蛋白質、多肽的氨基酸組成及序列分析

1、第十章 蛋白質、多肽的氨基酸組成及序列分析氨基酸是組成肽和蛋白質的基本單位,也是生物體維持生長所必需的營養(yǎng)物質，它們參與機體的代謝過程，具有廣泛的生物活性和特殊的生理功能。在對肽和蛋白質的結構和功能進行研究時，往往需要將其進行完全水解，測定其氨基酸的組成；生物體內游離氨基酸在神經信息傳遞、代謝的調節(jié)以及肽、蛋白質的合成等生理過程中起著重要作用，為了了解其生理功能及某些外源性刺激對其功能的影響，也需要對生物體液、細胞或組織內的游離氨基酸進行分析。除了氨基酸總量測定外，往往更需要對個別氨基酸進行分析。常用的氨基酸分析方法可歸納為兩類：衍生化間接分析法和無需衍生化的直接分析法。蛋白質的一級結構即蛋白

2、質中多肽鏈中氨基酸的排列順序，既是研究蛋白質分子高級結構和功能的基礎，又有助于蛋白質的基因結構的研究。在某些特定情況下，基因突變常常導致蛋白質中氨基酸的序列發(fā)生改變，從而引起功能失調和疾病產生。因此，測定蛋白質的氨基酸序列對新的診斷學方法開發(fā)、新的治療方法建立以及多肽類藥物的研究均有重要的意義。10. 1 氨基酸的衍生化間接分析法無論是游離氨基酸還是水解氨基酸的測定，由于多數(shù)氨基酸都缺少結構檢測特征，既無紫外吸收，又無熒光，必須使之衍生，轉化為具有紫外可見光吸收或能產生熒光的物質才能檢測分析。10. 1. 1 氨基酸的衍生化反應為了使測定氨基酸的方法靈敏度高，分辨率好，氨基酸的衍生化是關鍵步驟

3、之一。近年來人們致力于開發(fā)靈敏度高、衍生操作簡單、形成的氨基酸衍生物穩(wěn)定的衍生化試劑。常見的衍生化試劑有茚三酮、鄰苯二甲醛（OPA）、丹酰氯（Dansyl-Cl）、異硫氫苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）等。茚三酮在酸性（pH = 3 4）和加熱條件下與氨基酸反應生成氨、二氧化碳和藍紫色的復合物（最大吸收波長為570 nm）：(10.1)除了a-氨基酸外，其它的氨基酸也可生成有色物質，但無二氧化碳生成，b-，g-，d-和e-氨基酸比a-氨基酸反應慢得多，生成的是藍色物質，而亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）與茚三酮反應形成黃色化合物（最大吸收波長為440 nm）。氨基酸與茚三酮的反應主

4、要用于柱后衍生，也可用于氨基酸的比色分析，是公認的氨基酸總量的定量方法。在定量分析時，必須除去對測定有干擾的蛋白質、氨和尿素。鄰苯二甲醛（OPA）與巰基試劑，通常與b-巰基乙醇連用，在堿性條件下與第一級氨基酸迅速反應生成1硫代2烷基異吲哚，加成物可產生熒光，在紫外區(qū)也有較強的吸收，反應式如下： (10.2)該反應不僅適用于柱前衍生，也適用于柱后衍生，它既可進行高靈敏度的熒光檢測（lex = 340 nm ，lem = 450 nm），檢測限達mol L-1，也可進行一般的紫外檢測（最大吸收波長為230 nm），檢測限達5mol L-1。紫外檢測的線性范圍為10 200 pmol，熒光為0.8

5、15 pmol，OPA本身不干擾分離和檢測，不必除去過量試劑，色譜圖基線也比較平穩(wěn)。OPA法主要的缺點是：（1）亞氨基酸不能與其直接反應，需先氧化（如用次氯酸鈉）開環(huán)后才能反應。（2）熒光產物不穩(wěn)定。丹酰氯（Dansyl-Cl）在堿性條件下與氨基酸反應生成強熒光物質，它同一級、二級氨基酸都能起反應，但是反應速率比較慢，在室溫條件下需35 min左右，反應產物的轉化率與反應時間關系較大，反應溫度升高可以加速產物轉化，但最高不可超過60，否則Dansyl-Cl會發(fā)生水解，反而使產物轉化率降低。(10.3)Dansyl-氨基酸在酸性條件下（pH = 2 3）一般可被乙酸乙酯抽提，大量的Dansyl-

6、Cl的反應副產物Dansyl-OH留在水相，干擾因素減小。但是Dansyl-精氨酸、Dansyl-天冬氨酸、Dansyl-谷氨酸、Dansyl-絲氨酸和Dansyl-蘇氨酸則大部分或部分留在水相，往往會被遺漏，而導致錯誤結論。Dansyl-Cl法的檢測限與OPA法相當，線形范圍一般在15 150 pmol。優(yōu)點是（1）衍生物比較穩(wěn)定，一般可放置12 24 h；（2）Dansyl-Cl胱氨酸衍生物線性關系好，可用于體液中胱氨酸的定量測定。缺點是（1）反應時間必須嚴格控制；（2）衍生物對紫外光照比較敏感，故反應要在避光條件下進行；（3）易生成多級衍生物，如賴氨酸、組氨酸、色氨酸生成二級衍生物。異硫

