第五章分子發(fā)光分析法講義

1、第五章第五章 分子發(fā)光分析法分子發(fā)光分析法（molecular luminescence analysis)5-1 概述5-2 熒光分析法5-3 磷光分析法5-4 化學(xué)發(fā)光分析法化學(xué)與制藥工程學(xué)院 儀器分析分析 instrumental analysis 基態(tài)分子吸收了一定能量后，躍遷至激發(fā)態(tài)。當(dāng)激發(fā)態(tài)分子以輻射躍遷形式將其能量釋放返回基態(tài)時(shí)，便產(chǎn)生分子發(fā)光。 化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光chemiluminescence場致發(fā)光場致發(fā)光熱致發(fā)光光致發(fā)光光致發(fā)光photoluminescent 磷光磷光phosphorescence 熒光熒光fluorescence5-1 熒光分析法 分子熒光分析法是根據(jù)

2、物質(zhì)的分子熒光光譜進(jìn)行定性，以熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量的一種分析方法。一、基本原理： （一）、分子熒光（磷光）的產(chǎn)生： 室溫下，大多數(shù)分子處在基態(tài)的最低振動能層。處于基態(tài)的分子吸收能量（電能、熱能、化學(xué)能或光能）后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)。若返回到基態(tài)時(shí)伴隨著光子的輻射，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光”。單重態(tài)，單重態(tài)，激發(fā)單重態(tài)，三重態(tài)：激發(fā)單重態(tài)，三重態(tài)： 去活化過程：去活化過程：處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，它可能通過輻射躍遷和非輻射躍遷等去活化過程返回基態(tài)。 由較高能態(tài)到較低能態(tài)的過程由較高能態(tài)到較低能態(tài)的過程( ) ( ) 其中，以速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢。其中，以速度最

3、快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢。 e* e0化學(xué)反應(yīng)非輻射躍遷發(fā)射光子去活化過程內(nèi)轉(zhuǎn)換ic外轉(zhuǎn)換振動馳豫 vr體系間竄躍isc熒光f熒光（單重單重，停10-9- 10-6s ）磷光p磷光（三重單重，停10-4-10s）去活化過程去活化過程： 、振動馳豫（、振動馳豫（vr） 在同一能級同一能級中，分子由較高振動能級向該電子態(tài)的最低振動能級的非輻射躍遷。其速率極大，10-1410-12s內(nèi)即可完成。 、內(nèi)轉(zhuǎn)換（、內(nèi)轉(zhuǎn)換（ic） 指相同多重態(tài)相同多重態(tài)的兩個(gè)電子態(tài)之間（s2 s1，s1 s0）的非輻射躍遷。當(dāng)兩個(gè)電子能級非常靠近以至其振動能級有重疊時(shí)，常發(fā)生電子由高能級以無輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級。

4、如圖中s2的較低振動層與s1的較高振動層相重疊，分子無論在哪一個(gè)激發(fā)單重態(tài)，都能通過振動馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)化躍回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。 1 2 312v=03s0v=01s221v=0s12ic2vriscfp1v=0t1vriciscfp（3）、體系間竄躍（isc） 指不同多重態(tài)的兩個(gè)電子之間的非輻射躍遷。 它涉及受激發(fā)電子自旋狀態(tài)的改變，如s1 t1，使原來兩個(gè)自旋配對的電子不再配對，這種躍遷是禁阻躍遷。 含有重原子（碘、溴等）的分子中，體系間跨越躍遷最為常見。 在溶液中存在如氧分子等順磁性物質(zhì)也能增加體系間跨越的發(fā)生，因而使熒光減弱。 4）、熒光發(fā)射（fluorescence） 當(dāng)分子

