中藥指紋圖譜操作指南

1、叮叮小文庫中藥指紋圖譜操作指南說明：本實(shí)驗(yàn)研究規(guī)程指南為在原技術(shù)要求的基礎(chǔ)上規(guī) 范中藥注射劑色譜指紋圖譜試驗(yàn)研究而制訂。本指南未能概 括的內(nèi)容，通過實(shí)踐可自行補(bǔ)充調(diào)整，但申報(bào)資料或復(fù)核資 料中須有相應(yīng)的說明和申述。指南中的 色譜指紋圖譜 指采 用柱色譜及薄層色譜等各種色譜技術(shù)實(shí)驗(yàn)研究的指紋圖譜。 光譜指紋圖譜將另行規(guī)定。 一、 供試品收集 供試 品收集是研究指紋圖譜最初也是最關(guān)鍵的步驟，由于不可能 對一個(gè)藥材的所有樣本進(jìn)行試驗(yàn)，而且生長環(huán)境條件對藥材 代謝產(chǎn)物有影響，所以要收集有代表性的供試品。收集不少 于 10 批供試品的含義是指樣本的數(shù)和量要有足夠的代表性。 （一 ） 原料藥材： 在藥材的

2、化學(xué)成分與中醫(yī)臨床療效的之間的 關(guān)聯(lián)尚未能闡明的現(xiàn)階段，基本上是在承認(rèn)其傳統(tǒng)的功能主 治及臨床驗(yàn)證的基礎(chǔ)上進(jìn)行指紋圖譜的實(shí)驗(yàn)研究。原料藥材 的指紋圖譜主要是反映其自然狀態(tài)的內(nèi)在質(zhì)量情況，研究其 指紋圖譜是以此作為選擇原藥材投料或混批提取的依據(jù)，同 時(shí)作為研究注射劑成品指紋圖譜相關(guān)性的基礎(chǔ)。由于自然條 件的變化，藥材個(gè)體之間指紋圖譜的差異是正常的，在品種 鑒定無誤的基礎(chǔ)上，力爭藥材有較為固定和穩(wěn)定的來源，個(gè) 體之間的指紋圖譜主要特征大致相似即可，使成品指紋圖譜 特征的穩(wěn)定有起碼的保證。藥材的批不是工業(yè)生產(chǎn)的批，是指相互獨(dú)立的供試 品，即不能將同一地點(diǎn)或同一渠道同一時(shí)間獲得的供試品分 成若干份供試

3、品，以保證試驗(yàn)結(jié)果的代表性。由于收集藥材 供試品受主觀和客觀的條件限制，供試驗(yàn)的供試品嚴(yán)格講均 沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義， 所以供試品數(shù)越多越好，10批是最低的 要求。供試品應(yīng)保證其真實(shí)性，應(yīng)有完整米樣原始記錄，內(nèi) 容包括： 藥材名稱供試品來源（真實(shí)記錄供試品來自何處：傳統(tǒng)產(chǎn)地收集或是 資源豐富的產(chǎn)地收集，或者來自GAP基地供應(yīng)；還是產(chǎn)地購買、市場購買或委托購買，等，以便于生產(chǎn)原料的采購選 擇和測試數(shù)據(jù)的可追溯）。收集時(shí)間（購買時(shí)間）及收集人貨源情況調(diào)查（貨源是否充足和穩(wěn)定） 基原鑒定及鑒定人：產(chǎn)地或 GAP基地收集的藥材結(jié)合植物 形態(tài)鑒定品種。如缺原植物，由熟練的專業(yè)人員憑性狀或顯 微特征鑒別。如近

4、緣品種、難以區(qū)分的野生品種（如白花蛇 舌草、蒲公英），應(yīng)在指紋圖譜研究中仔細(xì)比較，如獲得的 指紋圖譜相似度很高，也可應(yīng)用，但須明確記錄。并在今后 實(shí)施GAP時(shí)確定一個(gè)品種，如指紋圖譜相似度很低，則須 確定品種，改為栽培品使用。商品混亂的品種（如陳皮）產(chǎn) 區(qū)的選擇應(yīng)縮小范圍，并結(jié)合資源選用藥典收載品種中的一 種。復(fù)方制劑中的君藥及處方量大的藥材必需重點(diǎn)注意品種 的鑒定，以避免今后執(zhí)行指紋圖譜過程中出現(xiàn)難以預(yù)料的困 難。質(zhì)量評估：為了便于對色譜的正確分析，減少試驗(yàn)結(jié)果的判 斷誤差，首先藥材需符合藥典或部頒標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，并詳細(xì)記錄所有藥材均須編號，必要時(shí)附藥材外形照片。供試品的留樣、貯藏和標(biāo)簽：由于指紋