7、氰苯酯（PITC）可以和一級、二級氨基酸反應，在室溫條件下僅十分鐘即可完成，反應產物具有紫外吸收（最大吸收波長為254 nm）。PITC的衍生物單一、穩(wěn)定，-20 可貯存數(shù)月，4 水溶液可保存3天; 分析時間短,結果準確,紫外檢測限可達1 pmol。(10.4)PITC法最大的缺點就是氨基酸衍生時需要真空干燥以除去過量試劑。氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）能與一級、二級氨基酸的氨基反應，生成的衍生物可用熒光檢測（lex = 260 nm，lem = 310 nm），F(xiàn)MOC-Cl與氨基酸反應迅速，實溫下約30s即可完成。反應產物穩(wěn)定，在4 避光條件下可儲存13天，在酸性條件下也可穩(wěn)定30小時以上

8、。反應有很高的靈敏度，檢測極限為1 pmol，色譜分離中有很好的分辨率和分離速度。該法最大的優(yōu)點是不受樣品基質的干擾。(10.5)FMOC-Cl法最大的缺點是（1）與His形成單、雙衍生物的比例不穩(wěn)定，影響定量。（2）FMOC-Cl在衍生過程中易產生試劑的水解反應，過量的FMOC-Cl及其水解產物均有和FMOC-氨基酸類似的熒光，可用戊烷抽提去除干擾，但抽提效率約為70%，只能除去部分干擾；另一種方法是采用1-氨基金剛烷與過量的FMOC-Cl試劑反應，生成的衍生物可在全部氨基酸衍生物之后出峰，這就排除了試劑峰的干擾。2、4二硝基氟苯（FDBN）在堿性條件下（pH = 9.5）與氨基酸或肽的游離

9、氨基反應生成黃色的二硝基苯酚（DNP）的衍生物。反應速率較慢，在50暗處需要60分鐘左右。DNP-衍生物避光條件下比較穩(wěn)定，在室溫避光條件下可保存7天，在4條件下可保存30天。FDBN能與一級、二級氨基酸反應，DNP-衍生物的檢測波長為360 nm, 最小檢出量可達10 pmol。不足之處是與谷氨酸的衍生化反應較慢。(10.6)熒光胺本身沒有熒光，但是在堿性條件下，它與伯胺反應形成具有熒光的產物（最大激發(fā)波長為390 nm，最大發(fā)射光波長475 nm），衍生化產物的熒光強度決定于反應系統(tǒng)的pH值，在pH = 9時，熒光最強，而在pH = 7.4時，只有很低的熒光強度。由于這一反應在室溫條件下幾

10、秒內即可完成，而過剩的試劑在幾秒鐘內就會被分解，不干擾測定。由于熒光胺在水溶液中不穩(wěn)定，必須用丙酮配制。熒光胺不能與仲胺如脯氨酸和羥脯氨酸反應，除非他們與N-氯代琥珀酰亞胺作用轉變?yōu)椴贰?10.7)伯胺 熒光胺（無熒光） 熒光產物熒光黃異硫氰酸苯酯（FITC），在pH 9 10范圍內與一、二級氨基酸在室溫條件下避光反應12 h，生成具有熒光的產物（最大激發(fā)光波長為490 nm，最大發(fā)射光波長為518 nm）。過量的試劑不干擾分離，反應液可直接進樣分析。衍生化產物單一、穩(wěn)定，在室溫條件下可放置一天。 (10.8) FIC-氨基酸6氨基喹啉基N羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯（ACQ），在pH 8.2 1

11、0.0范圍內與一、二級氨基酸迅速反應（除了Tyr需加熱到50），生成的衍生物具有紫外吸收（最大吸收波長為 248 nm）和熒光（lex/lem = 245 nm /395 nm），過量的試劑將快速水解，衍生化產物單一、穩(wěn)定，在室溫條件下可放置一周，在4條件下可保存兩周。反應液可直接進樣分析。紫外檢測的檢測限可達pmol，熒光檢測的檢測限可達40 fmol。(10.9)(10.10)N羥基琥珀酰亞胺3吲哚乙酸酯（SA），是一種較新的衍生化試劑，在pH 8.0 9.5范圍內，室溫條件下與一、二級氨基酸反應1小時左右（低溫對該衍生反應有利，但溫度太低，反應時間過長），生成熒光衍生物（lex/lem

12、= 278 nm / 355 nm），過量試劑不需預先除去，干擾較小，反應液可直接進樣進行色譜分析，檢出限可達pmol。(10.11)氨基酸 SA 衍生氨基酸 NHS還有一些其他的衍生試劑如3對羥基甲酰喹啉2甲醛（CBQCA），試劑本無熒光，在pH 9 左右與一級氨基反應生成穩(wěn)定的強熒光吲哚衍生物（lex/lem為 450 nm/550 nm），冰箱中可保存2周。最低檢測限可達5 fmol。N羥基琥珀酰亞胺奈乙酸酯（SINA）， pH 8.9時與一、二級氨基酸在室溫條件下反應45分鐘生成具有紫外吸收（lmax = 280 nm）的衍生物。該衍生物穩(wěn)定，檢測限可達 pmol。4氟7硝基苯并2、1

13、、3噁二唑（NBD-F）在 pH 8、60條件下與一級和二級氨基反應2 min，然后將pH調至1生成強熒光衍生物（lex/lem為470 nm / 530 nm），最低檢測限可達 fmol。 10. 1. 2 氨基酸的毛細管電泳分析法毛細管電泳(CE)具有微量、靈敏和柱效高的特點，適合于復雜樣品中的氨基酸分析。用于氨基酸分析的毛細管電泳主要采用兩種分離模式：毛細管區(qū)帶電泳和膠束電動毛細管電泳。分離各種氨基酸衍生物的緩沖液常為磷酸、硼酸或混合液，也可在 SDS 膠束溶液中加入甲醇、四氫呋喃或尿素等以改善分離度。除了可進行柱前衍生化，還可以進行柱內和柱后衍生化。檢測方式可用UV檢測，但大部分采用激

