子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染

1、病理學(xué)新技術(shù)o FISHo 原位雜交o 免疫組織化學(xué)o 生物傳感器o 熒光原位雜交熒光原位雜交Fluorescence in situ hybridizationo 原理原理利用DNA堿基對的互補(bǔ)性，將直接標(biāo)記了熒光的單鏈DNA(探針)和與其互補(bǔ)的目標(biāo)樣本的DNA(玻片上的標(biāo)本)雜交,通過觀察熒光信號在染色體上的位置反映相應(yīng)染色體的情況FISH操作樣本預(yù)處理樣本預(yù)處理 脫蠟，脫水及水化，消化，脫蠟，脫水及水化，消化，探針、樣本變性探針、樣本變性 78 78 探針樣本雜交探針樣本雜交 45-5045-50雜交后洗滌雜交后洗滌結(jié)果觀察結(jié)果觀察FISH FISH 探針種類探針種類CSP著絲粒探針著絲

2、粒探針GLP特異性位點(diǎn)探針特異性位點(diǎn)探針染色體整臂探針FISHFISH探針的類型探針的類型l 全染色體涂抹探針全染色體涂抹探針 （WCPWCP）l 染色體計數(shù)（著絲粒）探針染色體計數(shù)（著絲粒）探針（CSPCSP）l 位點(diǎn)特異性探針（位點(diǎn)特異性探針（GLPGLP） l單色特異性探針單色特異性探針l雙色分離重排探針雙色分離重排探針l雙色雙融合易位探針雙色雙融合易位探針 IgHBcl2IGH/BCL2探針探針14（灰）號和（灰）號和18號（黑）染色體號（黑）染色體IgH基因基因Bcl-2基因基因雜交雜交正正 常常 異異 常常融合融合基因擴(kuò)增基因擴(kuò)增雙色雙融合易位探針雙色雙融合易位探針( IGH/BC

3、L2( IGH/BCL2） FISHFISH的特點(diǎn)的特點(diǎn)操作簡單 檢測快速 結(jié)果易觀察靈敏性和特異性高可檢測樣本種類多 空間定位精確FISH檢測在臨床中的應(yīng)用o產(chǎn)前診斷o血液病檢測o實(shí)體瘤檢測端粒，端粒酶及作用o端粒是真核細(xì)胞染色體末端的特殊NDA-蛋白結(jié)構(gòu)，其DNA含大量TTAGGG重復(fù)序列，在進(jìn)化中高度保守oDNA酶不能復(fù)制線性DNA（端粒是線性DNA）o大多數(shù)體細(xì)胞的端粒會隨周期性復(fù)制而縮短，最終達(dá)到一個使染色體完整性喪失的臨界點(diǎn)，細(xì)胞增殖停止；許多腫瘤細(xì)胞端粒酶活性增高，是腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵步驟o作用：n保護(hù)染色體基因組免受降解或重組n為染色體末端提供一種可消耗的非編碼序列，以緩解或取

4、消末端復(fù)制所帶來的染色體DNA進(jìn)行性縮短o生殖細(xì)胞具有端粒酶活性，其端粒不隨年齡增加而縮短，故成為永生細(xì)胞o端粒酶由RNA，DNA及蛋白質(zhì)組成，本質(zhì)是一種逆轉(zhuǎn)錄酶o端粒酶活性決定于端粒酶RNA（human telomerase RNA, hTERChTERC)和端粒酶催化亞單位(human telomerase reverse transcriptase, hTERThTERT)nhTERC是端粒長度穩(wěn)定的直接因素o保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細(xì)胞長期有活性和潛在的繼續(xù)增殖能力o人端粒酶基因位于3q26.3，該基因的擴(kuò)增可阻止細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生 宮頸脫落細(xì)胞及組織學(xué)FISH探針CSP3TER