5、圖譜研究周期較長，供試品必須在干燥、低溫、避光處貯藏，標(biāo)簽必須有編號， 收集供試品的編號應(yīng)與貯藏樣品、試驗(yàn)樣品的編號一致。留 樣數(shù)量應(yīng)不少于試驗(yàn)實(shí)際用量的3倍。以保證試驗(yàn)結(jié)果有異議時(shí)的可追溯。如以中藥飲片或炮制品為起始原料，應(yīng)采用符合中國藥典或 飲片炮制規(guī)范的供試品。申報(bào)資料可將關(guān)鍵內(nèi)容扼要填寫于表一中：表一（推薦）藥材名稱供試品編號供試品來源收集時(shí)間（購買時(shí)間）及收集人貨源情況調(diào)查基原鑒定及鑒定人學(xué)名：鑒定人：質(zhì)量評估供試品留樣 數(shù)量： 容器：貯藏地點(diǎn)及條件：標(biāo)簽原始記錄保存處附一：藥材外形照片。附二：藥材的色譜圖（試驗(yàn)完畢后）。（二）半成品（提取物）:藥材所含成分的個(gè)體差異是難以避免的，指

6、紋圖譜研究用的半成品應(yīng)來自生產(chǎn)車間通過藥材混批調(diào)整及規(guī)范的 生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的實(shí)際樣品。關(guān)鍵技術(shù)及相應(yīng)參數(shù)填寫于表 二，并附試驗(yàn)完畢后指紋圖譜。表二（推薦）半成品（提取物）名稱 混批前批號日期提取方法（關(guān)鍵技術(shù)）混批后批號混批比例原始記錄保存處供試品留樣 數(shù)量：？?容器：？?貯藏地點(diǎn)及條件：？ 附: 混批前后的指紋圖譜。（三）成品（注射劑）：產(chǎn)品批號、生產(chǎn)單位、成品批號與半成品（提取物）批號的相關(guān)性均須 有明確的記錄，以保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可追溯。成品的“對照用 指紋圖譜”是建立在標(biāo)準(zhǔn)化提取物或10批以上產(chǎn)品指紋圖譜的基礎(chǔ)上。各批供試樣品須有留樣。 主要內(nèi)容填寫于表三， 并附試驗(yàn)完畢后的指紋圖譜。表三（

7、推薦）供試品批號生產(chǎn)單位供試品數(shù)量供試品留樣 數(shù)量：？?容器：？?貯藏地點(diǎn)及條件：？ 指 紋圖譜研究用的原藥材、半成品及注射劑成品均應(yīng)有10批以上的樣品供實(shí)驗(yàn)，以保證指紋圖譜的可重復(fù)性。二、供試品溶液的制備（一）藥材供試品溶液的制備取樣：供試品取樣應(yīng)注意代表性，以保持實(shí)驗(yàn)室取樣與實(shí) 際生產(chǎn)應(yīng)用藥材一致，例如地上部分的藥材，取樣約0.51Kg，分別稱量莖、葉、花、果的大致比例并做記錄。例如 果實(shí)類藥材，生產(chǎn)時(shí)去除種子的，供試品也應(yīng)除去種子，并 做記錄。如果藥材表觀質(zhì)量不均勻（如大小不一、肥瘦不等、粗細(xì)不勻等），應(yīng)注意供試品的取樣有代表性，其后的試驗(yàn) 中，必要時(shí)應(yīng)做比較試驗(yàn)，以考察所含成分有無顯著

