expose Crystals to X-rays ;Measure intensity of Diffraction; Compute Electron density at every position in the crystal (x,y,z) ;Place poly-peptide chain into electron density. 2021-7-289 X射線晶體結(jié)構(gòu)測定原理 晶體的衍射花樣與晶體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系，晶體的衍射花樣與晶體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系， 即衍射花樣內(nèi)衍射點的即衍射花樣內(nèi)衍射點的排列方式排列方式、點間距離點間距離的大小

9、的大小 與晶體內(nèi)生物大分子的與晶體內(nèi)生物大分子的排列方式排列方式和和重復(fù)周期重復(fù)周期大小有大小有 關(guān)，而衍射點的關(guān)，而衍射點的強度分布強度分布與與生物大分子結(jié)構(gòu)本身生物大分子結(jié)構(gòu)本身的的 特點有關(guān)特點有關(guān)。 因此因此 通過分析通過分析衍射點的排列方式和測量點間距離的大小衍射點的排列方式和測量點間距離的大小來推算來推算分子分子 在晶體結(jié)構(gòu)中的排列方式和重復(fù)周期的大小在晶體結(jié)構(gòu)中的排列方式和重復(fù)周期的大小 通過通過測量衍射點的強度測量衍射點的強度，應(yīng)用一系列數(shù)學(xué)方法，借助電子計算，應(yīng)用一系列數(shù)學(xué)方法，借助電子計算 機可機可測定分子內(nèi)每個原子在空間的坐標，從而測定整個分子的測定分子內(nèi)每個原子在空間的

10、坐標，從而測定整個分子的 結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)。 2021-7-2810 晶體結(jié)構(gòu)的基本知識晶體結(jié)構(gòu)的基本知識 1.日常所見的許多晶體，如：氯化鈉（離子晶體）、金剛石（原日常所見的許多晶體，如：氯化鈉（離子晶體）、金剛石（原 子晶體）等，外形都是非常有規(guī)則的。無論是那一類晶體，組子晶體）等，外形都是非常有規(guī)則的。無論是那一類晶體，組 成晶體的微粒在空間的三個方向上，都是周期性排列的。成晶體的微粒在空間的三個方向上，都是周期性排列的。 2.晶體的空間結(jié)構(gòu)是由一組相互平行的、情況相同的平面點陣所晶體的空間結(jié)構(gòu)是由一組相互平行的、情況相同的平面點陣所 組成。每一個點陣所構(gòu)成的單元叫晶胞。組成

11、。每一個點陣所構(gòu)成的單元叫晶胞。 3.知道了晶體的晶胞就等于知道了整個晶體的空間結(jié)構(gòu)。知道了晶體的晶胞就等于知道了整個晶體的空間結(jié)構(gòu)。 4.X-射線結(jié)構(gòu)分析的主要根據(jù)是衍射線的方向和強度，即衍射圖射線結(jié)構(gòu)分析的主要根據(jù)是衍射線的方向和強度，即衍射圖 上斑點的位置與黑度。上斑點的位置與黑度。 衍射線方向：確定晶胞的大小和形狀；衍射線方向：確定晶胞的大小和形狀； 衍射線強度：確定晶胞中的原子排列。衍射線強度：確定晶胞中的原子排列。 2021-7-2811 測定步驟測定步驟 1. 培養(yǎng)大的、質(zhì)量好的晶體 2. 進行初步的x射線衍射分析； 3. 重原子衍生物的制備； 4. 衍射數(shù)據(jù)的測量和處理； 5.

12、 相位的計算； 6. 電子密度圖的計算和解釋； 7. 分子模型的修正。 2021-7-2812 獲得好的晶體是獲得好的晶體是 結(jié)構(gòu)分析中最關(guān)鍵的一步結(jié)構(gòu)分析中最關(guān)鍵的一步 欲獲得晶體，蛋白質(zhì)分子的純度和均一性(如， 手性的一致性等)是能否獲得完好結(jié)晶的關(guān)鍵 之一。 重組重組DNADNA技術(shù)技術(shù)在這方面是一個很重要的突破。 由高效表達克隆基因獲得的蛋白質(zhì)能夠快速獲 得純化，并且只需很少的純化步驟就能得到均 一的樣品。 一般來說，一個蛋白質(zhì)樣品要想使其能結(jié)晶， 至少需要97%的均一性。 2021-7-2813 蛋白質(zhì)晶體培養(yǎng)一般規(guī)律蛋白質(zhì)晶體培養(yǎng)一般規(guī)律 蛋白質(zhì)結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶過程像其他小分子物質(zhì)一樣，是一個過程像其他小分子物質(zhì)一樣，是一個 有序化過程，即在溶液中處于隨機狀態(tài)的分子轉(zhuǎn)變成有序化過程，即在溶液中處于隨機狀態(tài)的分子轉(zhuǎn)變成 有規(guī)則排列狀態(tài)的固體有