5、ChTERChTERC基因定位于基因定位于3q26.33q26.3 3 3號染色體著絲粒信號號染色體著絲粒信號All the three centers obtained similarly increasing trend of hTERC positive rates according to the severity of cervical lesions, for both cytological results and pathological diagnosis. 中國8350例子宮頸病變TERC擴(kuò)增TBSTBS分級分級正常正常/ /炎癥炎癥ASCUSASCUSASC-HASC-H

6、LSILLSILHSILHSILTERCTERC基因擴(kuò)增發(fā)生率（基因擴(kuò)增發(fā)生率（% %）4.64.613.513.528.628.625.225.287.787.7病理分級病理分級正常正常/ /炎癥炎癥CIN 1CIN 1CIN 2CIN 2CIN 3CIN 3浸潤癌浸潤癌TERCTERC基因擴(kuò)增發(fā)生率（基因擴(kuò)增發(fā)生率（% %）4.2-10.64.2-10.626.826.865.465.483.183.193.593.5hTERC檢測臨床意義o 伴有hTERC基因擴(kuò)增的癌前病變的病人有52%96%的惡變可能。 o 可預(yù)測CIN1/CIN2 向CIN3發(fā)展的風(fēng)險因素，其靈敏度是100% ， 特

7、異性是 70%. o FISH是早期診斷和風(fēng)險預(yù)測的有效手段(AJP April 2005, Vol. 166, No. 4)ohTERChTERC基因檢測在宮頸癌和宮頸癌前基因檢測在宮頸癌和宮頸癌前病變診斷中有重要價值病變診斷中有重要價值n魏麗惠，李亞里，吳瑞芳，陳忠，屠錚，江靜，李靜然o北京大學(xué)人民醫(yī)院婦科，北京，中國o中國解放軍總醫(yī)院婦科，北京，中國o北京大學(xué)深圳醫(yī)院婦產(chǎn)科，深圳，中國o猶他大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)科，鹽湖城，美國o該研究顯示，采用FISH技術(shù)檢測hTERC基因擴(kuò)增可在宮頸細(xì)胞學(xué)玻片上進(jìn)行，具有無創(chuàng)性和客觀性的特點(diǎn)，敏感度和特異度高，在宮頸癌和宮頸癌前病變的診斷中有重要價值。hTE

8、RC基因的異常擴(kuò)增可能成為宮頸病變惡性進(jìn)展的早期標(biāo)記物。o北京協(xié)和醫(yī)院郎景和教授點(diǎn)評：北京協(xié)和醫(yī)院郎景和教授點(diǎn)評：n在液基細(xì)胞學(xué)檢查和檢測人乳頭狀瘤病毒篩查宮頸癌的同時，檢測hTERC基因，有望成為協(xié)助宮頸癌和宮頸癌前病變診斷及預(yù)測癌前病變是否向子宮頸癌發(fā)展的重要指標(biāo)，而造福廣大婦女。細(xì)胞癌變細(xì)胞癌變阻止細(xì)胞正常凋亡阻止細(xì)胞正常凋亡高危型高危型HPVHPV持續(xù)性感染持續(xù)性感染人類染色體端粒酶基因人類染色體端粒酶基因(hTERC)(hTERC)擴(kuò)增擴(kuò)增致癌基因致癌基因E6/E7E6/E7編碼的原癌蛋白表達(dá)編碼的原癌蛋白表達(dá)TERC基因的擴(kuò)增可阻止細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生 P16P16表達(dá)表達(dá)E7結(jié)

9、合結(jié)合RBE6結(jié)合結(jié)合p53o 隨著宮頸病變級別增加，hTERC的陽性率增加o hTERC陽性率n 正?；蜓装Y組 4.2-10.6%n CIN1組 26.8% n CIN2組 69.23%n CIN3組 83.58%n 宮頸癌組 95.65% 正常及正常及CIN1CIN1的的hTERChTERC基因陽性率明顯低于基因陽性率明顯低于CIN2CIN2及以上者，及以上者，P P 0.010.01 o hTERC診斷CIN2或CIN2以上病變n 敏感度 81.40%n 特異度 95.04%n 陽性預(yù)測值 70.00% n 陰性預(yù)測值陰性預(yù)測值 97.29%97.29% Human Papilloma