8、差異， 供生產(chǎn)參考。稱樣：應(yīng)按照常規(guī)要求，將選取的供試品適當(dāng)粉碎后混合均 勻，再從中稱取試驗(yàn)所需的數(shù)量，一般稱取供試品與選取樣 品的比例為1: 10,即如稱取1g供試品，應(yīng)在混合均勻的 10g選取的樣品中稱取。因?yàn)橹讣y圖譜需要提供量化的信 息，稱取供試品的精度一般要求取3位有效數(shù)字。制備：藥材指紋圖譜的主要目的，一是考察藥材本身的質(zhì)量 情況，二是以藥材的指紋圖譜為參比，提取物及制劑的指紋 圖譜與之比較，以考察制劑與原藥材的相關(guān)性。藥材供試品 溶液的制備，可選用適宜的溶劑和提取方法，定量操作進(jìn)行， 盡量使藥材中的成分較多地在色譜圖中反映出來，并達(dá)到較 好的分離。最終制備的供試品溶液還應(yīng)能適應(yīng)色譜

9、試驗(yàn)的需 要，如液相色譜的供試品溶液宜用色譜流動相或色譜洗脫強(qiáng) 度較弱的溶劑；薄層色譜用的供試品溶液可采用液液萃取或 固液萃取，選用適宜的溶劑制備供試品溶液。氣相色譜的供 試品可采用水蒸氣蒸餾法、頂空進(jìn)樣法或固相微萃取法，供 試品如需使用溶劑，應(yīng)用低極性低沸點(diǎn)的溶劑。定容：供試品溶液最終應(yīng)用適宜的溶劑溶于標(biāo)定容量的容器 中，制成標(biāo)示濃度的供試品溶液（g/mL或mg/mL ）。 放置：一般要求供試品溶液盡量新鮮配制，如連續(xù)試驗(yàn)需要，供試品溶液應(yīng)在避光、低溫、密閉容器條件下短期放置，一 般不超過兩周，溶液不穩(wěn)定的，一般不超過48小時(shí)。標(biāo)簽：須注明編號或批號，應(yīng)與取樣的藥材編號一致，或有 明確的關(guān)聯(lián)

10、，以保證數(shù)據(jù)的可追溯。主要操作過程及數(shù)據(jù)應(yīng)詳細(xì)記錄。（二）半成品（提取物）供試品溶液的制備：稱取不同批次的半成品（提取物），參照供試品溶液 的制備方法中相應(yīng)的內(nèi)容制備成一定量的溶液，備用。標(biāo)簽 須注明編號或批號，應(yīng)與取樣的藥材編號一致，或有明確的 關(guān)聯(lián)，以保證數(shù)據(jù)的可追溯。主要操作過程及數(shù)據(jù)應(yīng)詳細(xì)記 錄。（三）成品（注射劑）供試品溶液制備：液體注射劑一般可直接或稀釋后作為供試品溶液，必要時(shí)也可用適宜的溶 劑提取并制備成一定量的溶液。固體形式的注射劑（凍干粉針）須注意注射劑成品的附加劑有無對色譜試驗(yàn)干擾。如有 干擾，須研究采取適宜的樣品預(yù)處理方法以排除干擾（如含 有氯化鈉則液相色譜不可使用蒸發(fā)光

11、散射檢測器；如糖分太 多，可能影響薄層色譜的清晰度和分離度；凍干粉針的骨架 劑用量較大時(shí)也可能影響色譜的質(zhì)量等）。此外，單方注射劑藥材或復(fù)方注射劑中不同藥材成分類別如果相差較大，色 譜條件要求不同，需要進(jìn)行樣品的預(yù)處理時(shí)，應(yīng)分別進(jìn)行試 驗(yàn)，便于制備2張以上的指紋圖譜。主要步驟及數(shù)據(jù)應(yīng)詳細(xì) 記錄。三、參照物（一）參照物的選擇：指紋圖譜的參照物質(zhì)一般選取容易獲取的一個(gè)以上注射劑中的主要活 性成分或指標(biāo)成分，主要用于考察指紋圖譜的穩(wěn)定程度和重 現(xiàn)性，并有助于色譜的辨認(rèn)。在與臨床藥效未能取得確切關(guān) 聯(lián)的情形下，參照物（復(fù)方注射劑應(yīng)首選君藥的活性成分或 指標(biāo)成分）起著辨認(rèn)和評價(jià)色譜指紋圖譜特征的指引作用