14、光誘導熒光檢測器（LIF），激發(fā)/發(fā)射波長常用325 / 550 nm 和488 / 525 nm，可檢測到 amol 甚至 zmol 水平的量。可用于測定肽或蛋白質經 Edman 降解后的氨基酸以及生理氨基酸。人體體液中生理氨基酸的水平及其改變，不僅受年齡營養(yǎng)狀況的影響，而且與某些疾病如肝病、腎病以及先天遺傳代謝性疾病等密切相關。為了研究不同疾病狀況下氨基酸的代謝情況，需要一種快速測定氨基酸方法以滿足其需要。以區(qū)帶毛細管電泳為分離模式的高效毛細管電泳為快速測定血清中氨基酸提供了有效手段1, 見圖10.1。圖10.1 人血清中氨基酸和內標的毛細管電泳圖譜樣品預處理：0.5 ml血清加內標（10

15、 mmol L-1 D-正白酸）20l，加乙腈1.5 ml，渦旋30s，放置10 min后，15000 g離心10 min，上清液備用或置于-20保存。衍生化：待測標本的上清液或氨基酸的標準溶液1 ml，加0.5 mol L-1 pH 9.5硼酸鈉緩沖溶液1 ml，加乙腈1 ml , FDBN 20l，搖勻，在50水浴加熱40分鐘。分離條件：（1）操作緩沖液的組成：0.03 mol L-1 pH 9.8四硼酸鈉緩沖液 異丙醇30% Brij = 82515025。（2）開口石英毛細管：總長度為370 mm，有效長度為300 mm，內徑為75m。（3）電壓：28 KV。（4）溫度：15。（5）進

16、樣：壓力進樣5 s。（6）UV檢測波長：360 nm。該方法在8分鐘內可分離血清中16種氨基酸，如圖101所示，氨基酸的線性范圍10 700 mol L-1，最低檢測限為2.5 7.9 mol L-1，回收率為86.3 107.4%。利用FITC柱前衍生-毛細管電泳-激光誘導熒光測定大鼠大腦皮質氨基酸類神經遞質含量，如圖10.2所示，可用于研究大鼠腦缺血時黃芩甙的藥理作用。結果顯示大腦缺血時，大腦皮質的Glu, Asp, GABA和Gly濃度升高，而黃芩甙可降低Glu和Asp 的濃度，對腦缺血有保護作用2。樣品處理：取大鼠大腦皮質絞碎，以51(w/v)加入15 mmol L-1硼酸緩沖液（pH

17、 9.2）勻漿20 min, 然后加入等體積的氯仿劇烈振搖15 min 去蛋白，20000 rpm 離心20 min，取上清液衍生化（或在-70保存）。衍生化：50 ml去蛋白的樣品，加400 ml的硼酸緩沖液（5 mmol L-1，pH 9.6），加50 l 90 mmol L-1 FITC丙酮溶液，在20 避光反應16小時，進樣前用操作緩沖液10倍稀釋。圖10.2 對照大鼠大腦皮質勻漿的毛細管電泳圖譜分離條件：（1）未涂漬石英毛細管柱，總長度為570 mm，有效長度為500 mm內徑為75 m。（2）毛細管的平衡：用操作緩沖液沖洗前用0.1 mol L-1 NaOH和去離子水沖洗。（3）操

18、作緩沖液的組成：15 mmol L-1硼酸緩沖液（pH為9.2）。（4）電壓：17.5 kV。（5）溫度：25。（6）進樣：采用壓力方式進樣5s。（7）檢測器：488 nm Ar+激光誘導熒光檢測。該方法六種氨基酸的檢測限為2.110-11 6.310-10 mol L-1，回收率為97.1 102.6 %，是一種快速、有選擇性和靈敏的測定大鼠大腦皮層氨基酸類神經遞質含量的方法。10. 1. 3 氨基酸的反相高效液相色譜分析法反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分析衍生化的氨基酸混合物具有分析時間較短、方法靈活多樣、靈敏度高的優(yōu)點。將氨基酸進行柱前衍生的關鍵在于衍生劑的選擇，選擇標準是能與各氨

19、基酸定量反應，每種氨基酸只生成一種衍生物且有一定的穩(wěn)定性，操作簡便，不產生或易于排除干擾物，色譜分離的分辨率高，檢測靈敏度高，分析時間短，便于實現(xiàn)自動化或使衍生物能在不同型號的高效液相色譜儀上測定。衍生后的氨基酸一般在高效烷基鍵合C18或C8柱上，根據(jù)液液分配原理進行分離，流動相多以乙酸鹽或磷酸鹽緩沖液為主，乙醇、甲醇或四氫呋喃為調節(jié)劑。由于氨基酸衍生物仍保留著兩性混合物的特點，故除改變調節(jié)劑外，還可通過調節(jié)緩沖液的pH值，離子強度，柱溫等使之達到理想的分離。當然，不同衍生物所選用的柱型、流動相以及氨基酸的洗脫時間和順序不盡相同。柱前衍生反相高效液相色譜法可用于分析蛋白質水解液、生理體液和食品

