實驗六 微生物的大小測定和顯微直接計數(shù)

1、微生物大小測定和顯微直接計數(shù)微生物大小測定和顯微直接計數(shù)1l學會測微尺和血球計數(shù)板的使用方法。學會測微尺和血球計數(shù)板的使用方法。l建立微生物大小的概念。建立微生物大小的概念。21.微生物大小的測定原理微生物大小的測定原理 微生物的大小需要用刻有一定刻度的測微尺來測微生物的大小需要用刻有一定刻度的測微尺來測量，先用絕對長度的鏡臺測微尺來校正不表示絕量，先用絕對長度的鏡臺測微尺來校正不表示絕對長度的目鏡測微尺，計算后者每格所代表的實對長度的目鏡測微尺，計算后者每格所代表的實際長度，然后放上待測的標本，用目鏡測微尺測際長度，然后放上待測的標本，用目鏡測微尺測定標本上微生物細胞占目鏡測微尺的格數(shù)，就可

2、定標本上微生物細胞占目鏡測微尺的格數(shù)，就可計算該微生物的大小。計算該微生物的大小。3l(1)目鏡測微尺的構造目鏡測微尺的構造 目鏡測微尺是一塊圓形玻目鏡測微尺是一塊圓形玻片，其中央刻有精確的等分刻度，有等分為片，其中央刻有精確的等分刻度，有等分為50小小格和格和100小格兩種。刻度的大小是隨使用的接目小格兩種?？潭鹊拇笮∈请S使用的接目鏡和接物鏡的放大倍數(shù)而改變，用前必須用鏡臺鏡和接物鏡的放大倍數(shù)而改變，用前必須用鏡臺測微尺來標定。測微尺來標定。l(2)鏡臺測微尺的構造鏡臺測微尺的構造 鏡臺測微尺為一塊特制鏡臺測微尺為一塊特制的載玻片，其中央有一小圓圈。圓圈內刻有分度，的載玻片，其中央有一小圓圈

3、。圓圈內刻有分度，將長將長1mm的直線等分為的直線等分為100小格，每小格等于小格，每小格等于10m。45目尺目尺每格長度每格長度= 兩個重疊刻度間兩個重疊刻度間鏡尺鏡尺格數(shù)格數(shù)10兩個重疊刻度間兩個重疊刻度間目尺目尺格數(shù)格數(shù)6 2.顯微鏡直接計數(shù)原理顯微鏡直接計數(shù)原理l微生物常用的計數(shù)方法有兩種，即直接計數(shù)法和微生物常用的計數(shù)方法有兩種，即直接計數(shù)法和間接計數(shù)法。間接計數(shù)法。l前者利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，能立前者利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，能立即得到數(shù)值，但死活細胞都計數(shù)在內。即得到數(shù)值，但死活細胞都計數(shù)在內。l后者是在平板上長成菌落后再計數(shù)，反應較真實，后者是在平板上長成菌

4、落后再計數(shù)，反應較真實，但費時太長。但費時太長。l本實驗是利用血球計數(shù)板進行直接計數(shù)。本實驗是利用血球計數(shù)板進行直接計數(shù)。l計數(shù)前需對樣品做適當稀釋，按照規(guī)定方法及計計數(shù)前需對樣品做適當稀釋，按照規(guī)定方法及計算公式運算后，即可得出實際數(shù)值。算公式運算后，即可得出實際數(shù)值。 7l血球計數(shù)板是由一塊比普通載玻片厚的血球計數(shù)板是由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四條下凹的特制玻片制成的。玻片中有四條下凹的槽，構成三個平臺。中間的平臺較寬，槽，構成三個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面?zhèn)€刻有一個方格網(wǎng)。上面?zhèn)€刻有一個方格網(wǎng)。l方格

5、網(wǎng)上刻有方格網(wǎng)上刻有9個大方格，其中只有中間個大方格，其中只有中間的一個大方格為計數(shù)室，供微生物計數(shù)的一個大方格為計數(shù)室，供微生物計數(shù)用。這一大方格為邊長為用。這一大方格為邊長為1mm正方形，正方形，深度為深度為0.1mm，其體積為，其體積為0.1mm3。8916小格小格 25中格計數(shù)室中格計數(shù)室 25小格小格 16中中格計數(shù)室格計數(shù)室 計數(shù)室的兩種刻度形式計數(shù)室的兩種刻度形式10 計算公式計算公式l(1)16小格小格25中格的血球計數(shù)板計算公式：中格的血球計數(shù)板計算公式：l 細胞數(shù)細胞數(shù)ml=A525104Bl(2)25小格小格 16中格的血球計數(shù)板計算公式：中格的血球計數(shù)板計算公式：l 細