10、Virus(HPV)o 環(huán)狀雙鏈DNA病毒o 超過120種亞型o 其中的72種亞型可引起肛門及生殖器疾病o Low risk (LR-HPV): 6,116,11,40,42,44,54,61,70,72,81,40,42,44,54,61,70,72,81o High risk (HR-HPV): 16,18,16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,731,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,78,828,82 HPV的生物學(xué)狀態(tài): 游離或整合o 在HPV感染的早期或瞬間感染，HPV基因組以游離的環(huán)狀DNA形式存在于宿主細(xì)胞核中。

11、 (Condyloma and CIN-1)o 持續(xù)的HPV感染，使其DNA整合進(jìn)宿主DNA，標(biāo)志著惡性轉(zhuǎn)化。 (CIN2lesions)o 持續(xù)性的HPV感染幾乎總是發(fā)生在兩種上皮的交界處（宮頸移行帶、肛門和口咽）o HPV通過宮頸鱗腺交界處感染基底細(xì)胞o 或HPV通過微創(chuàng)傷直接感染基底細(xì)胞HPV 檢測及預(yù)后預(yù)測價值o 陰性預(yù)測價值(NPV)約 99%n women not infected with HR-HPV have 1% chance to have HSIL lesiono 陽性預(yù)測價值(PPV) 根據(jù)患者的年齡:n 30: PPV gradually increased wit

12、h age and persistent HPV infection原為雜交法o 用標(biāo)記的HPV探針在組織上或細(xì)胞上進(jìn)行原位的雜交，并進(jìn)行顯色o 特異性最強(qiáng)o 敏感性高o 直觀o 可結(jié)合組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)形態(tài)o 探針有：6/11, 16/18, 31/33導(dǎo)流雜交法o 擴(kuò)增所取樣本的DNAo 放在固定好基因探針的基因芯片上（21種亞型包括13種高危亞型16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59,68及5種低危亞型6, 11, 42, 43,44和3種中國人群常見的亞型53,66,CP8304型進(jìn)行雜交o 探針標(biāo)記Biotin及堿磷酶o 用NBT/B

13、CIP進(jìn)行顯色o 結(jié)果呈藍(lán)紫色o判定標(biāo)準(zhǔn)判定標(biāo)準(zhǔn)RLU/CutoffRLU/Cutoff 的比值的比值 n 1 = 1 = 陽性陽性, 50, 50以內(nèi)的數(shù)值對病情的嚴(yán)重程度并沒有指示性，以內(nèi)的數(shù)值對病情的嚴(yán)重程度并沒有指示性，但但5050的數(shù)值對病情的嚴(yán)重程度的估計有指導(dǎo)意義。的數(shù)值對病情的嚴(yán)重程度的估計有指導(dǎo)意義。n 1 =1 =陰性，表示未檢出陰性，表示未檢出1313種高危型種高危型HPV DNAHPV DNA序列或標(biāo)本中不含序列或標(biāo)本中不含有高危型有高危型HPV DNAHPV DNA序列，又或者其濃度水平在測定方法的檢測限序列，又或者其濃度水平在測定方法的檢測限度以下，不能除外潛伏感染

14、；度以下，不能除外潛伏感染；n 如果接近但小于如果接近但小于1.01.0且被懷疑有高危型且被懷疑有高危型HPVHPV感染，應(yīng)該重新采集感染，應(yīng)該重新采集標(biāo)本。標(biāo)本。 HC-II的應(yīng)用條件o HPV test 不適用的情況：n 細(xì)胞學(xué)顯示異型增生時n 年齡30歲的女性,細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)合HPV testHPV檢測方法的比較原位雜交導(dǎo)流雜交基因捕獲HC-II原理在原位進(jìn)行HPV DNA的雜交提取DNA進(jìn)行PCR，進(jìn)行膜雜交DNA分解，DNA-RNA雜交，抗體捕獲，特點(diǎn)組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)涂片上原位顯示分型HPV具體分型顯示HPV,無病毒負(fù)荷的提示只顯示高危病毒感染，不具體分型，可提示病毒的負(fù)荷敏感性及特異性