20、等樣品中的氨基酸。利用OPA柱前衍生-反相高效相色譜分離-熒光檢測的分析方法測定大鼠腦組織中分區(qū)氨基酸類神經遞質含量，如圖10.3。結果可見興奮性氨基酸，尤其是谷氨酸在腦內的含量相對較高3。圖10.3 大鼠大腦海馬的氨基酸的色譜圖樣品預處理: 分別取大鼠大腦皮質、海馬、小腦和紋狀體，以19 (w/v) 加人生理鹽水，手動玻璃勻漿器冰浴勻漿；勻漿液在3 000 rpm min-1 4低溫離心15 min，取上清液0.5 ml，加0.4 mol L-1高氯酸1 ml 去蛋白，同時加內標高絲氨酸液（Hse, 1 mmol L-1）50 l，混勻，3000 rpm min-1 4 低溫離心15 min

21、，取 0.5 ml上清液，加2 mol L-1 K2CO3溶液1 ml，用 0.1 mol L-1 K2CO3溶液稀釋到5 ml，14000 rpm min-1 4 低溫離心20 min，取上清液衍生化。衍生化反應：將13.4 mg OPA 溶于1 ml無水乙醇中，加入20 l -巰基乙醇，加4 ml 0.1 mol L-1硼酸緩沖溶液（pH 9.6），每日補充20 l -巰基乙醇以維持巰基強度，可使用1周。預處理好的樣品40 l加入OPA衍生液20 l輕輕混勻，室溫靜置2 min，進樣20 l。分析條件：色譜柱為 Hypersil ODS-3（4.6250 mm, 5 m），流動相：磷酸二氫

22、鉀緩沖液(0.1 mol L-1，pH 6.0)甲醇乙腈體積比為631，流速1 ml min-1，柱溫40，熒光檢測激發(fā)波長為340 nm，發(fā)射波長為455 nm。這幾種氨基酸在0.5 40 mol L-1濃度范圍內相關系數(shù)在0.997 0.999之間，具有較好的線形關系。當信噪比為3時，各氨基酸的最小檢測限在0.010.02 mol L-1范圍。10. 1. 4 氨基酸分析儀早在20世紀40年代初，人們便開始用色譜法分析氨基酸。第一臺氨基酸分析儀是spackman、Stein和Moore在1958年以離子交換色譜儀為基礎建立的。此后，該類儀器在關鍵部件以及分析速度、靈敏度和自動化程度上都得到

23、了突飛猛進的發(fā)展。至80年代中，一個蛋白水解液分析只需30分鐘，靈敏度可達pmol級。80年代后液相色譜、特別是鍵合反相分配色譜及柱前衍生技術的發(fā)展又給氨基酸分析儀的發(fā)展注入了新的生機與活力。目前，離子交換色譜在氨基酸分析中仍占主導地位，被國內外公認為最準確可靠的分離測定手段，而柱前衍生高效液譜法也已成熟，進入了實用階段。10. 1. 4. 1 離子交換色譜氨基酸分析儀離子交換色譜氨基酸分析儀又常被稱做專用(自動)氨基酸分析儀。其基本原理是：先將氨基酸混合物在離子交換樹脂柱上分離，然后將分離的氨基酸衍生，根據(jù)衍生產物的特性選擇適當?shù)臋z測器檢測，并進行定性、定量分析。1離子交換樹脂 專用氨基酸分

24、析儀都是以磺酸型強酸性陽離子交換樹脂為柱填料的。該樹脂又是由苯乙烯和二乙烯基苯聚合后磺化而成的。苯乙烯是主要成分，二乙烯苯是交聯(lián)劑，離子交換的活性基團磺酸根即聯(lián)在苯乙烯乙烯基的對位上。交聯(lián)劑的百分含量(交聯(lián)度)影響著樹脂內部網狀結構的孔徑大小，交聯(lián)劑多，分子結構緊密，孔徑就小，適合分離分子量較小的離子。反之，交聯(lián)劑少，網狀結構孔徑大，適合分離分子量大的離子。一般氨基酸分析儀采用的離子交換樹脂交聯(lián)度多為8 12%，目前各國各廠商的離子交換樹脂因所用的二乙烯基苯的純度、類型 (如鄰、對位異構體等)、磺化程度及其范圍雖不盡相同，但均是球狀的，粒度一般在5 10 m之間。2分離 氨基酸屬兩性電解質，其

25、所帶電荷隨pH或離子強度而改變。在酸性溶液中(即pH在等電點以下時)，呈正離子態(tài)，可被離子交換樹脂表面的磺酸基團所吸引而附著在樹脂上，隨pH上升或離子強度增大，吸引力即會下降乃至消失而被洗脫下來。不同的氨基酸等電點、極性及分子大小不同，洗脫順序也不相同。一般酸性和帶羥基的氨基酸先洗脫下來，然后是中性氨基酸，最后是堿性氨基酸。在同類氨基酸中，短碳鏈小分子的先洗脫出來，長碳鏈大分子的后洗脫出來(如甘氨酸先于丙氨酸，纈氨酸先于亮氨酸)。而碳原子數(shù)相同的氨基酸，有支鏈的先洗脫出來(如異亮氨酸先于亮氨酸，亮氨酸先于正亮氨酸)，碳鏈上的羥基基團可加速洗脫(如絲氨酸先于丙氨酸、羧脯氨酸先于脯氨酸、酪氨酸先于

