分子克隆工具酶課件

1、第第2章章 分子克分子克 隆工具隆工具 酶酶 在基因工程的實際操作中，工具酶的使用在基因工程的實際操作中，工具酶的使用 是一項基本技術(shù)。是一項基本技術(shù)。 在體外對在體外對DNA進行分離純化、連接重組進行分離純化、連接重組 或者修飾合成等，都會涉及一系列酶促反或者修飾合成等，都會涉及一系列酶促反 應(yīng)。應(yīng)。 用于基因工程的工具酶種類繁多用于基因工程的工具酶種類繁多(表表2.1)、 根據(jù)其功能可粗略分為根據(jù)其功能可粗略分為限制酶、連接酶、限制酶、連接酶、 聚合酶和修飾酶聚合酶和修飾酶4類。類。 表表2.1 常用工具酶與基因克隆技術(shù)常用工具酶與基因克隆技術(shù) 工具酶類工具酶類主要用途主要用途 限制性核酸

2、內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶切割切割DNA分子形成片段分子形成片段 DNA連接酶連接酶DNA片段的連接重組片段的連接重組 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶切口平移法標記切口平移法標記DNA探針探針 T7 DNA聚合酶聚合酶DNA序列測定分析序列測定分析 Taq DNA聚合酶聚合酶PCR體外擴增技術(shù)體外擴增技術(shù) 多核苷酸激酶多核苷酸激酶末端標記法制備探針末端標記法制備探針 S1核酸酶核酸酶去除雙鏈去除雙鏈DNA的局部單鏈的局部單鏈 2.1 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能；限制酶的分類與命限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能；限制酶的分類與命 名；名；型限制酶的特性

3、與型限制酶的特性與DNA切割；影響限制性核酸內(nèi)切酶活切割；影響限制性核酸內(nèi)切酶活 性的因素；性的因素； 2.2 DNA連接酶連接酶 基本性質(zhì)；連接作用；影響連接反應(yīng)的因素；基本性質(zhì)；連接作用；影響連接反應(yīng)的因素； 2.3 DNA聚合酶聚合酶 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶；聚合酶；Klenow fragment；T7 DNA聚合酶；聚合酶； T4 DNA聚合酶；修飾過的聚合酶；修飾過的T7 DNA聚合酶；逆轉(zhuǎn)錄酶；聚合酶；逆轉(zhuǎn)錄酶； 2.4 核酸修飾酶核酸修飾酶 核酸酶；堿性磷酸單酯酶；核酸酶；堿性磷酸單酯酶；T4多核苷酸激酶；末端轉(zhuǎn)移酶。多核苷酸激酶；末端轉(zhuǎn)移酶。 2.5 甲基化酶甲基化酶 主

4、要教學(xué)內(nèi)容主要教學(xué)內(nèi)容 掌握限制酶和連接酶的性質(zhì)與功能；了解聚 合酶和修飾酶在基因操作中的用途。 重點與難點重點與難點 限制酶的分類；常用限制酶的性質(zhì)；影響 連接反應(yīng)的因素；聚合酶的分類與性質(zhì)。 教學(xué)目標與要求教學(xué)目標與要求 教學(xué)要求教學(xué)要求 需掌握專業(yè)詞匯需掌握專業(yè)詞匯 限制與修飾；星號活性；偏愛現(xiàn)象；Klenow 片段； Reverse transcriptase，同裂酶與同尾酶。 核酸酶核酸酶是通過切割相鄰的兩個核苷酸殘基間的是通過切割相鄰的兩個核苷酸殘基間的 磷酸二酯鍵，導(dǎo)致多核苷酸鏈共價鍵斷裂的一類磷酸二酯鍵，導(dǎo)致多核苷酸鏈共價鍵斷裂的一類 水解酶，可分為核糖核酸酶水解酶，可分為核糖