12、， 它并不等同于含量測定的對照品。指紋圖譜一般色譜比較復(fù) 雜，內(nèi)標(biāo)物不易選擇，也不易插入，指紋圖譜不是含量測定， 故內(nèi)標(biāo)物的作用也不等同于含量測定的內(nèi)標(biāo)物，因此應(yīng)慎重 考慮選用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的必要性和可能性。參照物應(yīng)說明名稱、 來源和純度。如無參照物也可選指紋圖譜中的穩(wěn)定的色譜峰 做為參照峰，說明其色譜行為和有關(guān)數(shù)據(jù)，并應(yīng)盡可能闡明 其化學(xué)結(jié)構(gòu)及化學(xué)名稱。如情況需要，又有可能也可考慮選 擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物插入色譜中。（二）參照物溶液的制備: 精密稱取，用適宜的溶劑制成標(biāo)示濃度的溶液，備用。四、實(shí)驗(yàn)常用的色譜技術(shù)有薄層色譜、液相色譜、氣相色譜及其他色譜技術(shù)。須注意各種色譜技術(shù)的特點(diǎn)和不足， 結(jié)合實(shí)際選用。

13、不論何種色譜技術(shù)，選用的原則是必需具有 良好的專屬性、重現(xiàn)性和可行性。專屬性：建立的指紋圖譜必須能夠表達(dá)該品種的特征， 即唯一性。重現(xiàn)性：同一品種同一樣品指紋圖譜中構(gòu)成指紋的各特 征峰（斑點(diǎn)）作為整體（峰位、峰數(shù)、峰的豐度、各峰的大 致比例）在不同實(shí)驗(yàn)室和不同操作者之間得到的色譜整體特 征應(yīng)有較高的相似度，以表明方法的可行性。同一品種不同 樣品之間的相似度不屬于此范圍?？尚行裕荷V方法和試驗(yàn)條件應(yīng)易于推廣和便于執(zhí)行， 即一旦由藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)成為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容后，生 產(chǎn)企業(yè)、中等水平的分析實(shí)驗(yàn)室和省級以上的法定檢驗(yàn)機(jī)構(gòu) 均可執(zhí)行該標(biāo)準(zhǔn)。（一）實(shí)驗(yàn)室：承擔(dān)色譜指紋圖譜的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合以下6個(gè)條

14、件：1、實(shí)驗(yàn)室具備承擔(dān)指紋圖譜的總體能力；2、實(shí)驗(yàn)室設(shè)備通過檢驗(yàn)證明符合指紋圖譜試驗(yàn)研究的 需要；3、技術(shù)人員具備從事指紋圖譜試驗(yàn)研究的能力；4、對實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)能力評價(jià)應(yīng)有定期的內(nèi)部的獨(dú)立檢查;5、試驗(yàn)數(shù)據(jù)有可追溯，與其他實(shí)驗(yàn)室有可比性；6、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有質(zhì)量保證體系，以確保各種措施實(shí)施的 透明和一致。（二）儀器：所用的儀器性能應(yīng)能滿足指紋圖譜 試驗(yàn)的需要，并須經(jīng)校驗(yàn)；如果同一臺儀器有兩個(gè)以上的項(xiàng) 目共用，須有特別措施保證儀器的清洗和維護(hù)，儀器使用要 有明確記錄。液相色譜柱記錄商品名稱、生產(chǎn)廠家及相關(guān)參數(shù)（固定相、柱長度、內(nèi)徑、填料粒度等）；一般需用三根以上不同生產(chǎn)廠家的柱子進(jìn)行比較，經(jīng)比較試驗(yàn)后

15、應(yīng)固定色 譜柱來源與規(guī)格。色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性試驗(yàn)可用該品種指紋圖 譜所用的參照物，參照常法進(jìn)行，如柱效明顯降低，在排除 其它因素后，說明該色譜柱不能繼續(xù)使用。另一方法是用制 作對照用指紋圖譜的提取物留樣樣品定期重復(fù)試驗(yàn)，將前 后得到的指紋圖譜垂直疊加，直觀比較，各指紋特征峰是否 能重合及整個(gè)色譜的形狀是否有變異，如有變異致使指紋特 征已難以辨認(rèn)，或選擇難分離的一對或一組峰，其分離度如 明顯降低，在排除其他可能的影響因素后，可認(rèn)作該色譜柱 不能使用。儀器使用人、使用時(shí)間及周期應(yīng)有記錄。薄層色譜系離線操作，薄層板為一次性器材，不存在重 復(fù)使用問題，但不同廠家的商品預(yù)制薄層板質(zhì)量可能不一 致，手工自制

