入肝門(mén)靜脈動(dòng)脈化加門(mén)腔分流術(shù)對(duì)大鼠肝臟再生的影響

1、入肝門(mén)靜脈動(dòng)脈化加門(mén)腔分流術(shù)對(duì)大鼠肝臟再生的影響 【摘要】 【目的】 在大鼠70%肝部分切除基礎(chǔ)上建立入肝門(mén)靜脈動(dòng)脈化加門(mén)腔分流術(shù)的模型，并研究大鼠肝臟再生情況?！痉椒ā?155只sprague-dawley大鼠分為3組。實(shí)驗(yàn)組大鼠65只，利用右腎動(dòng)脈行入肝門(mén)靜脈動(dòng)脈化，并行門(mén)腔分流及肝部分切除，肝切組大鼠65只，僅進(jìn)行肝部分切除，對(duì)照組大鼠25只，僅右腎切除。分別觀察實(shí)驗(yàn)組及肝切組術(shù)后2、7、14及28 d殘肝再生比率變化，以及3組在術(shù)中0 h、術(shù)后24、48、72 h及7 d各時(shí)相點(diǎn)殘肝肝臟s期細(xì)胞比例及增殖細(xì)胞核抗原（pcna）陽(yáng)性表達(dá)的肝細(xì)胞比例情況?！窘Y(jié)果】 術(shù)后2、7、14 d兩組

2、肝臟再生比率相比，實(shí)驗(yàn)組較肝切組明顯增高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p 0.05）。術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組及肝切組殘肝s期肝細(xì)胞比例及pcna陽(yáng)性表達(dá)肝細(xì)胞比例均較對(duì)照組明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p 0.01）。實(shí)驗(yàn)組與肝切組相比，術(shù)后24 h殘肝s期細(xì)胞比例及pcna陽(yáng)性細(xì)胞比例均已經(jīng)開(kāi)始升高，至術(shù)后48、72 h及術(shù)后7 d，實(shí)驗(yàn)組仍明顯高于肝切組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p 0.01）?！窘Y(jié)論】 入肝門(mén)靜脈動(dòng)脈化重建入肝血流對(duì)大鼠肝細(xì)胞的增生及增殖有促進(jìn)作用，是預(yù)防肝部分切除術(shù)后急性肝功能衰竭的有效方法。【關(guān)鍵詞】 門(mén)靜脈動(dòng)脈化； 肝切除術(shù)； 再生； 增殖細(xì)胞核抗原abstract： 【ob

3、jective】 extended hepatectomy may result in acute postoperative liver failure， the aim of this study was to assess the effects of portal vein arterialization （pva） associated with portocaval shunt （pcs） on liver regeneration after 70% partial hepatectomy （ph） in a rat model. 【methods】 one hundred an

4、d fifty-five sprague dawley rats were assigned to three groups： pva associated with pcs after 70% ph （experimental group）； 70% ph only （ph group）； right nephrectomy （control group）。 liver regeneration rate （lrr） was assessed on days 2， 7， 14， and 28 after surgery， proliferating cell nuclear antigen

5、（pcna） labeling index， and s phase liver cell rate were assessed on 0 h， 24 h， 48 h， 72 h， and 7 days after surgery， respectively. 【results】 rats with 70% ph following pva + pcs showed significantly greater liver growth than rats with 70% ph only in the first 14 days postoperatively （p 0.01）。 howeve

6、r， no significant difference was found 28 days after surgery between these two groups. the rats with pva + pcs showed the highest values of pcna labeling index and s phase liver cell rates within 7 days， and higher than the other two non-pva groups significantly （p 0.01）。 【conclusions】 the present f