5、核酸酶( (RNaseRNase) )和脫氧核糖核和脫氧核糖核 酸酶酸酶( (DNaseDNase) )。 按其水解斷裂核酸分子的不同方式：按其水解斷裂核酸分子的不同方式： 核酸外切酶核酸外切酶( (exonuclease):exonuclease):從核酸末端從核酸末端順次水解順次水解 磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶( (endonuclease)endonuclease)：內(nèi)部磷酸二酯鍵：內(nèi)部磷酸二酯鍵 2.1 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 寄主控制的寄主控制的限制限制(restriction)(restriction)與修飾與修飾 (modification)(modif

6、ication)現(xiàn)象：現(xiàn)象： 人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著 一些功能性障礙。一些功能性障礙。噬菌體在感染某一宿主噬菌體在感染某一宿主 后，再去感染其他宿主時會受到限制。即所后，再去感染其他宿主時會受到限制。即所 謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（R/MR/M 體系）。體系）。 細菌的細菌的R/MR/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別 自身的自身的DNADNA與外來的與外來的DNADNA，并能使后者降解。，并能使后者降解。 2.1.1 限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物

7、功能 限限 制制 與與 修修 飾飾 現(xiàn)現(xiàn) 象象 圖圖 解解 Arber限制修飾酶限制修飾酶 1968年，Meselson and Yuan 從E. coli菌株 和中發(fā)現(xiàn)了型限制酶；型限制酶； 1970年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d 株中分離出Hind和Hind 限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的外源外源DNA 切成小片斷。切成小片斷。 限制（限制（Restriction） 細菌自身的細菌自身的DNA堿基被堿基被甲基化酶甲基化酶甲基化修甲基化修 飾所保護，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別飾所保護，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別 切割。切割。 Dam甲基化酶甲基化酶 GA

8、TC腺嘌呤腺嘌呤N6位置引入甲基。位置引入甲基。 Dcm甲基化酶甲基化酶 CCAGG或或CCTGG序列在第二個序列在第二個 C上上C5位置上引入甲基。位置上引入甲基。 修飾（修飾（Modification） 2.1.2 限制酶的分類與命名限制酶的分類與命名 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶本是微生物細胞中用于專門水解本是微生物細胞中用于專門水解 外源外源DNADNA的一類酶，其的一類酶，其功能功能是避免外源是避免外源DNADNA的干的干 擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防御機制擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防御機制 。由于。由于R/MR/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基

9、 因工程重要的工具酶。因工程重要的工具酶。 根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割DNADNA 的特點，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類：的特點，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類：型型 酶、酶、型酶、型酶、型酶。型酶。 三種類型限制酶的主要特性差異比較三種類型限制酶的主要特性差異比較 距識別序列下游 24-26bp處 識別序列內(nèi)或 附近特異性切 割 距識別序列1kb 處隨機性切割 切割位點切割位點 GAGCC CAGCAG旋轉(zhuǎn)對稱序列TGAN8TGCT AACN6GTGC 識別序列識別序列 ATP、Mg2+、 SAMMg2+ATP、Mg2+、SAM （S-腺苷甲硫氨酸 ）

10、 輔助因子輔助因子 異源二聚體同源二聚體異源三聚體蛋白結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu) 雙功能單功能多功能限制修飾限制修飾 型型 型型I I 型型主要特性主要特性 I型酶屬復(fù)合功能酶，兼具限制、修飾兩型酶屬復(fù)合功能酶，兼具限制、修飾兩 種功能。核酸內(nèi)切酶、甲基化酶、種功能。核酸內(nèi)切酶、甲基化酶、ATP酶和酶和 DNA解旋酶解旋酶4種活性。種活性。 顯著特點：顯著特點：識別位點與切割位點不一致。識別位點與切割位點不一致。 酶分子首先由酶分子首先由M. Meselson和和R. Yuan在在 1968年從大腸桿菌年從大腸桿菌 B株株和和 K株株分離的。分離的。 代表：代表：EcoB和和 EcoK。 I型限制性內(nèi)切酶型

11、限制性內(nèi)切酶 識別位點序列識別位點序列 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC 未甲基化修飾的特異序列。未甲基化修飾的特異序列。 需需ATP、Mg2+和和SAM(S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸)。 作用機理作用機理 在距離特異性識別位點約在距離特異性識別位點約10001500 bp處處 隨機隨機切開一條切開一條單鏈單鏈。 Recognize site cut 1-1.5kb 切割位點切割位點 有核酸內(nèi)切酶和甲基化酶作用。酶分子有核酸內(nèi)切酶和甲基化酶作用。酶分子 由兩個亞基組成。由兩個亞基組成。M亞基負責(zé)位點識別與修亞基負責(zé)位點識別與修 飾，飾，R亞基具有核酸酶活性。

