腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生的非線性光譜學(xué)成像

1、腫瘤細(xì)胞DNA樣品基于二次諧波發(fā)生（SHG）的非線性光譜學(xué)成像羅冬梅1，鄧小元1，卓雙木2，譚淑雯1，莊正飛1，金鷹1*（1.華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，廣州510631；2.福建師范大學(xué)醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350007）摘 要：二次諧波的產(chǎn)生是一個(gè)二階非線性光學(xué)過(guò)程，這個(gè)過(guò)程只發(fā)生在中心對(duì)稱系數(shù)不為零的非中心對(duì)稱區(qū)域。利用二次諧波顯微技術(shù)可以對(duì)各種具有內(nèi)源性信號(hào)的生物組織進(jìn)行無(wú)損傷實(shí)時(shí)成像，如結(jié)締組織的膠原纖維或肌細(xì)胞的肌動(dòng)球蛋白。在生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)中，雖然DNA是由脫氧核糖核苷酸構(gòu)成而蛋白質(zhì)是由氨基酸殘基組成，但是DNA和蛋白質(zhì)大分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成機(jī)制是相似的。本文利用

2、光譜學(xué)成像技術(shù)對(duì)不同DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)獲取DNA樣品的SHG信號(hào)并進(jìn)行高解析度成像。這些DNA樣品包括基因組DNA溶液、細(xì)胞核提取物以及培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在常規(guī)條件下可以獲得基因組DNA溶液和細(xì)胞核提取物的SHG信號(hào)，但幾乎觀測(cè)不到來(lái)自培養(yǎng)細(xì)胞核區(qū)的SHG信號(hào)。通過(guò)在培養(yǎng)基中添加少量無(wú)水乙醇（體積比小于5%），可以在培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)域檢測(cè)到SHG信號(hào)。我們推測(cè)在培養(yǎng)細(xì)胞中乙醇和DNA相互作用引起DNA分子構(gòu)象發(fā)生變化，這些變化可能導(dǎo)致了DNA分子非線性光學(xué)性質(zhì)的改變。關(guān)鍵詞：二次諧波發(fā)生；基因組DNA；細(xì)胞核提取物；培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞；乙醇中圖分類號(hào)：O 433; Q 523文獻(xiàn)標(biāo)

3、識(shí)碼：ANonlinear spectral imaging of DNA specimens derived from tumor cells based on second harmonic generationLuo Dong-Mei1, Deng Xiao-Yuan1, Zhuo Shuang-Mu2, Tan Shu-wen1, Zhuang Zheng-Fei1, Jin Ying1*(1. College of Biophotonics of South China Normal University, Guangzhou 510631, China;2. Key Laborat

4、ory of Optoelectronic Science and Technology for Medicine of Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China)Abstract: Second harmonic generation (SHG) is a second-order nonlinear optical process that has symmetry constraints confining signal to regions lacking a center of symmetry. Using SHG microsc

5、opy, a variety of tissue structures have noninvasively been imaged by virtue of intrinsic signal generated by structured proteins such as collagen fibrils in connective tissues or the actomyosin lattice of muscle cells. In biochemistry and structure biology, the high-level structures of DNA and prot

6、ein macro-molecules are similar in constructing mechanism, although DNAs consist of deoxynucleotides and proteins of amino acid residues. The principal purpose of present work is to detect the SHG signal from different DNA samples by spectral imaging technology based on two-photon excited fluorescen

7、ce (TPEF) and SHG. These DNA samples include the solution of genomic DNA and extracted nuclei, and cultured living cells. Results show that we can obtain the SHG signal from solution of genomic DNA and extracted nuclei in routine condition, but nothing from cultured cell nuclei. After adding a littl

8、e of absolute ethanol (less than 5% by volume) in culture medium, the SHG signal is detectable in the interest region of nuclei. The findings suggest that the interaction between ethanol and DNA in living cell gives rise to the shift of molecular conformation, and this shift change some nonlinear op

