實驗一糕點中菌落總數(shù)的測定

1、1、了解細菌總數(shù)檢驗的意義。、了解細菌總數(shù)檢驗的意義。2、掌握樣品稀釋處理的方法和菌落總數(shù)計數(shù)的方法、掌握樣品稀釋處理的方法和菌落總數(shù)計數(shù)的方法3、掌握食品細菌總數(shù)的測定報告方式。、掌握食品細菌總數(shù)的測定報告方式。4、熟練無菌操作技術(shù)。、熟練無菌操作技術(shù)。實驗一實驗一 糕點中菌落總數(shù)的測定糕點中菌落總數(shù)的測定一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?1 1、電熱恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、恒溫水浴鍋、托盤天、電熱恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、恒溫水浴鍋、托盤天平、電爐、吸管、廣口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、平、電爐、吸管、廣口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、試管、試管架、酒精燈、均質(zhì)器或乳缽、滅菌刀或試管、試管架、酒精燈、均質(zhì)器或乳缽、滅

2、菌刀或剪刀、滅菌鑷子、剪刀、滅菌鑷子、75%75%酒精棉球、玻璃蠟筆、登酒精棉球、玻璃蠟筆、登記薄記薄 2 2、培養(yǎng)基和試劑：、培養(yǎng)基和試劑：75%75%乙醇、生理鹽水乙醇、生理鹽水( (蒸餾蒸餾水）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。水）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。二、實驗材料二、實驗材料菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理,在一定條件下培養(yǎng)后在一定條件下培養(yǎng)后(如培基如培基成分、培養(yǎng)溫度和時間、成分、培養(yǎng)溫度和時間、pH、需氧性質(zhì)等、需氧性質(zhì)等)，所得，所得1mL(g)檢樣檢樣中所含菌落的總數(shù)。中所含菌落的總數(shù)。本方法規(guī)定的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只包括一群在營養(yǎng)瓊脂本方法規(guī)定的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只

3、包括一群在營養(yǎng)瓊脂上生長發(fā)育的嗜中溫性需氧的菌落總數(shù)。上生長發(fā)育的嗜中溫性需氧的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)主要作為判定食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用菌落總數(shù)主要作為判定食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)。行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)。(一）最先準備的器材（清洗、烘干、包扎、滅菌）一）最先準備的器材（清洗、烘干、包扎、滅菌）*8規(guī)格名稱數(shù)量 用途1、500ml三角瓶 1個 稀釋樣品（配制生理鹽水）2、250ml三角瓶1個 配制營養(yǎng)瓊脂 3、18180mm試管5支 稀釋樣品（9ml）4、

4、1ml移液管 5 支5、直徑為90mm平皿 8套 倒?fàn)I養(yǎng)平板6、250ml量筒 1支7、玻璃珠：直徑約5mm （二）應(yīng)滅菌、消毒的器材（二）應(yīng)滅菌、消毒的器材 剪刀1把 不銹鋼藥匙1把 稱量紙：適量 酒精消毒的器材：吸耳球1個，滴管膠頭5只 （三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基（三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基 培養(yǎng)基 總量 所用容器 蒸餾水 1瓶 225ml/瓶 500ml三角瓶 平板計數(shù)瓊脂 1瓶 150ml/瓶 250ml三角瓶 稀釋水： 每組5支 9ml/支 18180mm試管A.1 A.1 平板計數(shù)瓊脂（平板計數(shù)瓊脂（plate count agarplate count agar，PCAPCA）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基A

5、.1.1 成分胰蛋白胨 5.0 g酵母浸膏 2.5 g葡萄糖 1.0 g瓊 脂 15.0 g蒸餾水 1000 mLpH 7.00.2A.1.2 制法將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。分裝試管或錐形瓶，121 高壓滅菌15 min。1、檢驗程序、檢驗程序菌落總數(shù)檢驗程序：菌落總數(shù)檢驗程序：檢樣檢樣做成幾個適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液做成幾個適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液選擇選擇2-32-3個適宜稀釋度個適宜稀釋度各以各以1ml1ml之量分別入滅菌平皿內(nèi)之量分別入滅菌平皿內(nèi)每皿內(nèi)加入每皿內(nèi)加入46460 0C C適量營養(yǎng)適量營養(yǎng)瓊脂瓊脂菌落數(shù)菌落數(shù)報告報告三、實驗方法三、實驗方法2、檢樣稀釋及培養(yǎng)、檢樣稀釋及培養(yǎng)