12、亞基具有核酸酶活性。 在完全肯定的位點切割在完全肯定的位點切割DNA，但反應(yīng)需，但反應(yīng)需 要要ATP、 Mg2+和和SAM（S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸 ）。）。 在基因工程操作中用途不大。在基因工程操作中用途不大。 AGACC EcoP15: CAGCAG 類限制性內(nèi)切酶類限制性內(nèi)切酶 1970年，由年，由H.O. Smith和和K.W. Wilcox從從 流感嗜血菌中分離出來。流感嗜血菌中分離出來。分離的第一個酶分離的第一個酶 是是Hind 。 限制限制-修飾系統(tǒng)分別由限制酶與修飾酶兩修飾系統(tǒng)分別由限制酶與修飾酶兩 種不同酶分子組成，分子量小，能識別種不同酶分子組成，分子量小，能識別 DN

13、A的特殊序列，種類多，在基因工程中的特殊序列，種類多，在基因工程中 起重要作用。起重要作用。 型限制性內(nèi)切酶型限制性內(nèi)切酶 能識別雙鏈能識別雙鏈DNA的特殊序列，并在這個的特殊序列，并在這個 序列內(nèi)進行切割，產(chǎn)生特異的序列內(nèi)進行切割，產(chǎn)生特異的DNA片段。片段。 其種類繁多。其種類繁多。 通常所指的通常所指的DNA限制性核酸內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶。 在基因工程技術(shù)中，I型不能用，型不能用，型酶型酶 基本不用，基本不用， 型酶最有用。型酶最有用。 限制酶的命名限制酶的命名 n1973年年Smith和和Nathams提出限制酶的命名提出限制酶的命名 原則，原則，1980年年Roberts對其系統(tǒng)

14、化，如今簡對其系統(tǒng)化，如今簡 化成：化成： nH i n d ，來源菌株來源菌株 Haemophilus influenzae d 嗜血流感桿菌d株 H i n d 微生物屬名微生物屬名種名種名 株名株名(品系品系) 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn) 序數(shù)序數(shù) 識別雙鏈識別雙鏈DNADNA分子中分子中4 48 8對堿基的特定序列對堿基的特定序列 大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè) 識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu) 5 G C T G A A T T C G A G 3 3 C G A C T T A A G C T C 5 EcoR

15、I的識別序列EcoR I的切割位點 2.1.3 型限制酶的特性與型限制酶的特性與DNA切割切割 (1) 基本特性基本特性 大多為回文序列 5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5 OH P OHP EcoRI等產(chǎn)生的等產(chǎn)生的5粘性末粘性末 端端 5 G-C

16、-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5 PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3 3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5 OH P OHP PstI等產(chǎn)生的等產(chǎn)生的3粘性末端粘性末端 連接便利連接便利 不同的不同的DNA雙鏈：雙鏈： 只要粘性末端堿基互補就可以連接。只要粘性末端堿基互補就可以連接。 這比連接兩個平齊末端容易的多。這比連接兩個平齊

17、末端容易的多。 同一個同一個DNA分子內(nèi)連接：分子內(nèi)連接： 通過兩個相同的粘性末端可以連接成通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)環(huán) 形分子形分子。 粘性末端的意義粘性末端的意義 補平成平齊末端補平成平齊末端 凸出的凸出的3端端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個 多聚核苷酸的尾巴（如多聚核苷酸的尾巴（如AAA或或TTT等）造等）造 成人工粘性末端。成人工粘性末端。 5 5末端標記末端標記 凸出的凸出的5末端末端可用可用DNA多核苷酸激酶進多核苷酸激酶進 行行32P標記。標記。 粘性末端可以用粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平齊聚合酶補平成平齊 末端。末端。 5 G-C-T-C-A

