HPLC分析方法的建立與開發(fā)

1、建立分析方法建立分析方法色譜分離度與分離性能色譜分離度與分離性能HPLC分離的機(jī)理分離的機(jī)理分離是一個(gè)物理的過(guò)程。色譜工作者關(guān)心的基本問(wèn)題色譜工作者關(guān)心的基本問(wèn)題 - 色譜峰之間的分離度色譜峰之間的分離度totRAmAUtimetRBR = R = 分離度分離度t tRA RA = = 組分組分A A的保留時(shí)間的保留時(shí)間t tRBRB= = 組分組分B B的保留時(shí)間的保留時(shí)間w = w = 峰的基線寬度峰的基線寬度w w1/21/2= =半峰寬半峰寬)()(2BARRWWttRAB)()(176.12121BABWWttRARR分離度值分離度值等梯度洗脫的基本分離度公式等梯度洗脫的基本分離度公

2、式N: : 總的理論塔板數(shù)總的理論塔板數(shù); ; 柱效柱效k: k: 容量因子容量因子 ( (保留因子保留因子), ), 色譜峰的保留作用色譜峰的保留作用 ：色譜峰的相對(duì)分離程度色譜峰的相對(duì)分離程度; ; 選擇性作用選擇性作用影響分離度的因素影響分離度的因素容量因子對(duì)分離度的影響容量因子對(duì)分離度的影響容量因子容量因子 - - 流動(dòng)相組成的影響流動(dòng)相組成的影響選擇性選擇性影響選擇性的參數(shù)影響選擇性的參數(shù)降低增加 較弱的溶劑較強(qiáng)的溶劑異丙醇/水甲醇/水乙腈/水C-2C-18容易超載不容易超載改變流動(dòng)相組成改變流動(dòng)相組成改變固定相改變固定相有機(jī)成分含量低的固定相有機(jī)成分含量低的固定相 有機(jī)成分含量高的

3、固定相有機(jī)成分含量高的固定相色譜柱溫度對(duì)分離度的影響色譜柱溫度對(duì)分離度的影響柱效柱效計(jì)算柱效計(jì)算柱效典型的流速值典型的流速值4.61-23.00.4-0.82.10.2-0.41.00.05-0.09柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑 mm(5um 粒度粒度)mL/minflow rate2 =i.d.2i.d.12flow rate1柱外體積的影響柱外體積的影響10 L20 LTime, min.2.1 x 150 mmF = 0.2 mL / min.樣品體積樣品體積連接管路的體積連接管路的體積檢測(cè)器體積檢測(cè)器體積 檢測(cè)器電子線路的時(shí)間常數(shù)檢測(cè)器電子線路的時(shí)間常數(shù)所需分離度與柱長(zhǎng)匹配所需分離度與柱長(zhǎng)匹配峰對(duì)稱性

4、峰對(duì)稱性提高分離度提高分離度增大 k增加選擇性提高柱效分離度與分離度與 k, n 和和 的關(guān)系的關(guān)系液相色譜流動(dòng)相及固定相液相色譜流動(dòng)相及固定相流動(dòng)相流動(dòng)相 與與GCGC流動(dòng)相不同，流動(dòng)相不同，HPLCHPLC流動(dòng)相為溶劑，它既有流動(dòng)相為溶劑，它既有運(yùn)載作用，又和固定相一起參予對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)，因運(yùn)載作用，又和固定相一起參予對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)，因此溶劑的選擇對(duì)分離十分重要。此溶劑的選擇對(duì)分離十分重要。1 1、 理想的溶劑應(yīng)有下列特性理想的溶劑應(yīng)有下列特性 1 1）化學(xué)穩(wěn)定性好，）化學(xué)穩(wěn)定性好，與固定相不互溶、不發(fā)生反應(yīng)與固定相不互溶、不發(fā)生反應(yīng)2 2）必須和檢測(cè)器相適應(yīng)必須和檢測(cè)器相適應(yīng) 使用使用UVU