9、tical properties of DNA molecules.Key words: Second harmonic generation; genomic DNA; extracted nuclei; cultured tumor cell; ethanol雙光子激發(fā)熒光成像（Two-photon excited fluorescence imaging，TPEF）1是上世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種非線性顯微成像技術(shù)，它是一種基于細(xì)胞或生物組織中熒光團(tuán)對(duì)兩個(gè)光子（具有雙倍于單光子激發(fā)波長(zhǎng)）的同時(shí)吸收然后再發(fā)射的成像過(guò)程。由于雙光子激發(fā)只發(fā)生在焦點(diǎn)附近的極小區(qū)域，故無(wú)需共焦小孔（confoc

10、al pinhole）即可實(shí)現(xiàn)三維高分辨成像，可降低在光學(xué)成像中的熒光漂白效應(yīng)，減少光化學(xué)毒性。其成像可采用近紅外的超快激光作為光源，組織吸收和散色效應(yīng)小，具有成像深度深、對(duì)生物體損傷小、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。雖然TPEF成像具有一系列優(yōu)點(diǎn)，但它仍不能消除焦點(diǎn)內(nèi)生物組織的光漂白和光損傷。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的二次諧波（Second harmonic generation, SHG）2成像技術(shù)克服了這一缺點(diǎn)，它利用超快激光脈沖與介質(zhì)相互作用產(chǎn)生的倍頻相干輻射作為圖像信號(hào)來(lái)源，具有高分辨、高對(duì)比度的三維成像能力。在成像質(zhì)量和光損方面有了顯著提高，是一種理想的非侵入生物活體的成像方法。其成像過(guò)程中無(wú)能量吸收，對(duì)

11、生物體無(wú)光損傷和光致毒，且生物組織的許多內(nèi)在結(jié)構(gòu)無(wú)需外加分子探針即可產(chǎn)生較強(qiáng)的SHG信號(hào)，可消除染料致毒的影響。同時(shí)，二次諧波顯微鏡不受前向發(fā)射性質(zhì)的限制，可以兩個(gè)方向收集信號(hào)，因此很容易與雙光子激發(fā)熒光顯微鏡TPEF、OCT（Optical coherence tomography）等聯(lián)合使用，進(jìn)行成像比較，實(shí)現(xiàn)信號(hào)互補(bǔ)。SHG和TPEF的激發(fā)強(qiáng)度與激發(fā)光的平方成正比，兩種顯微方法的空間分辨率相當(dāng)，意味著能夠從同一裝置上得到這兩種信號(hào)的對(duì)照模式，除了使用不同的濾光片外，二次諧波顯微成像和雙光子激發(fā)熒光顯微成像在系統(tǒng)結(jié)構(gòu)上完全兼容。近年來(lái)，二次諧波-雙光子（SHG-TPEF）聯(lián)合成像技術(shù)已經(jīng)被

12、廣泛應(yīng)用于生物組織和細(xì)胞的研究3-5。 二次諧波技術(shù)很早就被應(yīng)用于生物組織成像6。其后，在多種生物組織中都可檢測(cè)到SHG信號(hào)，如角膜7 、鼠尾肌腱8和牛的I型Achilles腱、人的皮膚9等。此外，手性分子如核酸（DNA或RNA）、蛋白質(zhì)、糖元、淀粉、纖維素、磷脂等都具有手性，而它們的單體如核苷酸、氨基酸等，也都是手性分子，手性分子具有非中心對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，可以產(chǎn)生SHG信號(hào)，因此對(duì)核酸進(jìn)行二次諧波顯微成像成為可能。早期研究表明，在商品化的DNA樣品10和經(jīng)過(guò)固定處理的前列腺癌細(xì)胞樣品11中檢測(cè)到了DNA產(chǎn)生的SHG信號(hào)。本文以體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，應(yīng)用光譜成像技術(shù)對(duì)新鮮提取的基因組DNA