18、-G-C-T-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5 Pvu 37 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 Pvu 等產(chǎn)生的平頭末端等產(chǎn)生的平頭末端 常用的限制酶及其識別序列和切割位點常用的限制酶及其識別序列和切割位點 名稱名稱識別序列識別序列 及切割位點及切割位點 名稱名稱識別序列識別序列 及切割位點及切割位點 BamH GGATCCPst CTGCAG Cla ATCGATSalGTCGAC EcoRGAATTC Sau3A GATC HindAAGCTTSfiG

19、GCCNNNN NGGCC Hind CTPyPuACSmaCCCGGG Kpn GGTACCXbaTCTAGA Not GCGGCCGCXhoCTCGAG 同裂酶（同裂酶（Isoschizomers) 識別位點的序列相同的限制性內(nèi)切酶。識別位點的序列相同的限制性內(nèi)切酶。 完全同裂酶完全同裂酶 識別位點和切點完全相同。識別位點和切點完全相同。 如如Hind 和和Hsu I。 Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 (2) 同裂酶與同尾酶同裂酶與同尾酶 Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5 Sma I 5-

20、CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 識別位點相同，但切點不同。識別位點相同，但切點不同。 如如Xma I 和和 Sma I。 不完全同裂酶不完全同裂酶 識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如如 BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等。等。 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 BamH I Bcl I 5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5 Bgl 5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5 Xho U代表嘌呤；代表嘌呤； Y代表嘧啶。代表嘧啶。 同尾酶同尾酶(Isocaudamers

21、） 5-GATC-3 3-CTAG-5 Sau 3A 同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新 位點位點一般不能一般不能再被原來的酶識別。再被原來的酶識別。 ？ 5-G 3-CCTAG GATCT-3 A-5 BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5 BamH I Bgl Sau 3A 限制酶識別序列與限制酶識別序列與DNA的來源無關(guān)，不的來源無關(guān)，不 具有種的特異性，對不同的具有種的特異性，對不同的DNA普遍適普遍適 用。用。 識別序列的長短涉及對識別序列的長短涉及對DNA分子切割的分子切割的 頻率，可從理論上推導(dǎo)酶切頻率，可從理論上推導(dǎo)酶切

22、DNA片段的片段的 大小。大小。 (3) 型限制酶的識別序列與型限制酶的識別序列與DNA的切割的切割 限制酶識別序列的相鄰序列（長度要求）限制酶識別序列的相鄰序列（長度要求） 效應(yīng)。大多數(shù)限制酶對只含識別序列的寡效應(yīng)。大多數(shù)限制酶對只含識別序列的寡 核苷酸也不具催化活性的。核苷酸也不具催化活性的。 限制酶的偏愛現(xiàn)象。限制酶對識別序列兩限制酶的偏愛現(xiàn)象。限制酶對識別序列兩 側(cè)的核苷酸的組成有關(guān)。（對不同位置的側(cè)的核苷酸的組成有關(guān)。（對不同位置的 同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率）同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率） 限制酶的限制酶的星星活性星星活性。指某些限制酶在不適。指某些限制酶在不適 的環(huán)

23、境中其識別序列發(fā)生改變（切割與識的環(huán)境中其識別序列發(fā)生改變（切割與識 別序列相似的序列）的現(xiàn)象。別序列相似的序列）的現(xiàn)象。 (1)(1) 底物底物DNADNA樣品的純度樣品的純度： 蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、 NaCl等。 加大酶的用量 （1個酶單位指在建議使用的緩沖液及溫度 下，在20l反應(yīng)液中反應(yīng)1h，使1 gDNA完 全消化所需的酶量。） 加大反應(yīng)總體積（稀釋）， 延長反應(yīng)時間 2.1.4 影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 （酶切反應(yīng)條件）（酶切反應(yīng)條件） 當當DNA樣品確定后，為完全切割此樣品確定后，為完全切割此DNA， 酶的用量視酶的催