26、苯丙氨酸，羥基賴氨酸先于賴氨酸)。氨基酸分離不僅受離子交換樹脂的型號、交聯(lián)度和粒度的影響，還受色譜柱的長度、截面積、柱溫和洗脫緩沖液的陽離子類型、pH值、離子強度、淋洗梯度、流速以及其中有機溶劑含量的影響。特別需要指出的是洗脫液的陽離子類型，如Na+型緩沖液變化pH值和離子強度等，雖能很好的分離各種蛋白水解氨基酸，卻不能將天門冬酰胺、谷氨酰胺和一些相關的氨基酸分離開來，因此在生理體液分析中除要改變柱長、調節(jié)柱溫外，還必須將Na+緩沖體系改換成Li+緩沖體系。3衍生與檢測常用的衍生法是茚三酮法（紫外檢測）和鄰苯二甲醛法（熒光檢測）。4儀器的結構與流程典型的氨基酸分析儀如日立(Hitachi) 8

27、35或Beckman l2l MB等一般采用3 5種不同pH 值的緩沖液。緩沖液經加熱脫氣后，按時間切換，順序用泵輸送到色譜柱上，使由進樣系統(tǒng)定量注入的氨基酸混合物逐步分離。分離后的氨基酸與另一臺泵輸送出的茚三酮混合，經反應槽加熱完成衍生，進入紫外可見光分光光度計檢測?；蚍蛛x后的氨基酸先與次氯酸鈉混合，氧化開環(huán)后與OPA反應，以熒光計檢測。檢測后得到的信號，放大后再送至記錄儀，積分儀或其它數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。如圖10.4所示。目前生產的氨基酸分析儀多是單柱的，色譜柱有不銹鋼或玻璃的，內徑1.75 5 mm，柱長15 30 cm之間。由于氨基酸的最佳分離應在適當?shù)臏囟龋?0 37 ）才能獲得，故色譜柱

28、通常都裝有循環(huán)水的夾套，由水浴的循環(huán)水控制溫度在0.5 。專用型氨基酸分析儀的發(fā)展主要體現(xiàn)在柱系統(tǒng)的變化和儀器的自動化、電腦化，柱系統(tǒng)的變化首先體現(xiàn)在樹脂粒度的變化，以從20 m 以至3 m。其次內徑縮小，從6 mm降至3 mm乃至1.75 mm，加之高壓泵的設計利用及顯色溫度的提高，使分析靈敏度和速度均有較大的提高，靈敏度以由nmol 級降至pmol級，分析速度提高了5 8倍。儀器的全自動化和電腦化使操作更加方便。8912111076125恒溫6緩沖液1OCl-NaOHOPA(或茚三酮)緩沖液2緩沖液3圖10.4 氨基酸自動分析儀的基本結構與流程1緩沖液脫氣系統(tǒng)；2緩沖液選擇閥；3泵；4壓力

29、表；5進樣器；6色譜柱；7程序儀；8混合室；9反應器；10熒光計或光度計；11記錄儀；12積分儀10. 1. 4. 2 反相色譜氨基酸分析儀專用氨基酸分析儀發(fā)展到20世紀80年代中期，其分析速度與靈敏度進一步的提高，受到樹脂粒度及柱后衍生等的嚴重制約。然而反相鍵合色譜和柱前衍生技術的發(fā)展給氨基酸分析開辟了另一領域。反相色譜分析儀與專門的氨基酸分析儀相比，更靈敏（可達fmol級）、快速（完成一個蛋白水解液分析僅需13 30分鐘）、儀器投資少且可一機多用，目前有不少廠家推出了配套的技術與儀器。1、 儀器結構反相分配色譜測定氨基酸可分為在線衍生或機外衍生兩種類型，但無論那種類型所用儀器均為通用高效液

30、相色譜儀。一般說來，只要有二元泵、高效柱（粒度3-4 m，理論塔板數(shù)70 000），能進行梯度淋洗并有適當?shù)臋z測器（紫外可見光或熒光光度計）即可。表10.1 柱前衍生HPLC各衍生方法的比較 OPA FMOC-Cl PITC FDNB Dansyl 衍生時間（min） 1 30 衍生物穩(wěn)定性 低 高 高 高 較高 與二級胺反應 不 能 能 能 能 衍生操作 很簡單 較復雜 較復雜 較復雜 簡單 去除過量 抽干 不必 不必 需要 需要 不必 試劑 溶劑提取 不必 需要 不必 不必 不必 干擾性副反應 無 無 無 有 有 色譜分析 蛋白水解液 20 25 20 30 20 時間 生理體液 50 7

31、0 60 60 60 檢測 熒光/紫外 熒光/紫外 紫外 紫外 熒光 靈敏度 fmol fmol pmol pmol pmol線形范圍，pmol 0.3 15 0.1 5 50 200 5 200 15 1500 200 5 200CV% 0.4 2.2 1.9 4.6 2.6 5.5 1 3.2 1.5 4.1表10.1列出了一些常用的柱前衍生HPLC法的主要特點。目前不同的儀器廠家所推薦配套的方法各不相同，如Agilent和Gilson公司用OPA-FMOC結合法、LKB公司則由用戶從OPA、FMOC和PITC等法中任選, Waters公司使用的是PITC法(即PICOTAG方法)和Acc

32、QTagTM法。 2 應用4,5 Waters公司PICOTAG氨基酸分析法是由樣品的水解，衍生和分離等條件集結而成。PICOTAG HPLC是由PICOTAG水解衍生工作臺和HPLC系統(tǒng)構成。PICOTAG水解衍生工作臺對樣品的水解和衍生有良好的效果，進行水解時的溫度控制、樣品的干燥、衍生反應試劑的去除、真空操作、氮氣置換等工作。以PITC作為柱前衍生化試劑，采用反相色譜的原理進行氨基酸分析，分離柱為PICOTAG專用柱，用梯度洗脫的方式洗脫，檢測波長為254 nm，蛋白水解的17種氨基酸可在12分鐘內完成分離（見圖10.5所示）。此外，PICOTAG方法靈敏度高，檢出限可達1 pmol。P