5、V檢測(cè)器時(shí)，溶劑截止波長(zhǎng)要小于測(cè)量波長(zhǎng)檢測(cè)器時(shí)，溶劑截止波長(zhǎng)要小于測(cè)量波長(zhǎng) 使用折光率檢測(cè)器，溶劑的折光率要與待測(cè)物的使用折光率檢測(cè)器，溶劑的折光率要與待測(cè)物的折光率有較大差別折光率有較大差別3 3）對(duì)待測(cè)物具一定極性和選擇性）對(duì)待測(cè)物具一定極性和選擇性4 4）高純度。否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時(shí)可使截）高純度。否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時(shí)可使截止波長(zhǎng)增加；止波長(zhǎng)增加；盡量避免使用有顯著毒性的溶劑盡量避免使用有顯著毒性的溶劑5 5）適宜的粘度）適宜的粘度 粘度過(guò)高，柱壓增加粘度過(guò)高，柱壓增加 過(guò)低（例：過(guò)低（例：戊烷、乙醚等），易產(chǎn)生氣泡，易產(chǎn)生氣泡2 2、溶劑的極性、溶劑的極性 溶劑的極性強(qiáng)

6、弱用溶劑強(qiáng)度參數(shù)表示，強(qiáng)度參數(shù)值越大，溶劑的極性強(qiáng)弱用溶劑強(qiáng)度參數(shù)表示，強(qiáng)度參數(shù)值越大，表示溶劑的洗脫能力越大。表示溶劑的洗脫能力越大。序號(hào)溶劑紫外波長(zhǎng)極限（nm）序號(hào)溶劑紫外波長(zhǎng)極限（nm）1異辛烷1979氯仿2452正己烷19010二氧六環(huán)2153甲基叔丁基醚21011丙酮3304苯27812乙醇2105二氯甲烷23313醋酸6正丙醇24014乙腈1907四氫呋喃21215甲醇2058乙酸乙酯25616水2003 3、流動(dòng)相的選擇、流動(dòng)相的選擇4 4、梯度洗脫、梯度洗脫 特點(diǎn)：可以縮短總的特點(diǎn)：可以縮短總的色譜周期，提高分離效色譜周期，提高分離效能，改善峰形，減少拖能，改善峰形，減少拖尾，

7、可以增加靈敏度，尾，可以增加靈敏度，會(huì)引起基線漂移會(huì)引起基線漂移固定相固定相化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相方法方法：通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面形成：通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面形成柱填柱填（約有約有3/43/4以上分離問(wèn)題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行以上分離問(wèn)題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行）特點(diǎn)：特點(diǎn)：穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗分離機(jī)理：分離機(jī)理：兼有吸附、分配兩種分離模式?；瘜W(xué)鍵合兼有吸附、分配兩種分離模式?；瘜W(xué)鍵合的表面覆蓋度決定哪種機(jī)理起主要作用。對(duì)多數(shù)鍵的表面覆蓋度決定哪種機(jī)理起主要作用。對(duì)多數(shù)鍵合相來(lái)說(shuō)，以分配機(jī)理為主。合相來(lái)說(shuō)，以分配機(jī)理為主。 載

8、體載體主要是硅膠（表面有硅醇基）主要是硅膠（表面有硅醇基）, ,特點(diǎn)為：特點(diǎn)為： 可以制備成粒度分布窄的多種粒度可以制備成粒度分布窄的多種粒度 機(jī)械強(qiáng)度好，可以填充成穩(wěn)定、高效的填充床機(jī)械強(qiáng)度好，可以填充成穩(wěn)定、高效的填充床 長(zhǎng)期高壓操作下不變形長(zhǎng)期高壓操作下不變形 反壓較低、柱壽命長(zhǎng)反壓較低、柱壽命長(zhǎng) 較其它材料制成的柱有更高的柱效較其它材料制成的柱有更高的柱效 適用于小分子、大分子的分析和制備適用于小分子、大分子的分析和制備 高高pHpH值下會(huì)分解（值下會(huì)分解（pHpH8 8）鍵合方法：鍵合方法： （l l）硅酯化（）硅酯化（Si-O-RSi-O-R）鍵合固定相鍵合固定相 （2) 2)硅氮

9、型（硅氮型（= =Si-N=Si-N=）共價(jià)鍵合固定相共價(jià)鍵合固定相 （3 3）硅烷化）硅烷化（ Si-O-Si-RSi-O-Si-R）鍵合固定相鍵合固定相使用鍵合固定相應(yīng)注意的問(wèn)題使用鍵合固定相應(yīng)注意的問(wèn)題 硅膠鍵合相的穩(wěn)定性硅膠鍵合相的穩(wěn)定性 鍵合相色譜分離的重現(xiàn)性鍵合相色譜分離的重現(xiàn)性 鍵合相色譜分離的選擇性鍵合相色譜分離的選擇性 鍵合相色譜柱的再生鍵合相色譜柱的再生 化學(xué)鍵合相色譜法化學(xué)鍵合相色譜法正相色譜和反相色譜正相色譜和反相色譜反相色譜的定義：反相色譜的定義：在非極性的固定相上，用極性較大在非極性的固定相上，用極性較大的液體作流動(dòng)相進(jìn)行物質(zhì)分離分析的方法。即：反的液體作流動(dòng)相進(jìn)行