24、化活性而定。酶的用量視酶的催化活性而定。 酶活力單位：酶活力單位：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng) 1 h ，完全水解，完全水解 1 mg 標標 準準DNA所需的酶量定所需的酶量定 為為1U。 容積活性：容積活性：1 ul酶溶液中具有的酶活力單酶溶液中具有的酶活力單 位。位。 DNA所需酶量來換算。所需酶量來換算。 酶用量酶用量 修飾體系組成部分，強烈影響酶的活性。修飾體系組成部分，強烈影響酶的活性。 大腸桿菌中的大腸桿菌中的dam甲基化酶在甲基化酶在5GATC3序列序列 中的腺嘌呤中的腺嘌呤N6位引入甲基。位引入甲基。 受其影響的酶有受其影響的酶有Bcl I、MboI等，但等，但Ba

25、mH I、 Bgl II、Sau3A I。 不受影響不受影響E.coli的的dcm甲基化酶在甲基化酶在5CCAGG3 或或5CCTGG3序列中的胞嘧啶序列中的胞嘧啶C5位上引入甲位上引入甲 基。基。 受其影響的酶有受其影響的酶有EcoR II等哺乳動物中的甲基化等哺乳動物中的甲基化 酶在酶在5CG3序列中的序列中的C5位上引入甲基。位上引入甲基。 (2) DNA樣品的甲基化程度樣品的甲基化程度 不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大 多數(shù)是37，少數(shù)要求4065。 (3) 酶切消化反應(yīng)的溫度酶切消化反應(yīng)的溫度 緩沖液組分包括：緩沖液組分包括：氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、

26、- -巰基乙醇或巰基乙醇或DTTDTT、BSABSA、Tris-HClTris-HCl等。等。 高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極 端端pHpH值等，會使一些限制酶的識別和切割序列值等，會使一些限制酶的識別和切割序列 發(fā)生低特異性，即所謂的發(fā)生低特異性，即所謂的Star activityStar activity現(xiàn)象。現(xiàn)象。 每種酶只有在最適的反應(yīng)緩沖液中才具有最強每種酶只有在最適的反應(yīng)緩沖液中才具有最強 的催化活性。的催化活性。 (4) 核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì) 大部分II 型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件 II 型限制性核酸內(nèi)

27、切酶酶解反應(yīng)的操作型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作 050 mM 低鹽酶；100 mM 中鹽酶；150 mM 高鹽酶 MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和離子強度； Tris-HCl： 維持pH； 二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定； 試劑條件試劑條件 Tris-HCl 50 mM pH 7.5DTT1 mM MgCl210 mMVolume20-100 ml NaCl 0-150 mMT t37 1-1.5 h 對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶 切，對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：可采取下列方法： 使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶

28、的用量， 同時酶解；低鹽酶先切，然后補加鹽，高鹽酶 再切；一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種 酶再切。 型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解 修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵。 DNA連接酶 OH P nick 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3 3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5 OHPnick 2.2 DNA連接酶連接酶 5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5 大腸桿菌大腸桿菌DNA連接酶連接酶 只能催化雙鏈只能催化雙鏈DNA的互補黏性末端，以的互補黏性末端，以

29、 NAD+為能量。為能量。 T4噬菌體連接酶噬菌體連接酶 黏性、平末端均可連接，以黏性、平末端均可連接，以ATP為能量。為能量。 2.2.1 基本性質(zhì)基本性質(zhì) 2.2.2 DNA連接酶的連接作用連接酶的連接作用 1）必須是兩條）必須是兩條雙鏈雙鏈DNA。 2）DNA3端有游離的端有游離的-OH， 5端有一個磷酸基團（端有一個磷酸基團（P）。）。 3）需要）需要能量能量 動物或噬菌體中：動物或噬菌體中：ATP 大腸桿菌中：大腸桿菌中： NAD+ (1)連接條件連接條件 1 U DNA連接酶的酶活性：連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下在最佳反應(yīng)條件下 15反應(yīng)反應(yīng) 1 h，完全連接，完全連接 1 m

