復雜染色體重排采用改良高分辨G顯帶技術分析的效果

1、復雜染色體重排采用改良高分辨G顯帶技術分析的效果關鍵詞：高分辨; G顯帶; 復雜染色體重排; 染色體;Abstract：Objective To investigate the cytogenetic analysis of 4 patients with complex chromosomal rearrangements (CCRs) by using chromosome modified high resolution G banding technique, and explore the clinical value of this technique in CCRs. Metho

2、ds The karyotype of peripheral blood chromosomes was prepared from 4 couples referring for recurrent abortion or infertility in the Medical Genetic Center of Guangdong Women and Children Hospital. The karyotype of peripheral blood was prepared by improved high resolution G banding technique and comp

3、ared with conventional methods. Results The resolution of the modified high resolution G banding chromosomes was over 50%, and the karyotype analysis showed that one of each couple was CCRs carriers, which involved 3 or 4 chromosome translocations. The most involving chromosomes were 3 and 12. Concl

4、usion Improved high resolution G banding technique can better detect multiple chromosome translocations and avoid missed diagnosis in CCRs carriers. The technology is simple in operation and low cost, and is suitable for promotion in grassroots units.Keyword：High resolution; G banding; Complex chrom

5、osomal rearrangement; Chromosome;復雜染色體重排 (complex chromosomal rearrangements, CCRs) 是一種染色體結構性異常, 通常涉及兩條或更多的染色體, 且至少有3個或以上斷裂點, 染色體重新排列組合并伴隨遺傳物質的交換1。CCRs攜帶者臨床表現(xiàn)多樣, 包括完全正常的表型、復發(fā)性流產、不孕不育、智力低下、發(fā)育遲緩、先天畸形等2。CCRs在表型正常的人群中少見, 但在復發(fā)性流產、不孕不育、不良生育史等患者中相對較多。CCRs的發(fā)生機制復雜, 攜帶者或是新發(fā), 或是家族性遺傳3,4。由于CCRs涉及重排的染色體和斷點的數(shù)量增加,

6、 配子發(fā)生不平衡的百分比和子代受影響的風險越高1,5。攜帶者生育先天性多發(fā)畸形 (multiple congenital abnormalities, MCA) 患兒風險與涉及的染色體、受累數(shù)目和斷裂點位置等有關5。所以對表型正常的CCRs攜帶者做出準確核型診斷, 對孕前咨詢和胎兒染色體異常的風險評估非常重要。常規(guī)染色體G顯帶在分辨率低的情況下, 辨別CCRs存在困難, 容易漏診。因此對該類患者進行針對性的細胞遺傳學診斷顯得非常關鍵。目前大多基層實驗室開展染色體檢測的分辨率在320條帶左右, 對CCRs難以識別。本研究應用改良的高分辨G顯帶技術, 對4例CCRs攜帶者進行細胞遺傳學分析并探討該

7、技術對CCRs的臨床應用價值。1、 對象與方法1.1、 研究對象選取因復發(fā)性流產或不孕不育就診于廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心的夫婦4對共8人, 簽署知情同意書后抽取外周血行改良高分辨G顯帶染色體分析。病例1, 30歲女性婚后2次早期胚胎停育。病例2, 28歲女性, 早期自然流產3次。病例3, 33歲男性婚后多年不育, 精液常規(guī)檢測正常。病例4, 39歲男性, 畸、弱精子癥, 其妻早期自然流產1次。4對夫妻均否認近親結婚, 除上述外其他既往病史無特殊。1.2、 方法抽取2 m L靜脈肝素抗凝血, 接種于2瓶外周血培養(yǎng)基, 置于37培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。在終止培養(yǎng)前16 h加入胸腺嘧啶核苷100&m

8、u;L (終濃度達到0.3 mg/m L) , 前6 h加入脫氧胞苷 (終濃度達到3μg/m L) 。收獲前加入50μL高濃度 (100 mg/m L) 的秋水仙素 (終濃度為2μg/m L) 作用12 min, 經常規(guī)低滲、預固定、固定、制片 (4張/人) 、吉姆薩染色, 全自動染色體掃描儀選取、拍攝核型, 按人類細胞遺傳學國際命名體制ISCN (2016) 分析和診斷染色體核型6。常規(guī)技術與改良高分辨G顯帶技術的方法比較見表1。表1 常規(guī)技術與改良高分辨G顯帶技術的方法比較2、 結果2.1、 制備結果所有對象進行改良高分辨G顯帶技術均獲得成功, 每例均可至少制片4張, 每