10、物質(zhì)分離分析的方法。即：反相色譜中鍵合固定相的極性要小于流動(dòng)相的極性相色譜中鍵合固定相的極性要小于流動(dòng)相的極性正相色譜的定義：正相色譜的定義：在極性的固定相上，用極性較小的在極性的固定相上，用極性較小的液體作流動(dòng)相進(jìn)行物質(zhì)分離分析的方法。即：正相液體作流動(dòng)相進(jìn)行物質(zhì)分離分析的方法。即：正相色譜中鍵合固定相的極性要大于流動(dòng)相的極性色譜中鍵合固定相的極性要大于流動(dòng)相的極性正相色譜和反相色譜正相色譜和反相色譜的差別：正相色譜和反相色譜的差別：正相色譜正相色譜反相色譜反相色譜固定相極性固定相極性大大小小流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性小至中等小至中等中至大中至大組分流出順序組分流出順序極性小的組分先流極性小的組分

11、先流出出極性大的組分先流極性大的組分先流出出流動(dòng)相極性增大流動(dòng)相極性增大保留時(shí)間變小保留時(shí)間變小保留時(shí)間變大保留時(shí)間變大分離組分分離組分油溶性或水溶性的油溶性或水溶性的極性和強(qiáng)極性化合極性和強(qiáng)極性化合物物非極性、極性或離非極性、極性或離子型化合物子型化合物正相色譜正相色譜低極性流動(dòng)相低極性流動(dòng)相反相色譜反相色譜高極性流動(dòng)相高極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間待測(cè)物極性：待測(cè)物極性：ABC正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系正相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法 固定相：固定相：正相色譜中采用正相色譜中采用

12、極性極性鍵合固定相，是鍵合固定相，是把全多孔（或薄殼）微粒硅膠載體，經(jīng)酸活把全多孔（或薄殼）微粒硅膠載體，經(jīng)酸活化處理制成表面含有大量化處理制成表面含有大量硅羥基硅羥基的載體后，的載體后，再和含有胺基、腈基、醚基的硅烷化試劑反再和含有胺基、腈基、醚基的硅烷化試劑反應(yīng)，生成表面具有應(yīng)，生成表面具有胺基、腈基、醚基胺基、腈基、醚基的極性的極性固定相。固定相。 流動(dòng)相流動(dòng)相： 在非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適在非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等），分離極量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等），分離極性化合物。此時(shí)，組分的分配比性化合物。此時(shí)，組分的分配比k k

13、值隨其極性的值隨其極性的增加而增大，但隨流動(dòng)相極性的增加而降低。增加而增大，但隨流動(dòng)相極性的增加而降低。 主要用于分離主要用于分離異構(gòu)體異構(gòu)體、極性不同極性不同的化合物，特的化合物，特別適用于分離別適用于分離不同類型的化合物不同類型的化合物。反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法 采用采用非極性鍵非極性鍵合固定相合固定相, ,是把全多孔是把全多孔( (或薄殼或薄殼) )微粒硅膠載體微粒硅膠載體, ,經(jīng)酸活化處理后經(jīng)酸活化處理后, ,和含有和含有烷基鏈烷基鏈或苯基或苯基的硅烷化試劑反應(yīng)的硅烷化試劑反應(yīng), ,生成表面具有烷基生成表面具有烷基( (或苯基或苯基) )的非極性固定相，如的非極性固定相，如C1

14、8C18、C8C8流動(dòng)相：流動(dòng)相： 流動(dòng)相是采用極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇、乙腈、流動(dòng)相是采用極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇、乙腈、水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖溶液等。它多用于分離多環(huán)芳烴水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖溶液等。它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物等低極性化合物v若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流動(dòng)相若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流動(dòng)相，可用于分離極性化合物，可用于分離極性化合物v若采用水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相，則可分離一若采用水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相，則可分離一些易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類等些易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類等 具有柱效高，能獲得無(wú)拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)具有柱效高，能獲得無(wú)拖

