5.2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段 課件 （32張PPT）

1、資料一資料一：刑偵破案殺手锏法醫(yī)DNA鑒定技術(shù)，需要用到大量兇手DNA。資料二資料二：肝炎病毒感染初期癥狀并不明顯，抽取的血液中病毒含量也很少，在檢測技術(shù)比較落后的時期常常造成誤診。資料三資料三：新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗體檢測、新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測。新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸檢測試劑盒是用于快速進(jìn)行體外定性檢測新型冠狀病毒(RdRp基因、N基因、E基因)的醫(yī)療檢測用品。它的工作原理是通過提它的工作原理是通過提取病人樣本中的取病人樣本中的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，通過擴增反應(yīng)將樣本通過擴增反應(yīng)將樣本中微量

2、的病毒信息進(jìn)行放大中微量的病毒信息進(jìn)行放大，最后以熒光的方式讀取信號。如果，最后以熒光的方式讀取信號。如果PCR之后信號為之后信號為陽性，那么就可以認(rèn)為樣本中存在病毒陽性，那么就可以認(rèn)為樣本中存在病毒(已經(jīng)感染已經(jīng)感染)，反之表明樣本中沒有病毒，反之表明樣本中沒有病毒(未未感染感染)。資料四資料四：在刑事偵破案件或遺傳病的診斷過程中常需要對樣品DNA進(jìn)行分析，PCR技術(shù)技術(shù)能快速擴增DNA片段，在幾個小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝，有效有效地解決了因為樣品中地解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進(jìn)行分析研究的問題含量太低而難以對樣品進(jìn)行分析研究的問題?，F(xiàn)在PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳病的

3、診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和基因測序遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和基因測序。華師附中汕尾學(xué)校 楊宇濤（一）PCR原理1.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在短時間內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。2.細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制（回顧）DNA的基本單位：脫氧核糖核苷酸DNA分子的結(jié)構(gòu)：含氮堿基含氮堿基磷酸磷酸5 5脫氧脫氧核糖核糖O O1 12 23 34 45 5DNA的羥基羥基(-OH)末端稱為3端，而磷酸基團磷酸基團的末端稱為5端。3355（一）PCR原理2.細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制（回顧）DNA的基本單位：脫氧核糖核苷酸DNA分子

4、的結(jié)構(gòu)：（兩條鏈）反向平行，雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA復(fù)制的時間：發(fā)生在有絲分裂的間期和減數(shù)第一次分裂間期DNA復(fù)制的場所：細(xì)胞核（主要）、線粒體、葉綠體DNA復(fù)制的特點：邊解旋邊復(fù)制、半保留復(fù)制、多起點復(fù)制（一）PCR原理2.細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制（回顧）DNA復(fù)制的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物打開打開DNADNA雙鏈雙鏈提供提供DNADNA復(fù)制的模板復(fù)制的模板合成子鏈的原料合成子鏈的原料催化合成催化合成DNADNA子鏈子鏈工作需要消耗工作需要消耗ATPATP催化脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵不能從頭不能從頭開始合成，開始合成，只能從只能從33端

5、延伸端延伸DNADNA鏈鏈子鏈只從引物33端開始延伸端開始延伸；子鏈的合成方向總是55端向端向 3 3端端。使使DNADNA聚合酶能夠從引物的聚合酶能夠從引物的33端開始連接脫氧核苷酸端開始連接脫氧核苷酸作為作為DNADNA復(fù)復(fù)制的起點制的起點（一）PCR原理3.PCR(體外的DNA復(fù)制)的條件DNA分子的熱變性熱變性原理在80-100 的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性變性。溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈重新結(jié)合成雙鏈，這個過程稱為復(fù)性復(fù)性。參與的組分解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物DNA雙鏈單鏈 變性（加熱變性（加熱80-10080-1

6、00） 復(fù)性（緩慢冷卻）復(fù)性（緩慢冷卻）（一）PCR原理3.PCR(體外的DNA復(fù)制)的條件耐高溫的Taq DNA聚合酶高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的Taq DNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化。 自然引物（細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制）：RNA引物 人工引物（PCR）：DNA單鏈（主要）或RNA分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物（引物和引物）參與的組分解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（一）PCR原理3.PCR(體外的DNA復(fù)制)的條件控制溫度，但不需解旋酶；DNA模板；四種脫氧核苷酸；耐高溫的聚合酶（Taq DN

7、A聚合酶）；分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物（引物和引物）；需要在一定的緩沖液中進(jìn)行。（二）PCR的反應(yīng)過程1.PCR的反應(yīng)步驟：一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)分為變性、復(fù)性和延伸三步2.循環(huán)過程變性解旋，9494（二）PCR的反應(yīng)過程1.PCR的反應(yīng)步驟：一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)分為變性、復(fù)性和延伸三步2.循環(huán)過程變性解旋，9494復(fù)性引物與模板鏈結(jié)合，5555不考慮模板鏈重新結(jié)合不考慮模板鏈重新結(jié)合：模板模板DNADNA比引物復(fù)雜的多；比引物復(fù)雜的多；加入引物的量足夠多而模板鏈數(shù)量少；加入引物的量足夠多而模板鏈數(shù)量少；引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞。引物