13、、細(xì)胞核提取物和培養(yǎng)狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行光譜學(xué)成像，在此基礎(chǔ)上討論乙醇對(duì)DNA構(gòu)象可能存在的潛在影響。1材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)裝置實(shí)驗(yàn)裝置使用多光子激光掃描共聚焦顯微成像系統(tǒng)（Fig.1）。該系統(tǒng)由飛秒激光系統(tǒng)、掃描顯微系統(tǒng)、探測(cè)系統(tǒng)三部分組成。飛秒激光系統(tǒng)由高能量的二極泵源固體激光器(VerdiV-10)作為激發(fā)光源、美國(guó)Coherent公司生產(chǎn)鎖模鈦寶石(Ti：Sapphire Laser，Mira-900F)作為激光工作物質(zhì)和聲光調(diào)制器(AOM)三部分組成。聲光調(diào)制器（AOM）用來(lái)調(diào)節(jié)激光的功率，激光的偏振方向?yàn)樗狡?，光纖耦合。波長(zhǎng)可調(diào)協(xié)范圍為700nm980 nm，脈沖寬度約為110

14、 fs，重復(fù)頻率 76 MHz。掃描顯微系統(tǒng)是由德國(guó)Zeiss公司生產(chǎn)的LSM510 Axiovert 200倒置激光掃描共聚焦顯微鏡，實(shí)驗(yàn)所用探測(cè)系統(tǒng)配置的是META探測(cè)器。圖1 多通道非線性光學(xué)實(shí)驗(yàn)裝置原理圖Figure1 Schematic of multimode nonlinear optical imaging system鈦寶石飛秒激光器發(fā)出的超短脈沖激光通過(guò)聲光調(diào)制器（AOM）后到達(dá)雙光子激光掃描顯微鏡作為激發(fā)光，經(jīng)過(guò)主二向色性光束分束器（MDBS）由油浸物鏡（63，N.A.=1.4）聚焦到樣品上，樣品在基頻光激發(fā)下產(chǎn)生背向二次諧波再經(jīng)油浸物鏡收集，經(jīng)過(guò)紅外光束濾色片（IR B

15、lock：Zeiss KP650）濾除漫反射的基頻光后將激發(fā)光輸送到META探測(cè)器，由探測(cè)器探測(cè)后轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)傳輸至計(jì)算機(jī)。實(shí)驗(yàn)探測(cè)系統(tǒng)配置了META探測(cè)器，它是由一個(gè)高質(zhì)量的反射光柵和一個(gè)32通道的光電倍增管（photomultiplier tube, PMT）陣列組成。該系統(tǒng)有多通道成像模式和光譜成像模式兩個(gè)成像模式，這兩個(gè)成像模式均使用META探測(cè)器獲取圖像。其中多通道成像模式有八個(gè)獨(dú)立的通道，通過(guò)設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)可檢測(cè)樣品382714nm波段的發(fā)射光信號(hào)并得到該波段的光學(xué)二次諧波-雙光子二維圖像；光譜成像模式可以記錄相應(yīng)波段的光學(xué)二次諧波-雙光子熒光圖像的光譜。本文結(jié)合這兩種成像模式獲取

16、樣品的多通道非線性二次諧波-雙光子圖像及其相應(yīng)的光譜。1.2 樣品制備人肝癌細(xì)胞系BEL-7402（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心），37快速?gòu)?fù)蘇，洗滌后接種于含生長(zhǎng)在含10%胎牛血清，100U/mL 的青霉素及鏈霉素的DMEM(Gilbco Invitrogen)完全培養(yǎng)液中，37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況更換培養(yǎng)液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)時(shí)用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）進(jìn)行消化，經(jīng)洗滌后，每培養(yǎng)瓶（25ml）的接種量約為1105個(gè)細(xì)胞。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞用于基因組DNA和細(xì)胞核的提取。用于SHG成像的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞提前一天接種于共焦顯微鏡專用

17、培養(yǎng)皿（NEST, GBD-35-15）。根據(jù)操作手冊(cè)，利用組織/細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒(Dongsheng, Guangzhou, China)提取腫瘤細(xì)胞的基因組DNA；利用組織/細(xì)胞細(xì)胞核快速提取試劑盒(Solarbio, Beijing, China) 提取腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核。1.3 SHG成像 實(shí)驗(yàn)前首先開(kāi)啟激光器和顯微鏡，激光器預(yù)熱約兩小時(shí)穩(wěn)定工作后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。分別將實(shí)驗(yàn)樣品置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，首先找到樣品分散良好的視野，將熒光顯微鏡轉(zhuǎn)到掃描的位置，然后不斷縮小掃描范圍，以獲得完整清晰的圖像，觀察目標(biāo)樣品的細(xì)微結(jié)構(gòu)。選擇兩個(gè)通道來(lái)采集和記錄被檢測(cè)樣品的二次諧波-雙光子熒光信號(hào)