15、尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)硅膠硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長(zhǎng)對(duì)反相色譜分離的影響烷基鍵合相中烷基鏈長(zhǎng)對(duì)反相色譜分離的影響時(shí)間，時(shí)間，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C181-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可見：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長(zhǎng)，分離效果越好。可見：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長(zhǎng)，分離效果越好。分析方法建立分析方法建立分析時(shí)要了解的情況分析時(shí)要了解的情況v想辦法得到各種信息想辦法得到各種信息向同行了解是否做過(guò)此類樣品，或有否類似樣品向同行了解是否做過(guò)此類樣品，或有否類似樣品的分析方法的分

16、析方法查文獻(xiàn)和方法，如查文獻(xiàn)和方法，如CA,AA,AOAC,EPA-CA,AA,AOAC,EPA-儀器制造商的文獻(xiàn)儀器制造商的文獻(xiàn)v充分了解自己的樣品充分了解自己的樣品v對(duì)色譜柱有足夠的了解對(duì)色譜柱有足夠的了解掌握分離機(jī)理，自己開發(fā)方法掌握分離機(jī)理，自己開發(fā)方法分析時(shí)要了解的情況（續(xù)分析時(shí)要了解的情況（續(xù)1）v靈敏度的要求有多高靈敏度的要求有多高? ? v樣品的本底是否很復(fù)雜樣品的本底是否很復(fù)雜? ? v有多少組份要分析有多少組份要分析? ? v對(duì)分析的精確度、準(zhǔn)確度等有多高要求對(duì)分析的精確度、準(zhǔn)確度等有多高要求? ? v是否因是日常檢驗(yàn)，而要求方法容易使用是否因是日常檢驗(yàn)，而要求方法容易使用

17、? ?分離分離(制備制備)時(shí)要了解的情況時(shí)要了解的情況v要分離（即制備）的樣品量有多大要分離（即制備）的樣品量有多大? ? v要分離的組份在樣品中的含量很高要分離的組份在樣品中的含量很高? ? 還是微量還是微量? ? v是否需要保持生物活性是否需要保持生物活性? ? v對(duì)分離產(chǎn)物純度的要求有多高對(duì)分離產(chǎn)物純度的要求有多高? ? v純度或活性的鑒定如何完成純度或活性的鑒定如何完成? ?什么化合物參數(shù)能用于分離什么化合物參數(shù)能用于分離 ?分子量不同分子量不同/ /MW 2000 MW 2000 凝膠滲透凝膠滲透 / / 凝膠過(guò)濾凝膠過(guò)濾離子化分子離子化分子 離子對(duì)離子對(duì)/ / 離子交換離子交換 極

18、性不同極性不同 吸附吸附/ / 反相色譜反相色譜 同系物同系物 / / 苯系物苯系物 反相反相 中性、酸和堿的混合物中性、酸和堿的混合物反相反相 生物分子生物分子 親和親和/ /HIC/HIC/凝膠過(guò)濾凝膠過(guò)濾/ /反相反相 立體異構(gòu)體立體異構(gòu)體 吸附吸附 手性化合物手性化合物 手性色譜手性色譜固定相和流固定相和流動(dòng)相選擇動(dòng)相選擇一般的具體步驟一般的具體步驟v先用一根短的色譜柱先用一根短的色譜柱v用相對(duì)較高的流速用相對(duì)較高的流速v使用盡可能純度高的標(biāo)準(zhǔn)品使用盡可能純度高的標(biāo)準(zhǔn)品v先用高強(qiáng)度的洗脫液先用高強(qiáng)度的洗脫液v調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)k k 值改變保留值值改變保留值v調(diào)節(jié)調(diào)節(jié) 值改變選擇性值改變選擇性v

19、調(diào)節(jié)柱長(zhǎng)度改變柱效及分離速度調(diào)節(jié)柱長(zhǎng)度改變柱效及分離速度記住記住 每次改變一個(gè)參數(shù)每次改變一個(gè)參數(shù)使用文獻(xiàn)方法注意點(diǎn)使用文獻(xiàn)方法注意點(diǎn)v色譜柱填料的種類、品牌是否相同色譜柱填料的種類、品牌是否相同? ?v注意文獻(xiàn)方法的流動(dòng)相注意文獻(xiàn)方法的流動(dòng)相是否損害色譜柱是否損害色譜柱? ?如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動(dòng)相如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動(dòng)相v注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長(zhǎng)注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長(zhǎng)需要調(diào)整流速、進(jìn)樣量需要調(diào)整流速、進(jìn)樣量v注意梯度條件注意梯度條件v了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）色譜方法轉(zhuǎn)換色譜方法轉(zhuǎn)換v如果沒有與文獻(xiàn)或要求相近的色譜柱如果沒有與文獻(xiàn)或要