33、icoTag方法測定體液游離氨基酸的方法如下:（1）HPLC儀（Waters），510泵，490E全波長可見-紫外檢測器，PICOTAG色譜柱，PICOTAG水解衍生裝置，810色譜工作站。（2）試劑 流動相：A：0.07 mol L-1醋酸鈉，2.5 mmol L-1 EDTA，pH 6.5。B：乙腈水甲醇為4.541.5。內標液：稱取蛋氨酸砜113.2 mg，用25 ml 0.1 mol L-1 HCl稀釋后，再稀釋10倍使內標濃度為2.5 mmol L-1。圖10.5 蛋白質水解后PITC衍生氨基酸樣品250 pmol的分離結果衍生試劑：異硫氰酸苯酯甲醇三乙胺水為1711，臨用前配制。樣

34、品稀釋液：取0.71g磷酸氫二鈉，加超純水溶解至1 000 ml，用10 % 磷酸乙腈液（955）調pH至7.4。（3）標準溶液和體液標本的制備氨基酸混合標樣：取2.5 mmol L-1的酸性、中型氨基酸標樣10 l，2.5 mmol L-1堿性氨基酸標樣10 l，2.5 mmol L-1內標液20 l，加0.1 mmol L-1 HCl 100 l，搖勻。血清標本：取清晨空腹血1 ml，離心后取血清100 l，加入20 l內標液充分混勻，用離心式超濾法除蛋白，超濾液于-20 保存?zhèn)溆?。?）衍生反應：取制備好的氨基酸混合標樣或體液標本20 l，加入20 l 衍生試劑在室溫反應20分鐘，抽干加

35、入100 l樣品稀釋液，充分溶解后直接進樣。 （5）色譜條件：柱溫：46 。流速：1 ml min-1。檢測波長：254 nm。進樣量：10 l。進樣后按照下列程序進行梯度洗脫：時間（min） 0 13.5 24.0 30.0 50.0 62.5 67.0A液（%） 100 97.0 94.0 91.0 66.0 0 100 結果表明：該方法可將血清中常見的游離氨基酸分離，如圖10.6所示。氨基酸濃度在10 1000 mol L-1之間線性關系良好，相關系數(shù)在0.994 0.999之間，信噪比為2時，血清游離氨基酸最低檢測濃度為2 mol L-1。Waters公司的AccQTagTM氨基酸分析

36、法，采用AQC作為柱前衍生試劑，比PICOTAG（R）法快速、靈敏，提高了定量的準確度，水解氨基酸的檢測限低于1 pmol。AccQTagTM氨基酸分析法只需HPLC儀和AccQTagTM化學包（AccQTagTM試劑盒和Nova-PakC18 4 m柱）。采用AccQTagTM法分析水解氨基酸如圖10.7所示。Agilent公司的氨基酸分析方法，運用了可靠的衍生化反應和分析技術。利用自動進樣器實現(xiàn)在線衍生化與HPLC相結合，氨基酸與OPA和FMOC發(fā)生反應，然后進行色譜分析。酸水解后的蛋白質、多肽樣品在pH 10.2的緩沖液中可以直接衍生化。在3巰基丙酸（3-MPA）存在下一級氨基酸首先與O

37、PA反應，二級氨基酸不和OPA反應，然后再用FMOC進行衍生。加入的吲哚與3-MPA相結合可降低氨基酸的疏水性，所以OPA衍生化產物比PMOC衍生化產物的色譜出峰時間更早。過量的FMOC及其降解產物在二級氨基酸后出峰，不會干擾分析，分析過程快速、準確、靈敏且重現(xiàn)性好。圖10.6 血清游離氨基酸色譜圖圖10.7 AccQTagTM法分析水解氨基酸的色譜圖柱：Nova-PakRC18 3.9150 mm, 4 m; 柱溫：37 ；流動相A: AccQTagTM流動相；流動相B：乙腈; 流動相C: 超純水; 流速：1 ml min-1; 梯度：AccQTagTM方法；檢測: 熒光檢測激發(fā)波長為250

38、 nm，發(fā)射波長為395 nm。10. 2 氨基酸直接分析法氨基酸直接分析法是基于陰離子交換分離，積分脈沖安培法檢測，不需將氨基酸進行衍生。1999 年 Clarke 等人發(fā)展了一種積分脈沖安培檢測波形。用積分脈沖安培檢測的高效陰離子交換色譜，無需衍生，可以直接分離測定氨基酸，對大多數(shù)氨基酸的檢測限小于l pmol，線性范圍可以達到3個數(shù)量級以上。10. 2. 1 陰離子交換分離氨基酸具有兩性離子結構，在酸性介質中，以氨基陽離子狀態(tài)存在；在堿性介質中，以羧基陰離子狀態(tài)存在，這就是氨基酸直接分析方法的基礎。氨基酸直接分析用薄殼陰離子交換樹脂為固定相，陰離子交換樹脂含有的堿性基團 N(CH3)3O