16、的薄層板只能供篩選試驗(yàn)條件使用，用確定的 條件制作指紋圖譜（圖像）時(shí)必須用有質(zhì)量保證的商品預(yù)制 薄層板（如Silicagel 60 , Merck等）。圖譜攝像時(shí)如用數(shù)碼攝 像機(jī)，解像度應(yīng)在 20,00,000象素以上，熒光色譜須在薄層 色譜專用的紫外光燈箱下加濾光片拍攝。如有相應(yīng)的積分軟 件，可立即生成輪廓掃描圖以及積分?jǐn)?shù)據(jù)；也可用常規(guī)的薄 層色譜掃描儀進(jìn)行積分和繪制輪廓圖譜。薄層掃描儀的機(jī)械 部分、電子部分及光源需定期校驗(yàn)。氣相色譜如色譜柱類型、長度、內(nèi)徑、老化條件、載氣、流速、柱溫、柱頭壓力、進(jìn)樣方式、進(jìn)樣口溫度、檢測器等 均需考察；儀器除定期檢查校驗(yàn)外，填充柱或毛細(xì)管柱的柱 效也應(yīng)參照

17、液相色譜柱定期校驗(yàn)柱效。其他種類的色譜儀參 照上述原則校驗(yàn)和記錄。各種儀器均須按照儀器操作手冊以及SOP進(jìn)行。（三）試驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件：色譜指紋圖譜試驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件的優(yōu)選：試驗(yàn)條件應(yīng)能滿足指紋圖譜的需要，不宜簡單套 用含量測定用的試驗(yàn)條件，并需根據(jù)指紋圖譜的特點(diǎn)進(jìn)行試 驗(yàn)條件的優(yōu)選。試驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件選擇的目的是通過比較實(shí)驗(yàn)，從 中選取相對簡單易行的方法和條件，獲取足以代表品種特征 的指紋圖譜，以滿足指紋圖譜的專屬性、重現(xiàn)性和普遍適用 性的要求。方法和條件須經(jīng)過嚴(yán)格的方法學(xué)驗(yàn)證。由于色譜 指紋圖譜具有量化的概念，所以從樣品的稱取、供試液的制 備和進(jìn)行色譜分析時(shí)均須定量操作。在指紋圖譜研究中，

18、 量化的含義是指在定量操作的條件下所得到的指紋圖譜在 整體特征上可以作半定量的比較，以表達(dá)供試品個(gè)體之間指 紋圖譜在量方面的總體差異程度，以及半成品（提取物） 和成品之間及成品批間指紋圖譜在 量方面的相似程度。選擇試驗(yàn)方法及試驗(yàn)條件須根據(jù)供試品的特點(diǎn)和需要 設(shè)計(jì)合適的試驗(yàn)方案，在保證專屬性、重現(xiàn)性的前提下，宜 選擇簡單、實(shí)用、便于實(shí)施的方法和試驗(yàn)條件，并需要進(jìn)行 方法學(xué)驗(yàn)證。（四）試驗(yàn)中應(yīng)注意的事項(xiàng)：（1）液相色譜的色譜柱需做比較試驗(yàn)加以選擇，流動相至少用三種不同組成進(jìn)行比較，并從中選取最合適的色譜條 件。目前，高效液相色譜一般為反相色譜，采用十八烷基硅 烷鍵合相柱，特殊情況下可選擇其他類型的

19、化學(xué)鍵合相柱。 不同生產(chǎn)廠家不同牌號的色譜柱因選用的硅膠原料、鍵合條 件、封尾情況等的差異，致使在性能上互有差異，故通過試 驗(yàn)比較，選擇合適的色譜柱很重要，選用的色譜柱最好是多 數(shù)實(shí)驗(yàn)室常用的。如需梯度洗脫時(shí)，應(yīng)盡量采用線性梯度。 并應(yīng)報(bào)告儀器梯度滯后時(shí)間。測定梯度滯后時(shí)間，可用一零 死體積連接器代替色譜柱，以甲醇為溶劑 A，含0.1%丙酮的甲醇為溶劑B，檢測波長為260nm，運(yùn)行0100% B的線性 梯度，梯度時(shí)間20分鐘，流速1.0ml/min，記錄梯度圖形， 測定梯度曲線中間點(diǎn)的時(shí)間，減去10分鐘，即得。不同的 儀器，由于梯度滯后時(shí)間的不同，可能影響方法的重現(xiàn)性， 通?？赏ㄟ^調(diào)整進(jìn)樣和梯