7、indings indicate that pva technique bring beneficial effects on maintaining liver regeneration after extended partial hepatectomy in rats.門(mén)靜脈動(dòng)脈化最初應(yīng)用于肝硬化門(mén)靜脈高壓癥門(mén)體分流術(shù)后預(yù)防肝功能衰竭和肝性腦病的發(fā)生1，以及用于進(jìn)展期肝膽惡性腫瘤行擴(kuò)大肝部分或肝門(mén)部根治性整塊切除后預(yù)防急性肝功能衰竭2，近年來(lái)更多用于肝移植術(shù)中處理門(mén)靜脈栓塞3，但多為動(dòng)物模型研究。已經(jīng)有部分學(xué)者在臨床上實(shí)驗(yàn)性的應(yīng)用了門(mén)靜脈動(dòng)脈化技術(shù)，取得了一定的療效4-5。但對(duì)于門(mén)靜脈動(dòng)

8、脈化對(duì)肝臟細(xì)胞再生的影響如何，至今研究仍較少。為了解門(mén)靜脈動(dòng)脈化對(duì)肝臟細(xì)胞再生影響，結(jié)合之前所建立的利用右腎動(dòng)脈行入肝門(mén)靜脈完全動(dòng)脈化加門(mén)腔分流術(shù)的大鼠模型，我們?cè)诖嘶A(chǔ)上附加肝部分切除，對(duì)大鼠肝臟再生情況進(jìn)行研究，報(bào)道如下。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性sprague-dawley（sd）大鼠共155只，體質(zhì)量250 300 g，分3組：實(shí)驗(yàn)組65只，行右腎切除，利用右腎動(dòng)脈行入肝門(mén)靜脈動(dòng)脈化，門(mén)腔完全分流，再按higgins6方法行70%部分肝（肝左葉 + 中葉）切除；肝切除組65只，行右腎切除 + 70%部分肝（肝左葉 + 中葉）切除；對(duì)照組25只，僅行右腎切除。1.2 入肝門(mén)

9、靜脈動(dòng)脈化模型建立所有大鼠術(shù)前均禁食24 h，不禁水，口罩吸入乙醚麻醉。取腹部正中切口進(jìn)腹，在手術(shù)顯微鏡下，游離門(mén)靜脈上至門(mén)靜脈入肝左右分支處，下至脾靜脈與腸系膜上靜脈匯合處。游離右腎動(dòng)脈、右腎靜脈和右輸尿管，右腎動(dòng)脈由腹主動(dòng)脈開(kāi)口處游離至腎動(dòng)脈分叉以遠(yuǎn)3 mm，并結(jié)扎切斷由腎動(dòng)脈發(fā)出的腎上腺動(dòng)脈。右腎靜脈由下腔靜脈游離至腎門(mén)，游離輸尿管并結(jié)扎切斷。在距腹主動(dòng)脈5 mm處阻斷右腎動(dòng)脈，于右腎動(dòng)脈分叉以遠(yuǎn)2 mm處切斷右腎動(dòng)脈，于右腎靜脈匯入下腔靜脈處阻斷右腎靜脈，距血管夾以遠(yuǎn)2 mm處橫斷右腎靜脈，切除右腎。肝素生理鹽水反復(fù)沖洗各游離的血管腔。將右腎動(dòng)脈從下腔靜脈后方拉至其左前方，并將動(dòng)脈分叉

10、部用顯微組織剪剖開(kāi)并修剪成魚(yú)口狀備用，長(zhǎng)徑約3 4 mm，橫徑約2 mm。在門(mén)靜脈主干分支處和脾靜脈與腸系膜上靜脈匯合處分別用無(wú)損傷血管夾阻斷，在兩血管夾中下三分之一處橫斷門(mén)靜脈。修剪各斷端血管外膜，以備吻合。在10 16倍雙人雙目手術(shù)顯微鏡輔zhu下，用10-0帶針無(wú)創(chuàng)尼龍縫線(xiàn)將入肝門(mén)靜脈主干與右腎動(dòng)脈橢圓形剖面兩定點(diǎn)連續(xù)端端吻合，縫合完畢后依次松開(kāi)入肝門(mén)靜脈主干與右腎動(dòng)脈血管夾，成功將入肝門(mén)靜脈動(dòng)脈化（阻斷時(shí)間8 12 min）。之后用10-0帶針無(wú)創(chuàng)尼龍縫線(xiàn)將右腎靜脈與遠(yuǎn)端門(mén)靜脈主干（脾靜脈與腸系膜上靜脈匯合處）兩定點(diǎn)連續(xù)端端吻合，完畢后松開(kāi)阻斷血管夾，完成門(mén)腔完全分流（阻斷時(shí)間在10