39、H (強堿性)或NH3OH (弱堿性)，可以解離出 OH，能與溶液中的氨基酸陰離子發(fā)生交換。氨基酸與樹脂的親合力主要取決于它們之間的靜電吸引，其次是氨基酸烷基側鏈與樹脂基質聚苯乙烯之間的疏水作用和氨基酸的空間構型。在 pH 12 13 條件下，氨基酸與陰離子交換樹脂之間的靜電吸引的大小次序是：酸性氨基酸 中性氨基酸 堿性氨基酸。因此，氨基酸的洗脫順序大體是堿性氨基酸、中性氨基酸和酸性氨基酸。通常堿性溶液為流動相，其中氫氧化鈉不僅提供洗脫離子 OH，而且堿性pH條件也是氨基酸在金電極表面進行氧化反應，實現(xiàn)積分脈沖安培檢測的必須條件。醋酸根離子（Ac）對陰離子交換樹脂的親力大于 OH，是一種較強的

40、洗脫離子，它對于極性較小，保留較強的氨基酸起“推”的作用。10. 2. 1 脈沖積分安培檢測用于氨基酸檢測的安培檢測器通常采用金工作電極、Ag/AgCl參比電極和鈦對電極。在 pH 12 13 溶液中，在金工作電極和 Ag/AgC1 參比電極之間施加一個較高的電位，一氨基酸在金電極表面被氧化，大多數(shù)氨基酸開始先被氧化為亞胺(1)，然后進一步氧化為腈基化合物(2)，另外，少量的亞胺發(fā)生水解生成醛類化合物(3)。反應過程如下：R-CH(NH2)COO一 R-CH=NH + H+ + 2e (10.12)R-CH=NH R-CN + H+ + 2e (10.13)R-CH=NH + H2O R-CH

41、O + NH3 (10.14)氨基酸的脂肪側鏈抑制氨基酸的氧化反應(如亮氨酸和異亮氨酸)，而氨基酸側鏈中的羥基(絲氨酸和蘇氨酸)、酰胺基(天門冬氨酸)和咪唑基(組氨酸)有利于這些氨基酸的氧化反應。在金電極上得到氨基的最大氧化電流所需的電位已超過金表面被氧化的電位。在高電位時，金電極本身形成表面氧化層和氨基酸氧化產物的附著，金電極會很快失效。金電極表面氧化時所產生的電流無疑會增加背景和基線噪音以及基線的不穩(wěn)定性。而脈沖電化學檢測器就解決了這一問題，由三個不同的脈沖電位代替直流安培檢測器中的加于工作電極上的恒定電位。較工作電位高的正電位用來除去金電極上被測成分的氧化產物。由于金電極本身會部分氧化成

42、氧化金，再加一個大的負電位，使氧化金還原到還原狀態(tài)。該脈沖每 0.5 1s 循環(huán)一次。在金電極上得到氨基的最大氧化電流所需的電位超過金表面氧化的電位，金電極表面氧化所產生的電流無疑會增加背景和基線嘈聲以及基線的不穩(wěn)定性。為此，1989年 Johnson 等人6引入了一種新的技術積分脈沖安培。與脈沖安培相似，積分脈沖安培法中加到工作電極上的也是一種自動重復的電位對時間的脈沖電位波形，其不同之處是采樣時的電位不是恒定的，而是在高-低值之間掃描。在高電位時，氨基和金的氧化同時發(fā)生，在高電位時所形成的氧化金在低電位時被還原，因此由積分整個高-低循環(huán)的電流所得到的信號僅僅是被分析成分的信號。檢測氨基酸的

43、積分安培電位波形如圖10.8所示，由六步組成，分為三個區(qū)，E1 和 E2 為吸附/引發(fā)區(qū)；E3 和 E4 為電流積分區(qū)；E5和E6為清洗/活化區(qū)。吸附步驟的施加電壓E1一般為負電位，其大小和持續(xù)時間影響吸附氨基酸的靈敏度，導致吸附氨基酸和非吸附氨基酸的響應因子的擴大，影響堿性氨基酸的線形范圍。必須控制E1的持續(xù)時間，一般小于 40 ms。E2 提供一個可以開始積分而氧又不會被還原的電位。開始積分之前在E2的延遲時間允許充電電流減弱，短的延遲時間可減小由于醋酸鈉梯度所引起的色譜基線改變以及不同氨基酸響應因子的差距，E2 的推薦時間為 60 ms。為了獲得最高靈敏度，亦應為負電位（-0.05 V）

44、，使金電極完全還原，同時氨基酸的吸附在較低的速度下繼續(xù)進行。開始積分時，第一積分電位 E3 上升到足以氧化氨基酸和電極表面被氧化的正電位，應大于 0.20 V，最佳值在 0.25 0.30 V 之間。受金電極氧化的限制，不宜太高，否則背景和噪音將增加。在第二積分電位E4，積分電位由 E3 降到 E4（積分開始前的電位），此時氧化金的還原電荷將抵消金氧化的電荷，氧化金的還原比氧化快，為了實現(xiàn)背景補償，電位 E4（-0.05 V）的時間不必像電位E3 那樣長，總的積分時間約為 450 ms（E3 為 290 ms，E4 為 140 ms）。積分完畢后，立即將電位降至清洗電位 E5（-2V），對電極

45、進行清洗，然后迅速升高電位至活化電位 E6（+0.6 V），再立即回到初始電位 E1，從而完成一次積分周期，總的信號值決定于高低電位之間的電流積分值。時間（s） 電勢（V） 積分0.0 -0.200.04 -0.200.05 -0.050.11 -0.05 開始0.12 +0.280.41 +0.280.42 -0.050.56 -0.05 結束0.57 -2.000.58 -2.000.59 +0.600.60 -0.20圖10.8 測定氨基酸的積分安培電位波形圖10. 2. 2 應用美國Dionex公司的氨基酸直接分析儀的色譜條件如下：分離柱：AminoPac PA10 (250 mm 2