18、獲得該樣品的二次諧波-雙光子熒光成像圖像。系統(tǒng)自帶工具調(diào)焦平臺(tái)(HRZ 200 stage, Carl Zeiss)用來(lái)改變焦點(diǎn)的位置，得以在不同區(qū)域處成像。用ROI工具獲取各個(gè)區(qū)域處二次諧波信號(hào)的光強(qiáng)分布，用Histo工具獲得各個(gè)區(qū)域處二次諧波信號(hào)的平均光強(qiáng)。從382nm處(設(shè)定后保持不變)開(kāi)始掃描，每增加10nm掃描一次直到?jīng)]有信號(hào)，獲得了不同波長(zhǎng)處的二次諧波-雙光子熒光成像，與此同時(shí)光譜成像模式記錄相應(yīng)的光譜。LSM 510 Image Examiner軟件處理獲得的圖像，調(diào)整圖像的對(duì)比度、亮度對(duì)圖像進(jìn)行進(jìn)一步的處理以期獲得較好的圖像。2 結(jié)果2.1 基因組DNA溶液的發(fā)射光譜經(jīng)紫外分光

19、光度計(jì)測(cè)量，基因組DNA溶液的濃度為30g/ml，A260/A280=1.90，符合實(shí)驗(yàn)要求。圖2為實(shí)驗(yàn)中得到的肝癌細(xì)胞基因組DNA的二次諧波-雙光子熒光發(fā)射光譜。實(shí)驗(yàn)中使用激發(fā)光波長(zhǎng)為800nm、功率為10mW的飛秒激光對(duì)肝癌細(xì)胞DNA進(jìn)行掃描，光譜信號(hào)變化范圍為382714nm。從圖中可以看出基因組DNA溶液在404nm和639nm處各有一個(gè)波峰，其中404nm處的波峰是來(lái)自于SHG的信號(hào)，639nm處的波峰是來(lái)自于TPEF的信號(hào)。該DNA樣品的光譜學(xué)成像在整個(gè)掃描窗口中顯示為均質(zhì)的背景，表明DNA分子在溶液中均勻分布（結(jié)果未顯示）。圖2 基因組DNA溶液的二次諧波光譜Figure 2 S

20、HG-TPEF Spectra of genomic DNA solution2.2 細(xì)胞核提取物的成像與光譜 為了獲得肝癌細(xì)胞核提取物的二次諧波信號(hào)，實(shí)驗(yàn)中對(duì)提取出來(lái)的肝癌細(xì)胞核進(jìn)行了二次諧波-雙光子成像掃描并作出了相應(yīng)的發(fā)射光譜圖。圖3（a）和圖3（b）是肝癌細(xì)胞核提取物雙光子二次諧波成像，圖3（c）是相應(yīng)的發(fā)射光譜。其中圖3（b）的掃描區(qū)域是圖3（a）掃描區(qū)域的4.5倍，即放大了4.5倍。實(shí)驗(yàn)中激發(fā)光波長(zhǎng)、激發(fā)功率及光譜信號(hào)變化范圍同上(2.1)。從圖3（a）和圖3（b）中可以看出肝癌細(xì)胞核提取物具有很強(qiáng)的二次諧波信號(hào)，相應(yīng)的光譜圖也顯示肝癌細(xì)胞核提取物的SHG-TPEF信噪比較高。 圖