30、g l-DNA（Hind 片段）所需的酶量。片段）所需的酶量。 試劑條件試劑條件 Tris-HCl50100 mM, pH 7.5 DTT5 mM MgCl210 mMVolume10 - 20 ml ATP0.5 - 1 mMT t 4 - 15 4 - 16 h (2)DNA連接酶反應(yīng)條件連接酶反應(yīng)條件 ATP（NAD+ +)提供激活的提供激活的AMP。 ATP與連接酶形成共價與連接酶形成共價“連接酶連接酶-AMP”復(fù)復(fù) 合物，并釋放出焦磷酸合物，并釋放出焦磷酸PPi。 AMP與連接酶的與連接酶的賴氨酸賴氨酸 -氨基氨基相連。相連。 OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ +

31、+ +H3N AMP ATP PPi (3)連接反應(yīng)過程連接反應(yīng)過程 “連接酶連接酶-AMP”復(fù)合物復(fù)合物 AMP隨后從連接酶的賴氨酸隨后從連接酶的賴氨酸 -氨基轉(zhuǎn)移到氨基轉(zhuǎn)移到 DNA一條鏈的一條鏈的5端端P上，形成上，形成“DNA-腺苷腺苷 酸酸”復(fù)合物。復(fù)合物。 -OH HO-P- AMP -OHO-P- AMP DNA-腺苷酸腺苷酸” 復(fù)合物復(fù)合物 3-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二 脂鍵，釋放出脂鍵，釋放出AMP。 連接多個平頭雙鏈DNA分子： 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

32、 5 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA連接酶 T4 DNA連接酶連接酶 1020倍。增加插入片段與載體的接觸 機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。 (1)插入片段與載體的濃度比例插入片段與載體的濃度比例 (2)反應(yīng)溫度反應(yīng)溫度 12.5，一般一般1416。 3.酶用量酶用量 2.2.3 影響連接反應(yīng)的因素影響連接反應(yīng)的因素 2.3 DNA聚合酶聚合酶 常常 用用 的的 聚聚 合合 酶酶 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 Klenow fragment T7 DNA聚合酶聚合酶 T4 DN

33、A聚合酶聚合酶 修飾過的修飾過的T7 DNA聚合酶聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 催化以DNA為模板合成DNA的一類酶。 DNA聚合酶聚合酶35外切外切 酶活性酶活性 53外外 切酶活性切酶活性 聚合速聚合速 率率 持續(xù)能持續(xù)能 力力 大腸桿菌DNA聚 合酶 低有中低 Klenow fragment低無中低 T4DNA聚合酶高無中低 T7DNA聚合酶高無快高 化學(xué)修飾T7DNA 聚合酶 無無快高 逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中 Taq DNA聚合酶無有快高 常用常用DNA聚合酶的特性比較聚合酶的特性比較 共同特點共同特點 把把dNTPs連續(xù)地加到引物的連續(xù)地加到引物的3-OH端。端。 主要區(qū)別主要區(qū)別 持續(xù)合成能

34、力和外切酶活性不同。持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。 T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不而不 從模板上掉下來。從模板上掉下來。 其它幾種聚合酶只能連續(xù)添加其它幾種聚合酶只能連續(xù)添加10多個多個dNTPs就就 會從模板上解離下來。會從模板上解離下來。 常用的常用的DNA聚合酶的特點聚合酶的特點 基本性質(zhì)：基本性質(zhì)：53的的DNA聚合酶活性聚合酶活性 53的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 35的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5 5 C-G-A-G-T-OH 5ppp dNTP Mg2+ 3 G-C-T-

35、C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5 5 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH DNA pol 2.3.1 E. coli DNA聚合酶聚合酶 (DNA pol) 缺口前移標記法缺口前移標記法 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 Nick translation

36、 制備制備32P標標 記的探針記的探針 DNase Mg2+ 5dNTP 5ppp dA（a-32P-dATPDNA pol 基本用途基本用途 基本性質(zhì)基本性質(zhì) 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲 得得N端三分之二的大肽段，即為端三分之二的大肽段，即為Klenow酶；酶； Klenow酶仍擁有酶仍擁有53的的DNA聚合酶活性和聚合酶活性和 35的核酸外切酶活性，但失去了的核酸外切酶活性，但失去了53的核的核 酸外切酶活性。酸外切酶活性。 2.3.2 E. coli DNA聚合酶聚合酶 I 大片段大片段(Klenow) 基本用途基本用途 補平由核