20、求相近的色譜柱轉(zhuǎn)換進(jìn)樣量轉(zhuǎn)換進(jìn)樣量轉(zhuǎn)換流速轉(zhuǎn)換流速長(zhǎng)度內(nèi)徑，進(jìn)樣量初始初始現(xiàn)在現(xiàn)在初始LDLDLDLoadLoad22)()()(內(nèi)徑流速初始現(xiàn)在初始DDDFF22)()()(常規(guī)樣品分離的系統(tǒng)方法常規(guī)樣品分離的系統(tǒng)方法總的指導(dǎo)原則總的指導(dǎo)原則v改變可以明顯改善選擇性的條件改變可以明顯改善選擇性的條件v避免會(huì)影響方法普適性的實(shí)際問(wèn)題避免會(huì)影響方法普適性的實(shí)際問(wèn)題v減少必要的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，盡可能地利用計(jì)算機(jī)模擬減少必要的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，盡可能地利用計(jì)算機(jī)模擬v選擇適用于各種常規(guī)試樣的實(shí)驗(yàn)，以便采用同樣選擇適用于各種常規(guī)試樣的實(shí)驗(yàn)，以便采用同樣的方法建立未知樣品（離子的或中性）的的方法建立未知樣品（離子的或

21、中性）的HPLCHPLC分析方法分析方法v先做簡(jiǎn)單易行的先做簡(jiǎn)單易行的 實(shí)驗(yàn)（改變色譜柱、改變實(shí)驗(yàn)（改變色譜柱、改變pHpH、使用復(fù)雜的混合溶劑等屬于比較難做的條件）使用復(fù)雜的混合溶劑等屬于比較難做的條件）反相反相HPLCHPLC分離的總體方案設(shè)計(jì)分離的總體方案設(shè)計(jì)1 1、確定樣品是屬于常規(guī)的還是特殊的、確定樣品是屬于常規(guī)的還是特殊的 特殊樣品包括：特殊樣品包括： 無(wú)機(jī)離子無(wú)機(jī)離子 對(duì)映體對(duì)映體 生物分子生物分子 合成的高分子合成的高分子 碳水化合物碳水化合物 異構(gòu)體異構(gòu)體 2 2、選擇分離條件，進(jìn)行第一次分離、選擇分離條件，進(jìn)行第一次分離分離變量分離變量最佳的初始選擇最佳的初始選擇柱填料柱填

22、料C C8 8 或或 C C1818柱結(jié)構(gòu)柱結(jié)構(gòu)15cm15cm* *4.6 mm 4.6 mm 或或 25cm25cm* *4.6 mm4.6 mm，5 m5 m流速流速1.0 ml/min1.0 ml/min（或（或2.0 ml/min2.0 ml/min）流動(dòng)相流動(dòng)相乙腈乙腈水（中性樣品）水（中性樣品）乙腈乙腈-緩沖液（離子型樣品）（緩沖液為緩沖液（離子型樣品）（緩沖液為25-25-50mM50mM磷酸緩沖液，磷酸緩沖液，pH 2pH 23 3）對(duì)初始試驗(yàn)：對(duì)初始試驗(yàn)：5 100%B5 100%B梯度梯度溫度溫度常溫常溫進(jìn)樣量進(jìn)樣量50 L50 L（20 L 20 L ）選擇流動(dòng)相選擇流

23、動(dòng)相在反相色譜中常用水在反相色譜中常用水/ /乙腈乙腈pHpH的選擇思路的選擇思路 選低選低pHpH可以使柱硅羥基質(zhì)子化并可以使柱硅羥基質(zhì)子化并降低其色譜活性降低其色譜活性 低低pHpH與常見酸堿官能團(tuán)的與常見酸堿官能團(tuán)的pKapKa值相值相差較遠(yuǎn)，組分在此條件下的差較遠(yuǎn)，組分在此條件下的t tR R受受pHpH變化影響小變化影響小 初期應(yīng)初期應(yīng)避免使用避免使用三乙胺和離子對(duì)三乙胺和離子對(duì)試劑等添加劑試劑等添加劑 準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)樣品準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)樣品 過(guò)濾樣品過(guò)濾樣品 安裝色譜柱安裝色譜柱 沖洗柱，平衡沖洗柱，平衡 平衡檢測(cè)器平衡檢測(cè)器 進(jìn)樣進(jìn)樣 分析結(jié)果分析結(jié)果第一次第一次 HPLC 運(yùn)行運(yùn)行第一次第一