15、敏感性+特異性+敏感性+特異性+敏感性+特異性+取材組織或細(xì)胞涂片陰道分泌物陰道分泌物生物傳感器技術(shù)o 24種HPV亞型，其中低危8種（ 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 70 ），高危16種（ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68 ,81 ）o 可檢測HPV的載量o 子宮頸細(xì)胞中HPV的情況 單獨(dú)感染 混合感染（2、3，6種HPV型）子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染HPV檢出率1(導(dǎo)流雜交）病毒種類1HR-HPV檢出率2（HC-II)尖銳濕疣92%6,11,31,52低級別CIN89%16,31

16、,18,52,33,6,1174.93%高級別CIN100%16,33,52,1891.72%鱗狀上皮增生33%6,11,16,1843.29%1.北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科2.解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科CIN中需注意的問題o CIN病變也可表現(xiàn)為鱗狀上皮的表面上皮顯著的不典型增生，而非基底層細(xì)胞，是CINI的病理基礎(chǔ)o CIN病變累及腺體n 一般：鱗狀上皮CINIII，進(jìn)一步向下發(fā)展延伸至腺體，但未突破基底膜n 少數(shù)：鱗狀上皮CINII，腺體鱗化也呈CINII，這時為表達(dá)腺體的改變，診斷為CINII累及腺體n 個別：在腺體鱗化的基礎(chǔ)上出現(xiàn)不典型增生，甚至出現(xiàn)的不典型增生的程度超過表面鱗狀上皮絕大多數(shù)的HP

17、V感染可回退Cancer持續(xù)性HPV感染導(dǎo)致CIN2-3 o LSIL LSIL 一般由瞬間一般由瞬間HPVHPV感染引起感染引起o HSIL HSIL 發(fā)生在那些持續(xù)性發(fā)生在那些持續(xù)性HR-HPVHR-HPV感染感染2 2年以上的年以上的患者患者o 大多數(shù)年輕的女性大多數(shù)年輕的女性(30 yrs)(30 yrs)的的HPVHPV感染為暫時感染為暫時性的，將被自體免疫系統(tǒng)清除性的，將被自體免疫系統(tǒng)清除o HPVHPV持續(xù)性感染一般發(fā)生在老年女性持續(xù)性感染一般發(fā)生在老年女性HPV感染與機(jī)體免疫反應(yīng)o 陰道分泌物的粘液抗微生物多肽，抗體，酸性環(huán)境及鋅離子等組成第一道防線o 子宮頸鱗狀上皮（復(fù)層上皮

18、）形成天然屏障，組成第二道防線o 內(nèi)在的非特異性免疫防御系統(tǒng)即炎癥反應(yīng)，構(gòu)成第三道防線o 局部的細(xì)胞免疫監(jiān)視，可啟動接觸性級連反應(yīng)，放大傳遞信號，形成針對殼蛋白L1的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)o 大多數(shù)的HPV感染細(xì)胞將成為HPVL1抗原遞呈細(xì)胞；細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和輔助T淋巴細(xì)胞可識別此細(xì)胞，并通過免疫監(jiān)視和免疫清除殺滅細(xì)胞CytoReacto 用敏感的非同位素核酸雜交和免疫組織化學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測子宮頸細(xì)胞中HPV L1 蛋白的存在，可用于細(xì)胞學(xué)涂片，組織學(xué)切片的檢測。o 廣譜的HPV L1抗體可識別大多數(shù)的HPV L1蛋白（ 6, 11, 16, 18, 31, 33, 42, 51, 5