37、酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5粘性末粘性末 端端 DNA片段的同位素末端標記片段的同位素末端標記 cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 雙脫氧末端終止法測定雙脫氧末端終止法測定DNA序列序列 補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5粘性末端粘性末端 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 KlenowdATP dTTP 5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 DNA片段的

38、同位素末端標記片段的同位素末端標記 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 Klenowa-32P-pppdA dTTP 5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5 3隱蔽末端的隱蔽末端的 DNA片斷片斷 Klenow fragment補平補平 根據(jù)末端的順序選擇根據(jù)末端的順序選擇 一種一種 a a-32P-dNTPs 末端標記的末端標記的DNA 限制性內(nèi)切酶切限制性內(nèi)切酶切 5-G3

39、 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH I a a-32P-dATPa a-32P-dGTP 25 1h mRNA cDNA第一鏈第一鏈 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 cDNA第二鏈第二鏈 klenow 53 3 5 5 3 引物引物 2.3.3 T4-DNA聚合酶聚合酶 基本特性基本特性 53的的DNA聚合酶活性和聚合酶活性和35的核酸的核酸 外切酶活性；外切酶活性； 在無在無dNTP時，可以從任何時，可以從任何3-OH端外切；端外切； 在只有一

40、種在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸暴露時，外切至互補核苷酸暴露 時停止；時停止； 在四種在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位。均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位。 切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3粘性末端粘性末端 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C 5 T4-DNA聚合酶 5 G-C-T-C- OH P-G-G-A-G 3 3 C-G-A-G-P HO -C-C-T-C 5 注意：注意：該酶也能降解雙鏈該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單只是其活性比單 鏈降解活性低很多。鏈降解活性

41、低很多。 基本用途基本用途 DNA片段的同位素末端標記片段的同位素末端標記 5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3 3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5G-C-T-C A-G-C-T-G-OH HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 T4-DNA pol Mg2+ 5ppp dN 5ppp dA（a-32P-dATP） T4-DNA pol 5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3 3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 從從T7噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的，噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的， 由兩個亞基

42、組成：由兩個亞基組成： T7基因基因5編碼的大亞基：編碼的大亞基： 有有53聚合酶和聚合酶和35外切酶活性。外切酶活性。 大腸桿菌編碼的小亞基：大腸桿菌編碼的小亞基： 增加大亞基對模板的親和性。增加大亞基對模板的親和性。 2.3.4 T7-DNA聚合酶聚合酶 持續(xù)合成能力強持續(xù)合成能力強 一旦與模板結(jié)合就會不間斷地合成互補鏈。一旦與模板結(jié)合就會不間斷地合成互補鏈。 35外切酶活性高外切酶活性高 單鏈和雙鏈都能降解。單鏈和雙鏈都能降解。 不受不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響二級結(jié)構(gòu)的影響 其它其它DNA聚合酶受聚合酶受DNA二級結(jié)構(gòu)的阻礙。二級結(jié)構(gòu)的阻礙。 T7 DNA聚合酶的特點聚合酶的特點 進行末端

43、標記進行末端標記 以大分子量以大分子量DNA為模板的合成為模板的合成 如如M13 補平隱蔽末端補平隱蔽末端 取代合成法標記取代合成法標記3末端。末端。 與與T4 DNA聚合酶相同。聚合酶相同。 合成合成補平補平3隱蔽末端；隱蔽末端； 水解水解修平修平3突出末端。突出末端。 用途用途 T7DNA聚合酶的化學(xué)修飾聚合酶的化學(xué)修飾 去除去除35外切酶活性，使外切酶活性，使DNA聚合能力聚合能力 和聚合速率提高了和聚合速率提高了3倍。倍。 修飾后的修飾后的T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途 DNA測序雙脫氧法。測序雙脫氧法。 標記標記DNA 3隱蔽末端隱蔽末端 更有效地補平末端更有效地補平末端 修飾