24、次 HPLC 運(yùn)行運(yùn)行選擇逐步方法開發(fā)步驟選擇逐步方法開發(fā)步驟用強(qiáng)洗脫液開始等梯度洗脫，此后每次運(yùn)行降用強(qiáng)洗脫液開始等梯度洗脫，此后每次運(yùn)行降低洗脫液強(qiáng)度低洗脫液強(qiáng)度嘗試運(yùn)行梯度嘗試運(yùn)行梯度第一次第一次 HPLC 運(yùn)行運(yùn)行 無(wú)峰無(wú)峰/ /響應(yīng)響應(yīng) 分離度差的峰分離度差的峰第一次運(yùn)行得到的結(jié)果可能第一次運(yùn)行得到的結(jié)果可能: : 檢測(cè)方法不正確檢測(cè)方法不正確 濃度太稀濃度太稀提高進(jìn)樣濃度，或者在無(wú)色提高進(jìn)樣濃度，或者在無(wú)色譜柱的條件下注射少量樣品譜柱的條件下注射少量樣品改變流動(dòng)相改變流動(dòng)相優(yōu)化系統(tǒng)優(yōu)化系統(tǒng)得到了色譜峰得到了色譜峰 - - 是是 - - 否否檢查檢查 HPLCHPLC系統(tǒng)系統(tǒng)3 3、

25、做初次運(yùn)行并根據(jù)譜圖將樣品分類、做初次運(yùn)行并根據(jù)譜圖將樣品分類 0.5k20 0.5k20 等度洗脫可行，超出此范圍等度洗脫可行，超出此范圍等度洗脫可行的樣品等度洗脫可行的樣品建議用梯度洗脫的樣品建議用梯度洗脫的樣品反相保留太弱的樣品反相保留太弱的樣品改變改變pHpH、加入離子對(duì)試劑、改變、加入離子對(duì)試劑、改變柱子、改用正相色譜柱子、改用正相色譜強(qiáng)保留樣品強(qiáng)保留樣品用非水反相或正相條件用非水反相或正相條件復(fù)雜樣品復(fù)雜樣品4 4、對(duì)等度方法，用初始梯度運(yùn)行來(lái)估計(jì)第二次等、對(duì)等度方法，用初始梯度運(yùn)行來(lái)估計(jì)第二次等度運(yùn)行的最佳度運(yùn)行的最佳B%B%5 5、評(píng)價(jià)第二次運(yùn)行中峰的質(zhì)量、評(píng)價(jià)第二次運(yùn)行中峰的

26、質(zhì)量- -柱效、峰寬、峰形柱效、峰寬、峰形 峰太寬或不對(duì)稱：要改變初始的分離條件（柱子、峰太寬或不對(duì)稱：要改變初始的分離條件（柱子、pHpH、添加劑等）、添加劑等） 運(yùn)行情況良好：平行實(shí)驗(yàn)，保證柱平衡和可重復(fù)運(yùn)行情況良好：平行實(shí)驗(yàn)，保證柱平衡和可重復(fù)的保留時(shí)間的保留時(shí)間6 6、 對(duì)等度方法，可以改變對(duì)等度方法，可以改變ACN%ACN%來(lái)改善峰間距和來(lái)改善峰間距和分離度分離度 若有必要，若有必要， ACNACN改為改為MeOHMeOH，并根據(jù)峰間距和，并根據(jù)峰間距和分離度優(yōu)化分離度優(yōu)化MeOH%MeOH% 可以進(jìn)一步混合可以進(jìn)一步混合ACNACN和和MeOHMeOH成為三元溶劑系成為三元溶劑系統(tǒng)

27、，并優(yōu)化統(tǒng)，并優(yōu)化7 7、若、若6 6方法中分離不充分，則可以改變分離的選擇方法中分離不充分，則可以改變分離的選擇性和分離的附加條件性和分離的附加條件8 8、對(duì)梯度方法，用改變梯度變化速度和柱溫來(lái)優(yōu)化、對(duì)梯度方法，用改變梯度變化速度和柱溫來(lái)優(yōu)化峰間距和分離度峰間距和分離度結(jié)果滿意，可以按等度分離方法優(yōu)化溶劑類型結(jié)果滿意，可以按等度分離方法優(yōu)化溶劑類型分離不充分，則可以改變分離的選擇性和分離的附分離不充分，則可以改變分離的選擇性和分離的附加條件加條件9 9、對(duì)梯度方法，改變初始和最后的、對(duì)梯度方法，改變初始和最后的B%B%、梯度變化速、梯度變化速度、梯度形狀可以改善分離度或縮短運(yùn)行時(shí)間度、梯度形