11、12 min）。以雙鑷法證實(shí)吻合口通暢并檢查有無(wú)漏血，若有漏血，可間斷補(bǔ)針。肝部分切除參照higgins6大鼠肝部分切除方法，切除大鼠肝臟的左葉和中葉，切除量占全肝70%。術(shù)畢經(jīng)大鼠尾靜脈注射1 ml生理鹽水，可翻身飲水，1 d后正常飲食，單籠飼養(yǎng)。1.3 指標(biāo)測(cè)定1.3.1 肝臟再生比率的測(cè)定預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)取10只正常大鼠稱(chēng)體質(zhì)量為（261 31） g，切除全肝稱(chēng)濕質(zhì)量，為（10.96 2.24） g，再將肝臟切除左外葉、左內(nèi)葉及中葉稱(chēng)濕質(zhì)量，為（7.13 1.43） g。得出肝切除部分濕質(zhì)量占全肝的（68.4 1.7）%，同時(shí)求得全肝濕質(zhì)量占體質(zhì)量的（4.76 0.34）%。手術(shù)制模前大鼠稱(chēng)質(zhì)量

12、，根據(jù)全肝/體質(zhì)量比例算出全肝理論質(zhì)量，手術(shù)后稱(chēng)取切除之部分肝臟濕質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)組及肝切組分別在術(shù)后2、7、14、28 d取10只大鼠處死后取殘肝標(biāo)本并稱(chēng)取肝濕質(zhì)量。根據(jù)公式計(jì)算肝再生比率： 肝再生率（%） = mc - （ma - mb）/（ma - mb） 100%， 其中ma為大鼠理論全肝質(zhì)量，mb為切除肝質(zhì)量，mc為處死大鼠取標(biāo)本時(shí)的殘余肝質(zhì)量。1.3.2 再生肝s期肝細(xì)胞比例3組各取5只大鼠分別于術(shù)中取1 cm3大小肝組織，術(shù)后6、24、48、72 h和7 d處死后于殘余肝上取部分組織以0.5 g/l膠原酶消化，制作單細(xì)胞懸液，供流式細(xì)胞術(shù)fcm檢測(cè)。使用facs calibur 型流式

13、細(xì)胞儀（美國(guó)becton dickinson公司），用碘化丙啶（pi）定量dna熒光染色法（美國(guó)bd cycletesttm plus dna reagent kit），雞紅細(xì)胞做標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器的cv值在5%以?xún)?nèi)，激光功率為200 w，激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，濾光片波長(zhǎng)620 nm，測(cè)定細(xì)胞熒光信號(hào)。每份樣品檢測(cè)20 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)活細(xì)胞總數(shù)，s期（dna合成期）肝細(xì)胞數(shù)，求出每例樣本s期肝細(xì)胞百分比例 = s期肝細(xì)胞/活細(xì)胞總數(shù) 100%。1.3.3 肝細(xì)胞pcna免疫組化檢測(cè)3組同樣分別于術(shù)中取1 cm3大小肝組織，術(shù)后6、24、48、72 h和7 d處死時(shí)留取肝臟標(biāo)本，均中性甲醛

14、溶液固定、石蠟包埋。連續(xù)切片，厚4 m。切片常規(guī)脫蠟后蒸餾水沖洗5 min;用300 ml/l過(guò)氧化氫孵育30 min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；用10 ml/l正常小牛血清孵育20 min封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶；加一抗（美國(guó) dako公司，pcna pc10 mab）稀釋液（1 50）4 濕盒內(nèi)室溫孵育過(guò)夜，pbs沖洗3次 5 min;加生物素標(biāo)記的二抗（福州邁新公司，kit-0100m，ultra sensitive s-p mouse）室溫孵育30 min;加abc復(fù)合物室溫作用30 min，pbs徹底沖洗；dab顯色液（福州邁新，dab-2031加強(qiáng)型 dab plus kit）染色2 10