20、度起始時(shí)間減少這種影響。檢測器 最常見的是紫外-可見光檢測器，文獻(xiàn)報(bào)道的檢測波長常常是 為含量測定某一特定成分，不一定完全適合指紋圖譜的需 要，為了獲取多層次的信息，常常需要選擇數(shù)個(gè)不同的檢測 波長，條件許可的可使用二極管陣列檢測器，獲取不同波長 得到的色譜圖，從中汲取更多的信息。對在紫外區(qū)無吸收的 化合物，也可選擇其它類型的檢測器，如差示折光檢測器或 蒸發(fā)光散射檢測器等。(2) 薄層色譜一般采用常規(guī)硅膠預(yù)制板或高效硅膠預(yù)制 板，必要時(shí)也可選用聚酰胺薄膜板或纖維素薄層板等，選用 時(shí)主要是保證色譜圖像的質(zhì)量，劣質(zhì)的預(yù)制板不能使用。展 開用溶劑系統(tǒng)的選擇至少需做三種不同展開系統(tǒng)的比較，另 外，需注

21、意觀察溫度和相對濕度對色譜行為的影響。雜質(zhì)的 干擾對柱色譜，常常是隱性的；薄層色譜則由于樣品供試 液中所有成分均可在薄層板上觀察，所以雜質(zhì)成分對色譜的 干擾是顯性的，可直觀地反映在薄層色譜上，甚至直接影 響指紋圖譜的觀察，因此樣品供試液的預(yù)處理常常是需要考 慮的步驟之一。薄層色譜指紋圖譜宜在同板將 對照用提取物 與供試品平行比較，即每一薄層板必須有隨行對照用提取物或相應(yīng)的參照物。顯色劑分通用顯色劑和專屬顯色劑，結(jié)合使用可在一個(gè)色譜條件下得到的指紋圖譜獲取成分類別 或化學(xué)成分功能團(tuán)的信息，如生物堿、黃酮類、三萜類、甾 體類、香豆素類等，專用的顯色劑可以直觀地顯示各自的特 征。(3) 氣相色譜通常

22、使用毛細(xì)管柱，如填充柱得到的色譜 雖然簡單，但如確能表達(dá)該品種的指紋特征，也可采用。一一 般極性與非極性固定相均須比較，以確定選用合適的固定 相。色譜運(yùn)行時(shí)間能保證供試品中的成分均能流出色譜柱。 如需要將相對保留時(shí)間作為固定的常數(shù)(保留指數(shù))，也可根據(jù)實(shí)際需要和可能選取 1,2個(gè)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)計(jì)算。如需程序升 溫宜采用線性升溫，盡量避免復(fù)雜的多階程序。其它色譜技術(shù)可參照上述基本要求設(shè)計(jì)試驗(yàn)。色譜中的參照峰由于作用不同于含量測定，提高其分離 度應(yīng)以不犧牲色譜的整體特征為前提，所以不應(yīng)孤立地苛求 其分離度必需達(dá)到含量測定的要求。試驗(yàn)研究中一般需要實(shí)驗(yàn)室模擬生產(chǎn)工藝制備供試品 溶液，作為實(shí)驗(yàn)室模擬樣品，以

23、考察試驗(yàn)條件，并與實(shí)際生 產(chǎn)的供試品的指紋圖譜作參考比較。由于實(shí)驗(yàn)室制備條件不 可能與大生產(chǎn)工藝制備的產(chǎn)品完全一致，在其后的相關(guān)性比 較時(shí)，有關(guān)數(shù)據(jù)僅供參考用，如大生產(chǎn)樣品與實(shí)驗(yàn)室模擬樣 品指紋圖譜相差十分明顯，則提示有必要從生產(chǎn)工藝和實(shí)驗(yàn) 室模擬樣品兩方面檢查原因。五、色譜指紋圖譜的建立和辨認(rèn)試驗(yàn)條件確立后，將獲得的所有樣品的指紋圖譜逐一研究比較，首先試驗(yàn)人員應(yīng)將原藥材、半成品（提取 物）、成品的指紋圖譜分別直觀比較。一張指紋圖譜，特別 是分辨率較高的圖譜，必須制備有足夠代表性的樣品的圖 譜，仔細(xì)觀察，首先找出藥材色譜具有指紋意義的各個(gè)峰， 給以編號，藥材、半成品和成品之間的圖譜比較，如有缺