6、（1）以無菌操作，將檢樣）以無菌操作，將檢樣25g（或（或25ml）剪碎以后，放于含有）剪碎以后，放于含有225ml滅菌滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)先置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)先置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。的均勻稀釋液。 固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000100000r/min的速度處理的速度處理1min，做成，做成1：10的均勻稀釋液。的均勻稀釋液。（2）用）用1ml滅菌吸管吸取滅菌吸管吸取1：1

7、0稀釋液稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌滅菌生理鹽水或其他稀釋的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液，下生理鹽水或其他稀釋的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液，下同），振搖試管混合均勻，做成同），振搖試管混合均勻，做成1：100的稀釋液。的稀釋液。（3）另?。┝砣?ml的滅菌吸管，按上項操作順序作的滅菌吸管，按上項操作順序作10倍遞增稀釋液，如此每遞倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用增稀釋一次，即換用1支支1ml滅菌吸管。滅菌吸管。注意：注意：加入檢樣液時，吸管尖端不要觸及瓶口或試管口外部，也不得觸及管內(nèi)稀加入檢樣液時，吸管尖端不要觸及瓶口或試管口外部

8、，也不得觸及管內(nèi)稀釋液，并將吸管內(nèi)的液體沿管壁小心流加入，以免增加檢液。釋液，并將吸管內(nèi)的液體沿管壁小心流加入，以免增加檢液。吸管插入檢樣液內(nèi)取樣稀釋時，插入深度要達吸管插入檢樣液內(nèi)取樣稀釋時，插入深度要達2.5cm以上以上,調(diào)整時應(yīng)使管尖調(diào)整時應(yīng)使管尖與容器內(nèi)緊貼與容器內(nèi)緊貼每遞增稀釋一次，即換用另一支每遞增稀釋一次，即換用另一支1ml滅菌吸管滅菌吸管 （4）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準要求或?qū)z樣污染情況的估計，選擇）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準要求或?qū)z樣污染情況的估計，選擇23個適宜稀釋個適宜稀釋度，分別在作度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1

9、ml稀釋液稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作兩個平皿。于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作兩個平皿。（5）稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時將涼至）稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時將涼至460C營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基可放置在可放置在（461）0C）水浴鍋內(nèi)保溫）水浴鍋內(nèi)保溫注入平皿注入平皿15ml20mL，并轉(zhuǎn)動平皿使混合均，并轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻，同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有勻，同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。作空白對照。（6）等瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置（）等瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置（361）0C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（482）h取取出，計

10、算平板內(nèi)菌落數(shù)目乘以倍數(shù)，即得出，計算平板內(nèi)菌落數(shù)目乘以倍數(shù)，即得1g（1mL）樣品所含菌落總數(shù)。）樣品所含菌落總數(shù)。 培養(yǎng)基不能觸及平皿口邊沿，加入培養(yǎng)基后可正反兩個方向旋轉(zhuǎn)，但不可用培養(yǎng)基不能觸及平皿口邊沿，加入培養(yǎng)基后可正反兩個方向旋轉(zhuǎn)，但不可用力過度，以免濺起觸及上蓋。力過度，以免濺起觸及上蓋。檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿，所用時間不宜超過檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿，所用時間不宜超過20min瓊脂凝固后，就立即將平板放入培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，以免細菌蔓延生長。瓊脂凝固后，就立即將平板放入培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，以免細菌蔓延生長。如果把不能立即計數(shù)，要將平板放入如果把不能立即計數(shù)，要將平

11、板放入04冰箱中，但不能超過冰箱中，但不能超過24 h。3、菌落計算方法、菌落計算方法（1）菌落計數(shù)方法）菌落計數(shù)方法 做平板菌落計數(shù)時，可用肉眼觀查，必要時用放大鏡檢查，以防做平板菌落計數(shù)時，可用肉眼觀查，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落總遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落總數(shù)。數(shù)。（2）菌落計數(shù)的報告）菌落計數(shù)的報告平板菌落數(shù)的選擇平板菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在選取菌落數(shù)在3030300300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準。一個稀之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準。一個稀釋度使用兩個平板，應(yīng)采用兩個平板平均數(shù)，其中一個平