8、和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞。（二）PCR的反應(yīng)過程1.PCR的反應(yīng)步驟：一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)分為變性、復(fù)性和延伸三步2.循環(huán)過程變性解旋，9494復(fù)性引物與模板鏈結(jié)合，5555延伸DNA新鏈由5端向3端延伸（引物端為新鏈5端），7272（Taq DNA聚合酶最適溫度）第1個 PCR 循環(huán)完成后 ：得到兩個拷貝的靶序列5引物5引物第二次循環(huán)第一次循環(huán)555555模板DNA55 5555 552530 次循環(huán)（復(fù)制）后，模板DNA的含量可以擴大100萬（220）倍以上。引物數(shù)引物數(shù)= =新增單鏈數(shù)新增單鏈數(shù)=22=22n n-2-25引物5引物第二次循環(huán)第一次

9、循環(huán)555555模板DNA55 5555 555引物5引物第三次循環(huán)555555555555（二）PCR的反應(yīng)過程1.PCR的反應(yīng)步驟：一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)分為變性、復(fù)性和延伸三步2.循環(huán)過程變性：解旋，9494復(fù)性：引物與模板鏈結(jié)合，5555延伸：DNA新鏈由5端向3端延伸，72723.PCR的反應(yīng)結(jié)果從第二輪循環(huán)開始，前一輪循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會與引物結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸。 DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，等長DNA從第三輪循環(huán)開始出現(xiàn)，這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。例：PCR過程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相比，

10、主要有兩點不同，它們是（ ）PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNAPCR過程不需要DNA聚合酶PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實現(xiàn)的PCR過程中，DNA不需要解旋，直接以雙鏈DNA為模板進(jìn)行復(fù)制A B C DC C例：PCR一般要經(jīng)過三十多次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，由引物延伸而成的DNA單鏈作模板時將（ ）A仍與引物結(jié)合進(jìn)行DNA子鏈的延伸B與引物結(jié)合進(jìn)行DNA子鏈的延伸C同時與引物和引物結(jié)合進(jìn)行子鏈的延伸D無需與引物結(jié)合，在酶的作用下從頭合成子鏈B B解析：當(dāng)有引物延伸而成的DNA單鏈做模板時，此單鏈引物端為5端

11、，與它互補的子鏈此端為3端，因此新子鏈應(yīng)從另一端開始合成，即由引物結(jié)合延伸DNA的子鏈。55（一）設(shè)備與用具1.PCR儀一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器2.微量離心管進(jìn)行PCR反應(yīng)的場所，一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3.微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次（二）實驗操作步驟準(zhǔn)備移液混合離心反應(yīng)（二）實驗操作步驟準(zhǔn)備移液混合離心反應(yīng)按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上。p62（PCR反應(yīng)體系的配方）（二）實驗操作步驟準(zhǔn)備移液混合離心反應(yīng)用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑。（二）實驗操作步驟準(zhǔn)備移液混合離心反應(yīng)過程

12、：蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。注意：A.離心管口的蓋子一定蓋嚴(yán)，防止實驗中脫落或液體外溢。B.手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻。（二）實驗操作步驟準(zhǔn)備移液混合離心反應(yīng)過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s。目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果。（二）實驗操作步驟準(zhǔn)備移液混合離心反應(yīng)將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率（二）實驗操作步驟準(zhǔn)備移液混合離心反應(yīng)【注意事項】 避免外源DNA等因素的污染隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；分裝試劑，簡化操作程序，

13、使用一次性槍頭。例：在PCR實驗操作中，下列說法不正確的是()A在微量離心管中添加各種試劑時，只需一個槍頭B離心管的蓋子一定要蓋嚴(yán)，防止液體外溢C用手輕彈離心管壁的目的是使反應(yīng)液充分混合D離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管部，提高反應(yīng)效果A A（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算1.一條DNA，復(fù)制n次， DNA為2n2.a條DNA，復(fù)制n次， DNA為a 2n（二）實驗中DNA含量的測定1.原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)2.過程稀釋： 2LPCR反應(yīng)液，加入98L蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋對照調(diào)零：以蒸餾

14、水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零（二）實驗中DNA含量的測定1.原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)2.過程測定：取DNA稀釋液100L至比色杯中，測定260nm處的光吸收值計算：DNA含量（g/mL）50(260nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù)50（常數(shù)）：1g /ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02紫外分光光度計紫外分光光度計比比色色杯杯B B1如圖表示細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制和細(xì)胞外PCR擴增兩個過程，兩反應(yīng)過程的條件中相同的是()A模板 B原料 C酶 D能量供應(yīng)解析：本題主要考查細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制和細(xì)胞外PCR擴增的知識，意在考查考生對細(xì)胞內(nèi)外DNA復(fù)制條件的理解。選項A模板不同，胞內(nèi)DNA復(fù)制以整個DNA分子作為模板，PCR擴增卻以一段目的DNA作為模板。選項B原料相同，均以4種脫氧核苷酸為原料。選項C酶不相同，胞內(nèi)DNA解旋需要解旋酶，延伸需要DNA聚合酶等；胞外PCR擴增通過高溫解旋而不需要解旋酶，延伸只需熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶。選項D能量供應(yīng)不同，胞內(nèi)DNA復(fù)制過程由ATP提供能量，而PCR擴增主要由外界供能。D D2下列關(guān)于PCR的描述中，正確的是()PCR是一種酶促反應(yīng) 引物決定了擴增的特異性擴增DN