28、狀可以改善分離度或縮短運(yùn)行時(shí)間1010、對(duì)等度或梯度方法，改變一個(gè)柱條件（柱長(zhǎng)、流、對(duì)等度或梯度方法，改變一個(gè)柱條件（柱長(zhǎng)、流速、填料尺寸）可以提高分離度或降低運(yùn)行時(shí)間速、填料尺寸）可以提高分離度或降低運(yùn)行時(shí)間等度分離方法等度分離方法反相色譜的方法開發(fā)反相色譜的方法開發(fā)v開發(fā)過(guò)程實(shí)例開發(fā)過(guò)程實(shí)例色譜條件色譜條件v色譜柱：色譜柱：C C1818，4.6mm4.6mm15cm15cmv流動(dòng)相：乙腈流動(dòng)相：乙腈/ /水，不同的溶劑強(qiáng)度，水，不同的溶劑強(qiáng)度，60/4060/40、50/5050/50、40/6040/60，由強(qiáng)漸弱，由強(qiáng)漸弱 （或走梯度）（或走梯度）v流速：流速：1ml/min1ml/

29、min樣品：樣品： 對(duì)羥基苯甲酸甲酯對(duì)羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben)(Methyl Paraben) 對(duì)羥基苯甲酸丙酯對(duì)羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben)(Propyl Paraben) 對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben(Butyl Paraben)改變?nèi)萘恳蜃痈淖內(nèi)萘恳蜃?K K60/4050/5040/60(改變比例改變比例) 對(duì)羥基苯甲酸甲酯對(duì)羥基苯甲酸甲酯 對(duì)羥基苯甲酸丙酯對(duì)羥基苯甲酸丙酯 對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)羥基苯甲酸丁酯通過(guò)改變通過(guò)改變流動(dòng)相比例流動(dòng)相比例改變選擇性改變選擇性改變選擇性改變選擇性v通過(guò)改變通過(guò)改變流動(dòng)相組成流動(dòng)相

30、組成改變選擇性改變選擇性同樣強(qiáng)度的不同溶劑同樣強(qiáng)度的不同溶劑62:38/42:58/72:28/2322，OHCNCHOHMeOHOHTHF固定相優(yōu)化：改變色譜柱固定相優(yōu)化：改變色譜柱0246810120246810121234567891012456789103C-18C-8Optimization1010種巴比妥藥物的分離（等梯度）種巴比妥藥物的分離（等梯度）保留時(shí)間 (min)3.14 相對(duì)吸光度4.555.746.447.117.7410.7611.7912.631 巴比妥2 阿洛巴比妥3 阿普比妥4 苯巴比妥5 異丁比妥6 環(huán)戊巴比妥7 布他比妥8 海索比妥9 異戊巴比妥10 甲苯比

31、妥25% 乙腈12456789101112313優(yōu)化流動(dòng)相優(yōu)化流動(dòng)相 - - 困難的分離困難的分離010203040506070 80901000204060801000201040305060708090100乙腈乙腈/ /水水甲醇甲醇/ / 水水四氫呋喃四氫呋喃/ /水水甲醇1467253四氫呋喃乙腈1. 1.從甲醇從甲醇/ /水開始，優(yōu)化溶劑組成水開始，優(yōu)化溶劑組成以使所有色譜峰在合理的以使所有色譜峰在合理的 k k 范圍范圍流出流出. .2. 2.選擇洗脫強(qiáng)度相等的乙腈選擇洗脫強(qiáng)度相等的乙腈/ /水混水混合流動(dòng)相進(jìn)行下一次分析合流動(dòng)相進(jìn)行下一次分析. .3. 3.用四氫呋喃用四氫呋喃/