21、3 細(xì)胞核提取物的二次諧波-雙光子熒光成像（a, b）及其相應(yīng)的發(fā)射光譜（c）Figure 3 SHG-TPEF imaging of the extraction of the hepatocellular carcinoma cells (HCC) nuclei (a, b) and the corresponding emission spectra(c)2.3 培養(yǎng)細(xì)胞的SHG/TPEF成像在未改變?nèi)魏螌?shí)驗(yàn)條件的情況下，用同樣的方法對(duì)培養(yǎng)狀態(tài)下的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核區(qū)域進(jìn)行光譜掃描時(shí)，幾乎無(wú)法獲得可以識(shí)別的SHG信號(hào)?？紤]到基因組DNA和細(xì)胞核提取過(guò)程中廣泛使用有機(jī)溶劑可能是造成DNA分子

22、光學(xué)特性改變的因素，因此嘗試在實(shí)驗(yàn)中向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加少量的無(wú)水乙醇，具體步驟是：在培養(yǎng)液中滴入4滴無(wú)水乙醇溶液（體積比5%），約3分鐘后進(jìn)行光譜掃描。圖4（a）和圖4（b）分別為不添加乙醇的肝癌細(xì)胞和添加了無(wú)水乙醇的肝癌細(xì)胞的二次諧波-雙光子成像，圖3(c)為對(duì)應(yīng)的光譜圖。從圖(a)和圖(b)中可以看出添加了乙醇的肝癌細(xì)胞的二次諧波-雙光子成像明顯強(qiáng)于未添加乙醇的肝癌細(xì)胞的二次諧波-雙光子成像,相應(yīng)的光譜顯示未添加乙醇的樣品無(wú)SHG信號(hào)，添加乙醇的樣品在激發(fā)光的半波長(zhǎng)404nm處有波峰，此為SHG信號(hào)。 圖4肝癌細(xì)胞的二次諧波-雙光子成像 (a)和添加乙醇的肝癌細(xì)胞的二次諧波-雙光子成像(b

23、)及其相應(yīng)的發(fā)射光譜(c)Figure 4 SHG-TPEF images from the HCC (a) and the HCC of adding ethanol (b), the corresponding emission spectra are shown in (c).The red box is the region of interest of nuclei of the cell, six regions of interest are detected in (a) and eight regions of interest are detected in (b), th

24、e corresponding spectra are separately made according to the average of these regions of interest in (a) and (b)3 討論二次諧波-雙光子共聚焦顯微技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的觀察微觀世界和生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的有力工具。它最大的優(yōu)點(diǎn)探測(cè)深度深，對(duì)生物體的損傷小，時(shí)間空間分辨率高以及對(duì)結(jié)構(gòu)的對(duì)稱性敏感等12-13。我們采用二次諧波-雙光子共聚焦顯微技術(shù)對(duì)三組DNA樣品進(jìn)行觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在常規(guī)條件下即可觀測(cè)到基因組DNA和細(xì)胞核提取物的SHG信號(hào)，但卻未檢測(cè)到培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞核區(qū)的SHG信號(hào)，當(dāng)在培養(yǎng)

25、基中添加了少量無(wú)水乙醇后可觀測(cè)到其SHG信號(hào)。由于DNA大分子具有非中心對(duì)稱的手性結(jié)構(gòu)12，且其反向平行的雙螺旋結(jié)構(gòu)造成的準(zhǔn)相位匹配（Pseudo-phasematching）使其能夠產(chǎn)生二次諧波10，因此可被作為產(chǎn)生SHG的標(biāo)本。早期的研究發(fā)現(xiàn)，在商品化的DNA樣品10和經(jīng)過(guò)固定處理的前列腺癌細(xì)胞樣品11中檢測(cè)到了DNA產(chǎn)生的SHG信號(hào)，其中Sheppard10等人利用SHG顯微成像觀察到了鯡魚(yú)精DNA在蒸餾水中的SHG成像， 而莊正飛11等人則利用SHG-TPEF顯微成像技術(shù)獲得了前列腺組織細(xì)胞細(xì)胞核切片的SHG信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)2.1和2.2的DNA樣本均來(lái)自新鮮培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次說(shuō)