24、峰，則缺號，以保持峰的編號不變，便于清楚地考察相互之間的 相關(guān)性。半成品（提取物）的指紋圖譜與原藥材的指紋圖譜 應(yīng)有一定的相關(guān)性，即半成品（提取物）指紋圖譜的特征應(yīng) 在原藥材的指紋圖譜中可以追溯，而原藥材中的某些特征在 提取物指紋圖譜中允許因生產(chǎn)工藝關(guān)系而有規(guī)律的丟失。半 成品（提取物）指紋圖譜與成品（注射劑）的指紋圖譜應(yīng)有 較高的相關(guān)性。中藥復(fù)方注射劑如處方藥味較多，藥量各異，成分復(fù)雜，難以要求在指紋圖譜中全部體現(xiàn)，但作為原料的 各味藥材，必須研究各自的指紋圖譜。有的品種某一種成分 含量很高（如黃苓中的黃苓苷），在色譜圖中占絕對優(yōu)勢， 其它特征很弱，雖然這本身就是特征，但有時(shí)為了區(qū)別用藥 材

25、作起始原料和單一成分直接投料（如用黃苓苷代替黃苓藥 材）,可試用不同的檢測波長或不同色譜方法，突出其它特 征，相互參照辨認(rèn)。有的復(fù)方注射劑數(shù)種藥材均含同一類別 的成分，而且成分又較多時(shí)（如人參、三七、黃芪并存）,建立指紋圖譜的難度很大，除盡量改進(jìn)試驗(yàn)條件，提高色譜 的分辨率外，可用陰性對照，考察相關(guān)峰的疊加關(guān)系， 此時(shí)，各指紋峰之間比例的穩(wěn)定成為重要特征。因此更說明用藥材 的標(biāo)準(zhǔn)提取物投料將是必然的發(fā)展趨勢。指紋圖譜的辨認(rèn)應(yīng)注意指紋特征的整體性。一個(gè)品種的指紋圖譜是由各 個(gè)具有指紋意義的峰組成的完整圖譜構(gòu)成，各個(gè)有指紋意義 的峰（或薄層色譜的斑點(diǎn)）其位置（保留時(shí)間或比移值）、大小或高低（積分面

26、積或峰高）、各峰之間相對的比例是指 紋圖譜的綜合參數(shù)，辨認(rèn)和比較時(shí)從整體的角度綜合考慮， 注意各有指紋意義的峰相互的依存關(guān)系。液相色譜不同儀器 可能因滯留體積不同等原因?qū)е卤Ａ魰r(shí)間的漂移。薄層色譜 的比移值不同實(shí)驗(yàn)室漂移現(xiàn)象更較常見，所以比較色譜的整 體特征很重要，不宜糾纏細(xì)枝末節(jié)。指紋圖譜的評價(jià)指標(biāo)是 供試品指紋圖譜與該品種對照用指紋圖譜（共有模式）及供 試品之間指紋圖譜的相似性。指紋圖譜的相似性從兩個(gè)方面 考慮，一是色譜的整體面貌，即有指紋意義的峰的數(shù)目、 峰的位置和順序、各峰之間的大致比例（薄層色譜還有斑點(diǎn) 的顏色）等是否相似，以判斷樣品的真實(shí)性。二是供試品與 對照樣品或?qū)φ沼弥讣y圖譜之

27、間及不同批次樣品指紋圖譜 之間總積分值作量化比較。如總積分面積相差較大（如土20%），則說明同樣量的樣品含有的內(nèi)在物質(zhì)有較明顯的量的差異，這種差異是否允許，應(yīng)視具體品種，具體工藝的實(shí) 際情況，并結(jié)合含量測定項(xiàng)目綜合判斷。這種比較應(yīng)在同一 臺儀器平行進(jìn)行測定。為了減輕日常檢驗(yàn)的煩瑣計(jì)算，積分?jǐn)?shù)據(jù)可以簡化為3位有效數(shù)字，或者直接讀取圖譜縱坐標(biāo)的 刻度值。因?yàn)榉e分值本身由于不同成分響應(yīng)不同，而且量的 多少與真值不一定呈線性關(guān)系；指紋圖譜的功能不同于含量 測定，它只需要數(shù)量的大概信息。 相似性比較可以用相似度 表達(dá)，相似度可以借助藥典會推薦的中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評價(jià)軟件計(jì)算，除個(gè)別品種視具體情