44、后的T7 DNA聚合酶 基本特性：基本特性：以以RNA為模板聚合為模板聚合cDNA鏈鏈 反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+ dNTP 3AAAAAAAAAAAAAA5mRNA 5TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18 3AAAAAAAAAAAAAA5mRNA 5TTTTTTTTTTTTTT 3cDNA 2.3.5 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 雙向外切雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的雜合鏈中的RNA鏈鏈 反轉(zhuǎn)錄酶 3 RNA 5 DNA3 5 3 RNA 5 DNA3 5 反轉(zhuǎn)錄酶 5 DNA3 基本特性基本特性 2.4 修飾酶類修飾酶類 在基因克隆技術(shù)中，除了限制酶、連接酶、聚在基因克隆技術(shù)中，除了限

45、制酶、連接酶、聚 合酶這些主要的工具酶外，還經(jīng)常使用某些酶合酶這些主要的工具酶外，還經(jīng)常使用某些酶 的相關(guān)功能對的相關(guān)功能對DNA或或RNA進行分子修飾，以使進行分子修飾，以使 操作更加巧妙、簡便和高效。操作更加巧妙、簡便和高效。 單鏈核酸外切酶：單鏈核酸外切酶：核酸外切酶核酸外切酶VII（ExoVII） 大腸桿菌的核酸外切酶大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要不需要Mg2+ ExoVII 3 53 5 3 53 5 2.4.1 核酸酶核酸酶 ExoV 3 53 5 Mg2+ 3 53 5 大腸桿菌的核酸外切酶大腸桿菌的核酸外切酶 III 特異性地從特異性地從3端外切端外切 雙鏈核酸外切酶：雙鏈核

46、酸外切酶：核酸外切酶核酸外切酶 （Exo） lExoMg2+ 核酸外切酶特異性地從核酸外切酶特異性地從5端外切端外切 3 53 5 雙鏈核酸外切酶：雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶核酸外切酶(Exo) 3 53 5 S1核酸酶的基本特性核酸酶的基本特性 單鏈核酸內(nèi)切酶：單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶核酸酶 來自稻谷曲霉菌（來自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae） 降解單鏈降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈的速度比降解雙鏈DNA快快75000倍倍 Zn2+必需必需 最適最適pH范圍為范圍為4.04.3 需要需要NaCl濃度濃度10300 mM 降解單鏈降解單鏈DNA的速度比降解單鏈的速度比降解單

47、鏈RNA快快7倍倍 內(nèi)切單鏈內(nèi)切單鏈DNA或或RNA 5 G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3 S1Zn2+ 5 G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T 3 5 G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T 3 5dNMPs 或 5NMPs 基本反應(yīng)基本反應(yīng) 內(nèi)切帶切口或缺口的雙鏈內(nèi)切帶切口或缺口的雙鏈DNA或或RNA 5 G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3 3

48、 C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A 5 nick gap S1 Zn2+ 5 G-C-T-C-A-G 3 C-G-A-G-T-C T-G-G-A-G-T 3 A-C-C-T-C-A 5 基本反應(yīng)基本反應(yīng) 在DNA上定位RNA（S1 mapping） DNA mRNA 雜交 S1 EcoRI 重要用途重要用途 基本特性：基本特性：來自艾氏交替單胞菌（來自艾氏交替單胞菌（A.espejiana） Ca2+ 5dNMPs 或 5NMPs ssDNA or RNA Ca2+ Ca2+ 單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶核酸酶 誘發(fā)誘發(fā)DNA突變突變 Ec

49、oRI A B C EcoRI EcoRI BCA Bal31 BCA 環(huán)化環(huán)化 A C Bal31核酸酶的基本用途核酸酶的基本用途 來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP） 來自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（來自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP） 5p OH 3 DNA or RNA 5ppp dN 5pppN BAP / CIP OH 35 HO 5HO dN 5HO N 2.4.2 堿性磷酸單酯酶堿性磷酸單酯酶 功能：催化核酸脫功能：催化核酸脫5-磷酸基團，使磷酸基團，使DNA或或RNA片片 段段5-P末端轉(zhuǎn)換成末端轉(zhuǎn)換成5-OH末端。末端。 5p 3HO OH 3 p 5 堿性磷酸酶 5OH 3HO O