9、張玻片至少80個核型, 分辨率在550條帶核型數(shù)占50%以上。分析4對夫婦外周染色體G顯帶核型結果如下:病例1核型為:46, XX, t (3;12;18) (18qter→18q21.1:3p25→3qter;12pter→12q22:3p25→3pter;18pter→18q21.1:12q22→12qter) , 其丈夫核型正常, 見圖1。圖1 病例1改良高分辨染色體核型Fig.1 Modified high resolution chromosome karyotype of case 1病例2核型為:45, XX, t (3

10、;12) (3pter→3q21:12q24.1→12qter;12pter→12q24.1:3q21→3qter) , der (13;14) (q10;q10) , 其丈夫核型正常, 見圖2。圖2 病例2改良高分辨染色體核型Fig.2 Modified high resolution chromosome karyotype of case 2病例3核型為:46, XY, der (1) (1pter→1q43:3q25→3q26.2:12q24.1→12qter) , der (3) (pter→q25:q2

11、6.2→qter) , der (12) (12pter→12q24.1:1q43→1qter) , 其妻子核型正常, 見圖3。圖3 病例3改良高分辨染色體核型Fig.3 Modified high resolution chromosome karyotype of case 3病例4核型為:46, XY, der (5) (6qter→6q23:5p15.1→5qter) , der (6) (6pter→6q22:7p21→7pter) , der (7) (5pter→5p15.1:6q23→6q

12、22:7p21→7qter) , 其妻子核型正常, 見圖4。2.2、 4例CCRs攜帶者異常染色體特點分析結合改良高分辨G顯帶分析結果, 比較4例CCRs攜帶者細胞遺傳特點及臨床資料, 發(fā)現(xiàn)4對夫婦均存在復發(fā)性流產或不孕不育病史, 并且其中一方染色體異常, 另一方染色體正常。染色體異常一方, 存在34個染色體斷裂點, 涉及34條染色體易位, 其中以3號和12號染色體最多見, 見表2。圖4 病例4改良高分辨染色體核型Fig.4 Modified high resolution chromosome karyotype of case 4表2 四例CCRs攜帶者細胞遺傳特點及臨床資料3、

13、討論常規(guī)染色體制備方法于細胞培養(yǎng)6872 h, 在收獲前直接加低濃度秋水仙素作用2 h后直接低滲固定, 制備的染色體條帶分辨率約為320條, 對核型分析技術相對較低。由于操作簡單, 為廣大細胞遺傳實驗室應用。但該分辨率對染色體微小結構異常、復雜重排容易漏診, 導致CCRs涉及的染色體數(shù)目和斷點容易發(fā)生錯誤。而高分辨技術始于1976年Yunis7的細胞周期同步化方法, 后經許多學者改良成經典的高分辨技術, 但操作步驟繁瑣, 收獲的染色體分辨率太高, 在850條以上, 對核型分析技術要求非常高, 因此并不適合常規(guī)開展。本研究在常規(guī)技術基礎上改良高分辨技術, 操作上僅通過適時加入胸腺嘧啶核苷和脫氧胞

14、苷, 并調整秋水仙素濃度和作用時間, 即可達到臨床診斷CCRs的目的。實驗中過量的胸腺嘧啶核苷能可逆的抑制DNA合成, 使大量細胞靜止在G1/S期, 再加入脫氧胞苷使細胞同步化進入分裂中期, 從而收獲大量足夠染色體分裂相。秋水仙素能破壞細胞分裂周期中出現(xiàn)的紡錘體, 使細胞終止在分裂中期, 同時能收縮染色體。如秋水仙素作用時間太長, 可造成染色體過短。本研究在常規(guī)技術上, 采用增加秋水仙濃度并縮短作用時間的方法, 即獲得大量長度適中的染色體分裂相;在參考胸腺嘧啶核苷雙阻斷同步化高分辨技術的基礎上, 改良為單阻斷且不需離心去除阻斷劑直接釋放進入細胞中期, 簡便實驗操作, 且收獲到的染色體分裂相達5