46、 mm i. d)，溫度：30 ，流速：0.25 ml min-1，進樣體積：25 l，檢測方式：積分脈沖安培檢測器（IPAD），Ag/AgCl 參比電極，金工作電極。水解產物中氨基酸分析的梯度洗脫條件如下Time Water 0.25 mol L-1 1.0 mol L-1(min) (%) NaOH (%) NaAc (%) Curve進樣 0.0 90 10 2.0 90 10 5.0 85 15 88.0 64 36 8 11.0 64 36 18.0 40 20 40 21.0 44 16 40 8 23.0 14 16 70 8 42.0 14 16 70 8 42.1 20 80

47、 544.1 20 80 44.2 90 10 574.0 90 10 梯度曲線的形狀是按照美國Dionex公司GS 50 梯度泵的使用手冊No.031612第二稿的定義。此方法已用于分析氨基酸注射液7（用去離子水分別稀釋 l 000倍，經過0.45 m 濾膜過濾），所得色譜圖見圖10.9。氨基酸的檢出限為0.3 10.3 pmol，線性范圍約為2個數(shù)量級,樣品加標回收率為 88.3 104.6。圖10.9 氨基酸注射液樣品 (稀釋1 000倍) 色譜圖1.Arg.2.Lys.3.glucose.4.Ala.5.Thr.6.Gly.7.Val.8.Ser.9.Pro.10.Iso.11.Leu

48、.12.Met.13.His.14.Phe.15.Glu.16 Asp. 17.Cys.18.Tyr.10.3 氨基酸的液質聯(lián)用分析液質聯(lián)用技術已成為分離、鑒定各種化合物的重要手段之一。液質聯(lián)用彌補了傳統(tǒng)液相檢測器的不足，它集 LC 的高分離能力和MS的高靈敏度、高選擇性于一體。液質聯(lián)用技術在分析各種復雜生物基質(全血、血漿、尿、膽汁及生物組織)中的氨基酸時，由于其選擇性強、靈敏度高，不僅可以避免復雜、繁瑣、耗時的樣品前處理工作，而且能分離鑒定以往難于辯識的痕量氨基酸，尤其是串聯(lián)質譜(MS/MS)的應用，通過多反應監(jiān)測(MRM)，可以大大提高分析的專一性，改善信噪比，提高靈敏度。同時，利用碰撞

49、誘導解離(CID)可將化合物的分子離子或準分子離子打碎，通過中性丟失掃描、母離子掃描和子離子掃描，并與原型氨基酸結構信息相比較，即可鑒定出氨基酸代謝產物的結構。甲狀腺素是碘化酪蛋白的主要活性成分，但甲狀腺素并不以游離的方式存在，而是以氨基酸殘基或者以某種特殊的方式膠聯(lián)于碘化酪蛋白中。動物飼喂碘化酪蛋白后能起到間接補充甲狀腺素的作用。動物甲狀腺分泌的甲狀腺素有兩種，即：3，3，5三碘甲腺原氨酸(T3)和3，3，5，5四碘甲腺原氨酸 (T4)。其中T3的活性大約是T4的5倍，但含量較小，通常所說的甲狀腺素是指T4。一碘酪氨酸 (MIT) 和二碘酪氨酸 (DIT) 是甲狀腺素體內合成的前體物質。碘化

50、酪蛋白是我國禁止在動物飼料和飲水中添加和使用的藥物添加劑之一，但缺乏有效的檢測方法。由于碘化酪蛋白并不是一種純物質，直接測定非常困難。在國外衍生氣相色譜法和高效液相色譜法曾依次被用來測定碘化酪蛋白、體液和甲狀腺球蛋白中碘化氨基酸(甲狀腺素)的含量 ，但都缺少相應的確證方法。LC/MS 具有靈敏度高，選擇性強，分離、定量和確證一次完成等特點，使用 LC/MS 技術，通過分離鑒定試樣的水解產物中的三碘甲腺原氨酸和四碘甲腺原氨酸，并以一碘酪氨酸和二碘酪氨酸作為旁證指示碘化酪蛋白的存在，從而為監(jiān)測碘化酪蛋白的使用提供了依據(jù)。樣品制備：取100 mg 碘化酪蛋白于聚四氟乙烯消化管中，加入2 ml 13.

51、5 mol L-1的氫氧化鈉溶液，于振蕩器上輕輕振動使樣品被氫氧化鈉溶液浸透，然后在110 烘箱水解6 h。水解液用等物質的量的乙酸中和，定容于100 ml 容量瓶中，過0.45 m 的濾膜。采用Waters Symmetry Shield RP18 (3.9150 mm, 5 m )，用乙腈 B ( 0.1 的甲酸) 和水 A (0.1的甲酸)為流動相，0.8 ml min-1的流速(柱后分流 0.2 ml min-1進質譜)，B從10到50梯度洗脫 40 min。以選擇離子檢測，見圖l0.108。質譜條件：采用掃描范圍 150 900 amu，毛細管電壓3 kv，脫溶劑氣 300 L h-1，采用正離子( ESI)式檢測，錐孔壓為 40 V。SIR方式檢測均采用準分子離子( M+1 )作為檢測離子。圖10.10 樣品的選擇離子(SIR)色譜圖1. 3 - 一碘