26、明了基因組DNA和細(xì)胞核均可以產(chǎn)生較強(qiáng)的SHG信號(hào)。2.1的光譜圖中在639nm處還有一個(gè)波峰，這是來(lái)自于卟啉及其衍生物的TPEF信號(hào)14-15，細(xì)胞中的細(xì)胞色素、血紅素等生物大分子均含有卟啉，卟啉可以與DNA結(jié)合并發(fā)生相互作用16-17，故可能是在DNA提取過(guò)程中細(xì)胞中的卟啉大分子與DNA結(jié)合很難被完全洗脫殘留在DNA溶液中造成在639nm處有一個(gè)波峰。2.2的光譜圖中SHG-TPEF信噪比較2.1高，由于在真核生物，DNA以非常致密的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，能夠以多種形態(tài)（超螺旋和環(huán)形等）構(gòu)象存在于細(xì)胞核中，而基因組DNA是以線性雙鏈存在于溶液中，其DNA致密程度遠(yuǎn)低于細(xì)胞核DNA，故基因組D

27、NA的SHG-TPEF信噪比較細(xì)胞核提取物的SHG-TPEF信噪比低。理論研究表明，二次諧波的產(chǎn)生必須滿足兩個(gè)條件，一是介質(zhì)必須具有非中心對(duì)稱結(jié)構(gòu)(Non-centrosymmetric structures)，二是必須滿足相位匹配（Relaxed phase matching）的條件3-4,18。2.1 和2.2 驗(yàn)證了DNA分子是能夠滿足發(fā)生的條件的，但從2.3 （a）可以看出在常規(guī)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的核區(qū)幾乎無(wú)法檢測(cè)到DNA的SHG信號(hào)，但加入乙醇后（唯一的條件改變）卻可以觀察到其SHG，推測(cè)可能是乙醇誘導(dǎo)活細(xì)胞內(nèi)DNA構(gòu)象發(fā)生了變化致使DNA的非線性光學(xué)特性發(fā)生改變從而使得變構(gòu)后的DNA滿

28、足了產(chǎn)生SHG的條件，并最終探測(cè)到了其SHG信號(hào)。目前，關(guān)于乙醇誘導(dǎo)溶液中DNA分子構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)變已經(jīng)被廣泛研究19-22，加入乙醇到DNA溶液中使溶液中水活性降低，致使結(jié)合到DNA上的水分子數(shù)減少，原來(lái)被水分子支撐而伸展的DNA溝槽收縮，大溝槽變得更窄更深，小溝槽變得更寬更淺，使DNA整體外形結(jié)構(gòu)變得更短，從而導(dǎo)致DNA構(gòu)象由B型轉(zhuǎn)化為A型，這種構(gòu)型的轉(zhuǎn)變將改變雙螺旋結(jié)構(gòu)中大溝槽和小溝槽的氫鍵類型23-25。在體內(nèi)，這種類型的影響取決于與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)14-15,18。研究表明，DNA隨著乙醇濃度的增大穩(wěn)定性會(huì)降低22，推測(cè)當(dāng)加入乙醇到培養(yǎng)的細(xì)胞中，乙醇小分子會(huì)通過(guò)核孔進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，致

29、使DNA的穩(wěn)定性降低從而使DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合松散，使雙鏈處于較松散的狀態(tài)，有利于DNA與RNA的結(jié)合致使構(gòu)象發(fā)生改變。在活細(xì)胞中，由于細(xì)胞本身不滿足非中心對(duì)稱結(jié)構(gòu)，每個(gè)核苷酸分子產(chǎn)生的二次諧波相互疊加抵消使得我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中并未觀測(cè)到SHG的產(chǎn)生。加入乙醇分子后，分子表面電荷特性發(fā)生改變以及分子螺旋構(gòu)象形態(tài)發(fā)生改變，使得每個(gè)分子在同樣入射光的激發(fā)下所產(chǎn)生的超級(jí)化強(qiáng)度的方向與之前相比發(fā)生改變，進(jìn)而每個(gè)分子產(chǎn)生的二次諧波的方向也發(fā)生改變，在我們觀察的生物組織區(qū)域內(nèi)，所有的二次諧波相位一致而相互干涉加強(qiáng)，滿足相位匹配原理18，使得我們?cè)诩尤胍掖己笥^察到了SHG。由此，反推2.1和2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由于