19、2, 56，58）。 基本原理特點(diǎn)o 多聚物微球結(jié)合非同位素標(biāo)記HPVL1DNA探針與多聚酶混合物（固態(tài)雜交液）o 解鏈及雜交過程與抗原修復(fù)過程合并o 標(biāo)記物為堿性磷酸酶，底物為AECo 原為雜交與免疫組化反應(yīng)顏色重疊，提高敏感性20-30倍o 可檢測出0.01pgHPV L1蛋白o(hù) 細(xì)胞核陽性表達(dá)（核膜及核）o HPV L1HPV L1的存在表明的存在表明HPVHPV病毒感染處于游離狀病毒感染處于游離狀態(tài)或瞬時感染期態(tài)或瞬時感染期o 在在 HPV(+) HPV(+) 的病人中，的病人中，HPV L1HPV L1的缺失，提的缺失，提示存在示存在HPVHPV的持續(xù)感染，并有向高級別的持續(xù)感染，并

20、有向高級別CINCIN發(fā)展的趨勢發(fā)展的趨勢HPV L1檢測的臨床意義 p16檢測的意義o p16是cyclin依賴性激酶抑制劑，抑癌基因，可抑制CDK4、CDK6活性，降低RB的磷酸化，增強(qiáng)RB的功能，抑制E2F-1的釋放，從而抑制細(xì)胞周期o E7結(jié)合RB，釋放E2F-1，促使細(xì)胞周期o E2F-1的聚集（RB的磷酸化的結(jié)果）導(dǎo)致p16的增加o p16的高表達(dá)提示HPVE7的存在小小 結(jié)結(jié)o臨床常用的HPV檢測方法（HC-II，導(dǎo)流雜交）n陰道小環(huán)境的HPV感染狀況n間接代表子宮頸HPV感染狀況n不知HPV的生物學(xué)存在狀況o生物傳感儀檢測子宮頸組織和細(xì)胞中的HPV類型oTERC基因擴(kuò)增表明細(xì)胞

21、的增殖活性增強(qiáng)，提示病變向惡性發(fā)展的原動力存在op16的檢測可提示HR-HPV感染，并整合宿主DNAo子宮頸組織和細(xì)胞中HPV L1檢測陽性，提示機(jī)體免疫可清除HPV病毒感染細(xì)胞，使CIN病變向良性發(fā)展u 液基薄層細(xì)胞制片技術(shù)n真空負(fù)壓吸引，膜式采集技術(shù)n重力沉降技術(shù)n離心沉降技術(shù)n其他u 特點(diǎn)：n標(biāo)本保存時間長，更完整，結(jié)構(gòu)更清晰n細(xì)胞數(shù)量更多n細(xì)胞平鋪，不重疊n更利于觀察，不易漏觀察n可重復(fù)制片u應(yīng)用范圍：1.子宮頸細(xì)胞學(xué)檢查2.體液細(xì)胞學(xué)檢查（胸腔積液、腹腔積液、尿液、腦脊液及灌洗液等）3.分泌物細(xì)胞學(xué)檢查（痰液）u優(yōu)勢：明顯提高陽性細(xì)胞檢出率u前提：具備豐富診斷經(jīng)驗的病理醫(yī)師是關(guān)鍵國外

22、細(xì)胞學(xué)醫(yī)師需要獲得醫(yī)師資格證、病理醫(yī)師資格證以后，再經(jīng)過2-3年的?？婆嘤?xùn)才能從事細(xì)胞學(xué)診斷，并擔(dān)負(fù)相應(yīng)法律責(zé)任國內(nèi)正在規(guī)范，從事細(xì)胞學(xué)診斷必須有醫(yī)師資格證并注冊到病理診斷o 1988年，美國國家癌癥研究所在馬利蘭州的Bethesda召開了病理細(xì)胞學(xué)會議，提出子宮頸細(xì)胞學(xué)報告的新分類，即Bethesda報告系統(tǒng)（The Bethesda System,TBS）The Bethesda system for Reporting Cervical Cytology(TBS)o根據(jù)根據(jù)20012001年第三屆國際年第三屆國際BethesdaBethesda工作會議要求工作會議要求o由著名細(xì)胞病理學(xué)家由著名細(xì)胞病理學(xué)家SolomonSolomon和和NayarNayar編著編著