15、min，蘇木素輕度復(fù)染；系列酒精脫水，二甲苯透明；樹(shù)膠封片觀察。由兩名病理醫(yī)師雙盲法分別觀察免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，在高倍鏡下（10 40）隨機(jī)觀察4個(gè)視野共1 000個(gè)細(xì)胞，核內(nèi)有棕黃色顆粒沉積者為陽(yáng)性細(xì)胞，取其兩人計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值，用百分率表示pcna陽(yáng)性率。計(jì)算方法：pcna陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比例 = 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù) 100%。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用spss 13.0版軟件，數(shù)據(jù)以x s表示，兩組間計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)采用t檢驗(yàn)， 3組間均數(shù)比較先行單因素方差分析后再行l(wèi)sd-t （least significant difference-t）檢驗(yàn)，??？琢 = 0.05。2 結(jié) 果2.1 殘

16、肝再生率變化實(shí)驗(yàn)組及肝切組術(shù)后肝臟再生率均呈上升趨勢(shì)，術(shù)后2 d至術(shù)后14 d，實(shí)驗(yàn)組肝再生率與對(duì)照組相比明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p 0.05，表1）。2.2 殘肝s期肝細(xì)胞比例變化各組術(shù)后s期肝細(xì)胞比例的變化（表2）。從表中可以看出實(shí)驗(yàn)組及肝切組s期肝細(xì)胞比例的變化，其高峰出現(xiàn)在術(shù)后24 72 h，以后逐漸下降，但到7 d時(shí)仍明顯高于本組0時(shí)相點(diǎn)的水平（p 0.01），說(shuō)明肝細(xì)胞的再生主要發(fā)生在術(shù)后一周。特別是在術(shù)后3 d以?xún)?nèi)，是肝細(xì)胞再生的關(guān)鍵時(shí)期。三組在術(shù)后各個(gè)時(shí)相點(diǎn)總體均數(shù)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（f = 23.82，p 0.01）。其中實(shí)驗(yàn)組與肝切除組相比，在術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)均有明顯升高，

17、差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p 0.01）。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組與肝切組術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)s期肝細(xì)胞含量均明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p 0.01）。2.3 pcna陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比例變化對(duì)照組pcna表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞比例在3%左右。實(shí)驗(yàn)組及肝切組術(shù)后24 h陽(yáng)性細(xì)胞比例已經(jīng)明顯增高，至72 h達(dá)到高峰，此后逐漸下降，但仍明顯高于本組0時(shí)相點(diǎn)水平，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p 0.01），表明術(shù)后1周細(xì)胞仍持續(xù)增殖。兩組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比，pcna陽(yáng)性細(xì)胞比例均明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p 0.01），而實(shí)驗(yàn)組pcna陽(yáng)性細(xì)胞比例與肝切組比較，從術(shù)后24 h至術(shù)后7 d，各時(shí)間點(diǎn)相比較，實(shí)驗(yàn)組均明顯

18、高于肝切組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p 0.01，表3;圖1）。3 討 論肝臟作為體內(nèi)血流最豐富的器官，有肝動(dòng)脈及門(mén)靜脈雙重血供，約75%的血液供應(yīng)來(lái)自乏氧的門(mén)靜脈。以往一直認(rèn)為，門(mén)靜脈血中的肝臟營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)肝細(xì)胞的再生及增殖是必不可少的，但早在1952年，cohn等就最早提出用動(dòng)脈血代替門(mén)脈血灌注肝臟的設(shè)想，隨后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，以適當(dāng)壓力和流量的動(dòng)脈血灌注肝臟，可使分流后的動(dòng)物維持正常肝血流量，促使肝細(xì)胞再生，保證正常肝臟的解毒功能。張紅衛(wèi)等7在肝硬化大鼠行部分門(mén)靜脈結(jié)扎后發(fā)現(xiàn)，非結(jié)扎的相應(yīng)肝葉代償增生，可提高期肝切除手術(shù)的范圍。近年來(lái)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示8，在擴(kuò)大部分肝切除的模型中，采用門(mén)靜脈