30、在提取基因組DNA和細(xì)胞核的試劑中包含了乙醇，推測(cè)提取過(guò)程中乙醇的加入也會(huì)影響DNA的構(gòu)象，對(duì)二次諧波的產(chǎn)生和增強(qiáng)造成一定的影響。此外，加入乙醇分子后細(xì)胞的熒光強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)（圖3）。其原因可能是由于乙醇介入蛋白質(zhì)分子，改變蛋白質(zhì)分子所處環(huán)境的介電常數(shù)，引起肽鏈伸展，從而降低了某些氨基酸如色氨酸（Trp）、酪氨酸(Tyr)殘基的微環(huán)境極性，使得Tyr殘基形成的氫鍵遭到破壞，以致處于淬滅狀態(tài)的Tyr殘基熒光得以恢復(fù)，并使其量子率增加。另外可能的原因是加入乙醇可使細(xì)胞起到脫水作用，降低細(xì)胞所處的微環(huán)境極性，使得熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。4 結(jié)論 我們利用SHG-TPEF顯微成像技術(shù)分別對(duì)基因組DNA、細(xì)胞核提

31、取物和培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行光譜成像，結(jié)果顯示常規(guī)條件下可檢測(cè)到基因組DNA和細(xì)胞核提取物的SHG，但無(wú)法檢測(cè)到培養(yǎng)細(xì)胞的SHG，乙醇的加入可使得我們?cè)谂囵B(yǎng)細(xì)胞中也檢測(cè)到SHG， 表明乙醇可對(duì)DNA的空間構(gòu)象產(chǎn)生影響，致使DNA光學(xué)特性發(fā)生改變從而產(chǎn)生二次諧波。由此，反推在基因組DNA和細(xì)胞核提取試劑中包含了有機(jī)物乙醇，可能對(duì)這兩組樣品的DNA空間構(gòu)象產(chǎn)生影響，并最終影響二次諧波的產(chǎn)生和增強(qiáng)。同時(shí)，在DNA和細(xì)胞核的提取試劑中還包含了其它的化學(xué)試劑（如十二烷基硫酸鈉：SDS，乙二胺四乙酸二鈉鹽：EDTA等）也有可能對(duì)DNA非線性光學(xué)特性產(chǎn)生影響，要得出確切的結(jié)論還需要更進(jìn)一步的研究。References

32、:1 Denk W, Stickler H, Webb W W. J. Science, 1990, 248(4951): 73-76. 2 Gannaway J N. and Sheppard C J R. J. Opt. Quantum Electron, 1978, 10: 435-439.3 Campagnola P J, W ei M , L ewis A, et al . J. Biophysical, 1999, 77:3341 -3349. 4 Campagnola P J, Clark H A , Mohler W A , Lewis A, et al. J. Biomed.

33、 Opt. 6, 2001, 227-286. 5 Campagnola P J, Millard A C, Terasaki M,et al. J. Biophysical, 2002, 81(1):493-508.6 Freund I, Deutsch M, Sprecher A J. J.Biophysical, 1986, 50(4):693-712.7 Meng Han, Lander Zickle r, Guenter Giese, et al. J. Journal of Biomedical Optics, 2004, 9(4):760-766.8 Yi J, Ivan V T

34、omov, Yim in W, et al. J. Applied Physics Letters, 2005, 86:133901-133903. 9 Take shi Yasui, Yoshiyuki Tohno, Tsutomu A raki. J. Journal of Biomedical Optics, 2004, 9(2):259-264.10 Gauderon R, Lukins P B, Sheppard C J R. J. Micron,2001, 32 (7):685 689.11 Zhuang Zheng-Fei, Liu Han-Ping, Guo Zhou-Yi et al. J. Chin. Phys. B, 2010, 19(4):4262-4265.12 YAN Dan, WANG Zhu-yuan, CUI Yi-ping (嚴(yán)丹，王著元，崔一平). J. Optoelectronic Technology (光電子技術(shù)學(xué)報(bào)), 2008，28 (2)