6、胞數(shù)細胞數(shù)ml=A516104Bl其中其中：lA為五個中方格的總菌數(shù)為五個中方格的總菌數(shù) lB為稀釋倍數(shù)為稀釋倍數(shù)11l菌種：釀酒酵母。菌種：釀酒酵母。l儀器或其他用具：顯微鏡；血細胞計數(shù)板，儀器或其他用具：顯微鏡；血細胞計數(shù)板，蓋玻片；鏡臺測微尺，目鏡測微尺，載玻蓋玻片；鏡臺測微尺，目鏡測微尺，載玻片；無菌毛細滴管。片；無菌毛細滴管。121.酵母菌大小的測定酵母菌大小的測定 （1 1）目鏡測微尺的校正（高倍）目鏡測微尺的校正（高倍） l把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺測微尺置于載物臺上，刻度裝入目鏡的隔板

7、上，把鏡臺測微尺置于載物臺上，刻度朝上。朝上。l先用低倍鏡觀察，對準焦距，視野中看清鏡臺測微尺的先用低倍鏡觀察，對準焦距，視野中看清鏡臺測微尺的刻度后，轉動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度刻度后，轉動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度平行，移動推動器，使兩尺重疊，再使兩尺的平行，移動推動器，使兩尺重疊，再使兩尺的“0”0”刻刻度完全重合。度完全重合。l定位后，仔細尋找兩尺第二個完全重合的刻度，計數(shù)兩定位后，仔細尋找兩尺第二個完全重合的刻度，計數(shù)兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺測微尺的格數(shù)。重合刻度之間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺測微尺的格數(shù)。13 （2）酵母菌大小的測定）酵母菌大小的測定l

8、取下鏡臺測微尺，換上酵母菌水浸制片。取下鏡臺測微尺，換上酵母菌水浸制片。l測量菌體的長度和寬度各占目鏡測微尺幾格，然后換算測量菌體的長度和寬度各占目鏡測微尺幾格，然后換算出菌體的實際長度。出菌體的實際長度。l在同一標本上測定在同一標本上測定5-10個菌體，求其平均值。個菌體，求其平均值。 2.細菌大小的測定細菌大小的測定 （1 1）目鏡測微尺的校正（油鏡）目鏡測微尺的校正（油鏡） （2）細菌大小的測定）細菌大小的測定l測定細菌三型玻片標本上的某一種細菌（球菌或桿菌測定細菌三型玻片標本上的某一種細菌（球菌或桿菌 或螺旋菌）或螺旋菌）142.酵母細胞數(shù)的直接測定酵母細胞數(shù)的直接測定（1 1）取潔凈

9、的血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋取潔凈的血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片（蓋玻片要清洗）。玻片（蓋玻片要清洗）。（2 2）將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中）將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸勿使氣泡產生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。液。（3 3）加樣后靜止加樣后靜止5min，然后將血細胞計數(shù)板置于顯微鏡，然后將血

10、細胞計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。高倍鏡進行計數(shù)。15l一般樣品稀釋度要求每小格內約有一般樣品稀釋度要求每小格內約有4-5 個菌體為宜。個菌體為宜。l每個計數(shù)室選每個計數(shù)室選5個中格個中格(可選可選4個角和中央的一個中格個角和中央的一個中格)中的菌體進中的菌體進行計數(shù)。行計數(shù)。l位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。l如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數(shù)。計數(shù)。l計數(shù)一個樣

11、品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算樣品的含計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算樣品的含菌量。菌量。（4）清洗血細胞計數(shù)板）清洗血細胞計數(shù)板l使用完畢后，將血細胞計數(shù)板在水龍頭上用水沖洗干凈，使用完畢后，將血細胞計數(shù)板在水龍頭上用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。l通過鏡檢觀察每小格內是否殘留菌體或其他沉淀物。若通過鏡檢觀察每小格內是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復清洗直到干凈為止。不干凈，則必須重復清洗直到干凈為止。16五、實驗結果五、實驗結果1 1、微生物大小測定實驗結果、微生物大小測定實驗結果（1）將目鏡測微尺校正結果填入下表：）將目鏡測微尺校正結果填入下表： 接物鏡接物鏡倍數(shù)目鏡測微尺格數(shù)鏡臺測微尺格數(shù)目鏡測微尺每格代表的長度(m)高倍鏡油 鏡接目鏡的放大倍數(shù)_（2） 微生物細胞大小的測量結果：微生物細胞大