28、況而定外， 一般成品指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果在0.91.0（或以90100表示）之間作為符合要求。自行開發(fā)的軟件必需公開算法。 申報(bào)資料中除相似度計(jì)算結(jié)果外，需附指紋圖譜。相似度小 于0.9，但直觀比較難以否定的供試品，可進(jìn)一步采用模式 識別方法（如主成分分析）檢查原因。六、色譜指紋圖譜的校驗(yàn)和復(fù)核生產(chǎn)企業(yè)申報(bào)的色譜指紋圖譜須經(jīng)獨(dú)立于生產(chǎn)企業(yè)以外的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行校驗(yàn)，以確認(rèn)其專屬性和重 現(xiàn)性。國家藥品監(jiān)督管理局指定的省級藥品檢驗(yàn)所負(fù)責(zé)研制 單位申報(bào)資料的技術(shù)審核與實(shí)驗(yàn)復(fù)核，除另有規(guī)定外，已上 市品種的指紋圖譜復(fù)核，如同品種經(jīng)統(tǒng)一研究確定方法的指 紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核由省級藥品檢驗(yàn)所進(jìn)行；廠家自己研制的指

29、紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核由省級藥品檢驗(yàn)所進(jìn)行，并由國家藥典會組 織另一藥品檢驗(yàn)所對其進(jìn)行二次復(fù)核。半成品（提取物）不 做復(fù)核試驗(yàn)，只做文字資料的技術(shù)審核，以判斷成品與原料 及半成品（提取物）的相關(guān)性以及申報(bào)資料內(nèi)容是否合理。進(jìn)行資料審核時(shí)注意申報(bào)的資料是否進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)考所申察和驗(yàn)證，書面審核內(nèi)容包括提取方法、提取溶劑、色譜柱 或薄層板、色譜系統(tǒng)、檢測波長等的選擇；精密度、方法穩(wěn) 定性、重現(xiàn)性及成品儲放后指紋圖譜的穩(wěn)定性等考察，結(jié)果 可通過相似度軟件檢查，結(jié)果相似度均應(yīng)在0.9以上。報(bào)的上述資料應(yīng)書寫規(guī)范，數(shù)據(jù)齊全。除情況確實(shí)需要外， 一般復(fù)核單位不再進(jìn)行方法學(xué)復(fù)核試驗(yàn)，但復(fù)核單位本身對 注射劑成品的

30、復(fù)核試驗(yàn)仍須進(jìn)行自身的方法學(xué)驗(yàn)證。復(fù)核申報(bào)的指紋圖譜試驗(yàn)，應(yīng)與原申報(bào)資料提供的試驗(yàn)條件 相同。如復(fù)核結(jié)果難以與申報(bào)資料的指紋圖譜吻合，應(yīng)結(jié)合 申報(bào)資料的有關(guān)內(nèi)容和數(shù)據(jù)以及復(fù)核單位的全部圖譜及數(shù) 據(jù)，客觀地公正地分析原因。必要時(shí)，由第三方再復(fù)核。也 可以隨行對照用提取物為參照，與供試品由申報(bào)單位和復(fù)核 單位分別在各自實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核對試驗(yàn)，雙方供試品與對照用 提取物的指紋圖譜平行比較。如各自均能重復(fù)自身的結(jié)果， 而色譜的指紋特征又可以相互印證，雖與標(biāo)準(zhǔn)所附對照用指 紋圖譜有所差異，但相似度檢查均能通過，也可考慮予以認(rèn) 可。但同一實(shí)驗(yàn)室在完全相同的條件下獲得的指紋圖譜不應(yīng) 發(fā)生上述情況。故每次檢驗(yàn)時(shí)均應(yīng)用隨行對照提取物同時(shí)試 驗(yàn)，并進(jìn)行相似度檢查。（一）送樣程序已上市品種的指紋圖譜，如同品種經(jīng)統(tǒng)一研究確定方 法的指紋圖譜，其研究資料與制劑由生產(chǎn)廠家送所在地的省 級藥品檢驗(yàn)所復(fù)核，再轉(zhuǎn)報(bào)國家藥典會。如生產(chǎn)廠家自己研究的指紋圖譜，其研究資料及藥材與制劑送所在地省級藥品 檢驗(yàn)所復(fù)核，再由國家藥典會委托另一藥