32、 /水流動(dòng)相重復(fù)分析水流動(dòng)相重復(fù)分析4. 4.按比例混合等強(qiáng)度流動(dòng)相再進(jìn)按比例混合等強(qiáng)度流動(dòng)相再進(jìn)行進(jìn)樣分析行進(jìn)樣分析 優(yōu)化優(yōu)化三種流動(dòng)相的比較三種流動(dòng)相的比較1 巴比妥1111.81.61.62 阿洛巴比妥2221.21.11.13 阿普比妥3441.11.11.14 苯巴比妥4331.2 1.41.35 異丁比妥5551.1116 話環(huán)戊巴比妥6661.11.11.17 布他比妥7791.51.21.18 海索比妥8971.111.19 異戊巴比妥910101.11.41.810 甲苯比妥108825%乙腈35%甲醇21%異丙醇洗脫順序洗脫順序 選擇性離子型化合物的分離方式離子型化合物的分

33、離方式v使用離子交換柱使用離子交換柱離子交換法離子交換法主要用于主要用于“強(qiáng)強(qiáng)”陰、陽(yáng)離子陰、陽(yáng)離子v使用反相柱使用反相柱v通過(guò)改變流動(dòng)相的通過(guò)改變流動(dòng)相的pHpH值，使樣品成中性值，使樣品成中性v加入加入“對(duì)離子對(duì)離子”，使樣品呈中性，使樣品呈中性v離子型化合物在反相色譜柱上不保留離子型化合物在反相色譜柱上不保留v改變流動(dòng)相的改變流動(dòng)相的pHpH值，抑制樣品離子的電離值，抑制樣品離子的電離v適用于弱酸性化合物的分離適用于弱酸性化合物的分離降低流動(dòng)相的降低流動(dòng)相的pHpH值，使樣品降低離子化值，使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)使用硅膠基質(zhì)C C1818填料填料v使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)使用條件

34、應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的硅膠柱的pHpH在在2-82-8內(nèi)內(nèi)如果：如果：一些酸在一些酸在pHpH低于低于2 2時(shí)還保持離子化時(shí)還保持離子化一些堿在一些堿在pHpH高于高于7 7時(shí)還保持離子化時(shí)還保持離子化v可以有以下的選擇可以有以下的選擇離子交換色譜離子交換色譜使用聚合物反相柱，在使用聚合物反相柱，在pHpH高于高于7 7時(shí)用離子抑制法時(shí)用離子抑制法使用使用“離子對(duì)色譜法離子對(duì)色譜法”分離弱離子化化合物的初始實(shí)驗(yàn)條件分離弱離子化化合物的初始實(shí)驗(yàn)條件水相緩沖液水相緩沖液 / /乙腈乙腈可變可變 (k = 0.5(k = 0.520)20)分離變量分離變量初始選擇初始選擇尺寸尺寸粒度粒度鍵合相

35、鍵合相15 (15 (或或 25) x 0.46 cm25) x 0.46 cm5 5 或或 3.5 3.5 m mC C18 18 或或 C C8 8溶劑溶劑 A A 和和 B B（% B% B）溫度溫度體積體積質(zhì)量質(zhì)量4040C C 20 20 L L 25 1.51.5的的條件下，柱效的條件下，柱效的變化對(duì)采用峰面變化對(duì)采用峰面積定量的定量分積定量的定量分析結(jié)果沒有影響析結(jié)果沒有影響，而對(duì)使用峰高，而對(duì)使用峰高定量的定量分析定量的定量分析結(jié)果有影響結(jié)果有影響。 v如其他因素不變，如：如其他因素不變，如：K， ，流速等，柱效增加流速等，柱效增加峰面積基本不變，而峰高峰面積基本不變，而峰高增加增加6241.01.11.2231 液相色譜流動(dòng)相的液相色譜流動(dòng)相的組成變化，如采用梯組成變化，如采用梯度洗脫時(shí)，固定相、度洗脫時(shí)，固定相、洗脫液和待測(cè)組分之洗脫液和待測(cè)組分之間的平衡很難保持一間的平衡很難保持一致，洗脫時(shí)基線也常致，洗脫時(shí)基線也常出現(xiàn)漂移使峰面積、出現(xiàn)漂移使峰面積、峰高測(cè)量產(chǎn)生誤差。峰高測(cè)量產(chǎn)生誤差。樣 品15l對(duì)二甲氧基苯色譜柱Resolve Silica溶 劑二氯甲烷/戊烷 從85:75到60:45k =3.0k =1.9k =4.9k =1.54 4、檢測(cè)器特性、檢測(cè)器特性 檢測(cè)器工作的穩(wěn)定性和線性范圍直接影響色譜定量檢測(cè)器工作的穩(wěn)定性和線性范圍直接影響色