15、50條帶占50%以上, 而又不至于過高的分辨率, 可滿足臨床上檢測CCRs的要求。CCRs通常涉及2條以上的染色體斷裂, 導致染色體片段交換8, 迄今報告病例約為300多例5,8,9,10。3條或者以上的染色體復雜重排, 理論上在減數(shù)分裂中至少會形成32種配子, 其中只有1種平衡易位配子, 1種正常配子, 其他均為部分單體或部分三體等非平衡型配子, 此類配子受精后不能正常發(fā)育, 結局多為自然流產11。CCRs的發(fā)生機制尚未完全闡明。染色體在各種內外因素的作用下受到破壞, 導致DNA雙鏈斷裂, 斷裂的染色體在DNA修復功能的作用下發(fā)生非同源末端連接, 從而形成了染色體的重排, 如果涉及到3條或以

16、上的染色體, 則形成了CCRs12。約70%的CCRs攜帶者表型正常, 20%25%有先天畸形和精神障礙, 5%10%在介入性產前診斷中被檢測到13。70%75%的CCRs為新發(fā), 30%為家族性遺傳, 新發(fā)的CCRs攜帶者中表型正常和異常的比例大致相同14。Kausch等15根據CCRs的結構, 將其分為三型:型為三相重排CCRs, 即3條染色體上的3個片段發(fā)生斷裂、易位、重組, 形成3條衍生染色體, 一般斷裂點為3個;型為特殊CCRs, 包括一系列的復雜重組 (易位、倒位、插入、復制、缺失) , 涉及的斷裂點一般比衍生染色體的數(shù)目多, 在減數(shù)分裂時增加額外的復雜性;型為雙重相互易位CCRs

17、, 包括2對或以上的染色體之間的相互易位, 通過減數(shù)分裂單獨分離, 產生正常和衍生染色體。型CCRs最常見, 約占30%16, 且隨著斷裂位點和涉及染色體數(shù)目的增加, CCRs攜帶者生育異常后代的幾率越大17。本研究中病例1屬于型, 涉及3條染色體3個斷裂點, 患者有復發(fā)性流產史, 其兩次胚胎停育可能是減數(shù)分裂后產生不平衡配子, 導致胚胎染色體異常引起流產。病例2屬于型, 涉及4條染色體4個斷裂點, 為羅氏易位合并平衡易位, 患者生育正常染色體后代的理論概率為 (1/6×1/18) 。病例3為型, 涉及3條染色體4個斷裂點, 患者不孕很可能是正常配子幾率太低。病例4屬于型, 涉及3

18、條染色體4個斷裂點, 患者畸、弱精子癥, 據報道常染色體結構畸變可影響精子的形成和質量18, 其妻流產過一次且之后一直未再孕, 可能與此有關。Vermeulen等19報道約30%的CCRs有7q21.1斷裂點, Zhang等20報道2、3、4、7、11等染色體容易形成CCRs, 本研究中4個病例中有3例含有3號和12號染色體的CCRs, 占75%, 推測12號染色體也許含有CCRs熱點區(qū)域。隨著分子遺傳技術飛速發(fā)展, 熒光原位雜交、染色體微陣列分析、二代測序 (next-generation sequencing, NGS) 等促進了染色體斷裂點的特征描述和精確劃分5, 可發(fā)現(xiàn)更多的染色體微小

19、易位, 促進遺傳物質重排的診斷21。目前NGS對CCRs的詳細研究已證明是有成效的22, 因此對CCRs的研究也成為熱點。同時也明確提出傳統(tǒng)的細胞遺傳核型分析仍是不可缺少的技術9,23, 從而對傳統(tǒng)細胞遺傳的高分辨技術提出了更高的質量要求。本研究改良高分辨G顯帶技術成本低、方便操作、容易掌握, 尤其適合基層單位開展, 及時發(fā)現(xiàn)CCRs攜帶者, 避免過度檢查和治療。參考文獻1Madan K.Balanced complex chromosome rearrangements:reproductive aspects.A reviewJ.Am J Med Genet A, 2012, 158A (

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