12、板有較大片釋度使用兩個平板，應(yīng)采用兩個平板平均數(shù)，其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘布又很均勻，即可計算半個平板后乘2 2以代表全皿菌落數(shù)。平皿內(nèi)如有以代表全皿菌落數(shù)。平皿內(nèi)如有鏈狀菌落生長時（菌落之間無明顯界線），若僅有一條鏈，可視為一鏈狀菌落生長時（菌落之間無明顯界線），若僅有一條鏈，可視為一個菌落數(shù)；如果有不同來源的幾條鏈，則應(yīng)將每條

13、鏈作為一個菌落計。個菌落數(shù)；如果有不同來源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個菌落計。 稀釋度的選擇稀釋度的選擇 應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在3030300300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之。之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之。若有兩上稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在若有兩上稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在3030300300之間，則視兩者之比之間，則視兩者之比如何來決定。若其比值小于或等于如何來決定。若其比值小于或等于2 2，應(yīng)報告其平均數(shù)；若大于，應(yīng)報告其平均數(shù)；若大于2 2則報則報告其中較小的數(shù)字。告其中較小的數(shù)字。 若所有稀釋度平均菌落數(shù)均大于若所有稀釋度平均菌落數(shù)均大于300300，則應(yīng)按稀

14、釋度最高的平均，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于3030，則應(yīng)按稀釋度最低的平均，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。 若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1 1乘以最低稀釋倍數(shù)報告乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。之。 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在3030300300之間，其中一部分大之間，其中一部分大于于300300或小于或小于3030時，則以最接近時，則以最接近3030或或300300的平均菌落

15、數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。告之。菌落數(shù)的報告菌落數(shù)的報告 菌落數(shù)在菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按其實有數(shù)報告，大于以內(nèi)時，按其實有數(shù)報告，大于100時，采用二位時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算。為了有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算。為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來表示。的指數(shù)來表示。思考題及實驗作業(yè)思考題及實驗作業(yè)食品檢驗為什么要測定細菌菌落總數(shù)？食品中檢出的菌落總數(shù)是否代表該食品上的所有細菌數(shù)？為什么？為什么營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在使用前要保持地（461）的溫度？培養(yǎng)時為什么要把培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)

16、？在菌落總數(shù)測定和霉菌、酵母菌的計數(shù)中，兩者在樣品處理過程中有何不同？列表說明？計數(shù)時又有何異同處？雙人單面垂直風(fēng)超凈工作臺,潔凈等級100級閉合工作臺面,不銹鋼臺面材質(zhì)工作區(qū):1360*700*620mm 1. 目的 規(guī)范凈化工作臺操作與維護工作，確保儀器正常運作。 2. 適用范圍：本實驗方法適用于微生物檢驗中凈化工作臺操作與維護管理。 3. 檢驗人員職責(zé)：負責(zé)此儀器操作和維護管理超凈工作臺的使用、維護保養(yǎng)與清潔標(biāo)準操作規(guī)程超凈工作臺的使用、維護保養(yǎng)與清潔標(biāo)準操作規(guī)程 4. 4. 操作及維護規(guī)程操作及維護規(guī)程 4.1操作規(guī)程4.1.1使用工作臺時，應(yīng)提前50分鐘開機，同時開啟紫外殺菌燈，處理

17、操作區(qū)內(nèi)表面積累的微生物，30分鐘后關(guān)閉殺菌燈（此時日光燈即開啟），啟動風(fēng)機。4.1.2對新安裝的或長期未使用的工作臺，使用前必需對工作臺和周圍環(huán)鏡先用超靜真空吸塵器或用不產(chǎn)生纖維的工具進行清潔工作，再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌法進行滅菌處理。4.1.3 操作區(qū)內(nèi)不允許存放不必要的物品，保持工作區(qū)的潔凈氣流流型不受干擾。4.1.4 操作區(qū)內(nèi)盡量避免作用明顯擾亂氣流流型的動作。4.1.5 操作區(qū)的使用溫度不可以超過60。 4.2 維護規(guī)程及維護方法4.2.1 根據(jù)環(huán)境的潔凈程度，可定期（一般23個月）將粗濾布（滌綸無紡布）拆下清洗或給予更換。4.2.2 定期（一般為一周）對環(huán)境周圍進行滅菌工作，同時經(jīng)常用紗布沾酒精或丙酮等有機溶劑將紫外線殺菌燈表面擦干凈，保持表面清潔，否則會影響殺菌效果。4.2.3 當(dāng)加大風(fēng)機電壓已不能使風(fēng)