19、動(dòng)脈化的技術(shù)增加肝臟氧供及血流，能有效促進(jìn)肝細(xì)胞的增生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，在完全門(mén)腔分流后行入肝門(mén)靜脈動(dòng)脈化，肝臟雖然沒(méi)有靜脈血的灌注，但充分的動(dòng)脈血供能有效促進(jìn)肝細(xì)胞再生，尤其是在術(shù)后1周內(nèi)，肝細(xì)胞再生相關(guān)指標(biāo)如s期肝細(xì)胞比例及肝細(xì)胞pcna表達(dá)的比例均較單純肝切除者明顯升高，與國(guó)外部分學(xué)者研究結(jié)果相符。陳永亮等9-10研究表明肝臟部分切除后不論是在正?；蚬Ｗ栊渣S疸后再通的大鼠還是在同時(shí)行門(mén)靜脈動(dòng)脈化的大鼠，術(shù)后肝質(zhì)量的測(cè)定、有絲分裂期肝細(xì)胞的計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞儀對(duì)各期dna含量的檢測(cè)均表明肝細(xì)胞再生非常明顯而且比較相似，說(shuō)明門(mén)靜脈血的供應(yīng)對(duì)肝臟的再生并不是必須的，門(mén)靜脈動(dòng)脈化后不影響肝臟的再生

20、。王鵬等11利用胃十二指腸動(dòng)脈與門(mén)靜脈行端側(cè)吻合術(shù)加肝左外葉切除犬只模型研究門(mén)靜脈動(dòng)脈化對(duì)肝硬化犬肝切除后肝再生結(jié)果表明，pcna表達(dá)增強(qiáng)，門(mén)靜脈動(dòng)脈化對(duì)肝細(xì)胞的再生有促進(jìn)作用。fan等8用部分肝切除大鼠模型研究門(mén)靜脈動(dòng)脈化后肝臟再生情況的結(jié)果表明，充足的肝血流量是肝再生的前提因素，在門(mén)靜脈血流量相同的情況下，無(wú)論是靜脈血還是動(dòng)脈血均能保證肝臟的正常再生能力。而我們的殘肝再生率的研究結(jié)果亦表明，在術(shù)后28 d內(nèi)，相對(duì)單純肝切除，附加入肝門(mén)靜脈化能顯著提高殘肝的增生及肝臟重量，這對(duì)于擴(kuò)大的部分肝切除術(shù)后預(yù)防和減少術(shù)后早期發(fā)生急性肝功能衰竭有著重要意義。門(mén)靜脈動(dòng)脈化主要機(jī)制是通過(guò)動(dòng)脈血強(qiáng)化灌注門(mén)靜

21、脈，增加門(mén)靜脈的壓力和改善肝臟缺血、缺氧。肝細(xì)胞主要由線(xiàn)粒體的呼吸鏈供能，其作用約消耗肝臟90%的供氧，而肝細(xì)胞再生的啟動(dòng)有賴(lài)于白細(xì)胞介素-6及腫瘤壞死因子-?琢等因子表達(dá)增加12。因此，穩(wěn)定的氧供對(duì)肝臟能量代謝非常重要。在門(mén)靜脈動(dòng)脈化后，富含氧供和高流量血供對(duì)肝臟的灌注能有效促進(jìn)肝細(xì)胞再生及增殖，另一方面，結(jié)合完全性的門(mén)腔分流，有效避免了門(mén)靜脈屬支壓力升高而引起的消化道靜脈曲張出血。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，門(mén)靜脈動(dòng)脈化對(duì)肝臟再生具有促進(jìn)作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】maillard jn， benhamou jp， rueff b， et al. arterialization of the liver with

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