5、處于單重激發(fā)態(tài)的最低振動能級時(shí)，去活化過程的一種形式是以10-910-6s左右的短時(shí)間發(fā)射一個(gè)光子返回基態(tài)。這一過程稱為熒光發(fā)射。 （單重（單重單重，停單重，停10-910-6s ） 發(fā)射熒光的能量比分子所吸收的能量要小發(fā)射熒光的能量比分子所吸收的能量要小，即熒熒光的特征波長光的特征波長比它所吸收的特征波長所吸收的特征波長要長。 注意：注意：基態(tài)中也有振動馳豫躍遷。31或2 ，不論電子開始被激發(fā)至什么高能級，最終將只發(fā)射出波長為3的熒光。 （5）、磷光發(fā)射（phosphorescence） 從單重態(tài)到三重態(tài)的分子體系間竄躍發(fā)生后，接著發(fā)生快速的振動馳豫而到達(dá)三重態(tài)的最低能層上，此時(shí)可能由兩種途

6、徑返回基態(tài)： 體系間竄躍 在10-410s左右時(shí)間內(nèi)輻射躍遷回基態(tài)而發(fā)生磷光.這種躍遷所發(fā)射的光，在光照停止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間。 （三重三重單重，停單重，停10-4-10s，液氮冷凍試樣，才可見磷光），液氮冷凍試樣，才可見磷光） 熒光和磷光的根本區(qū)別熒光和磷光的根本區(qū)別: : 熒光是由單重?zé)晒馐怯蓡沃? -單重躍遷引起的，單重躍遷引起的， 磷光則由三重磷光則由三重- -單重躍遷產(chǎn)生的。單重躍遷產(chǎn)生的。 觀察磷光現(xiàn)象時(shí)，試樣要用液氮冷凍觀察磷光現(xiàn)象時(shí)，試樣要用液氮冷凍 a.三重態(tài)與基態(tài)之間的能量差要比最低激發(fā)態(tài)和基態(tài)之間的能量差小，這使三重態(tài)與基態(tài)之間的振動偶合增強(qiáng)，因而增強(qiáng)了內(nèi)部轉(zhuǎn)換； b.

7、激發(fā)三重態(tài)的壽命比激發(fā)單重態(tài)的壽命長，因而同溶劑分子碰撞而失去激發(fā)能的可能性增大，以致在室溫條件下不能觀察到溶液的磷光。 因此，觀察磷光現(xiàn)象時(shí)，試樣要用液氮冷凍以使碰撞去活化和振動偶合去活化降至最低限度 1 2 312v=03s0v=01s221v=0s12ic2vriscfp1v=0t1vriciscfp（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 1、激發(fā)光譜：熒光和磷光都是光致發(fā)光，因此必須選擇合適的激發(fā)光波長，這可從他們的激發(fā)光譜曲線來確定 以熒光（磷光）的最大發(fā)射波長為測量波長，改變激發(fā)光的波長，測量熒光強(qiáng)度的變化，以激發(fā)光波長為橫座標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱座標(biāo)作圖，即可得到激發(fā)光譜。相對強(qiáng)度萘的激發(fā)光譜

8、 熒光光譜 磷光光譜相對強(qiáng)度200 300 400 500相對強(qiáng)度 熒光或磷光光譜曲線熒光或磷光光譜曲線: : 固定激發(fā)光波長為其最大激發(fā)波長，然后測定不同的波長時(shí)所發(fā)射的熒光或磷光強(qiáng)度，將熒光的光波長為橫座標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱座標(biāo)作圖便可得到熒光光譜（發(fā)射光譜）。激熒磷激熒磷eee2、激發(fā)光譜和熒光光譜的特點(diǎn)：（1 1）熒光光譜的形狀與激發(fā)光波長無關(guān)）熒光光譜的形狀與激發(fā)光波長無關(guān) 熒光物質(zhì)吸收不同波長的激發(fā)光可被激發(fā)到不同能態(tài)，通過振動馳豫和內(nèi)部轉(zhuǎn)換最終都將達(dá)到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級，然后再發(fā)射熒光。故蒽的激發(fā)光譜雖在250nm和350nm有兩個(gè)峰，不論用哪一個(gè)峰的波長作激發(fā)光源，所得熒

9、光光譜的形狀和峰的位置都是相同的。（2） 熒光光譜和激發(fā)光譜成鏡像關(guān)系熒光光譜和激發(fā)光譜成鏡像關(guān)系 從圖可看出激發(fā)光譜同熒光光譜大致成鏡像對稱 a. 熒光光譜(發(fā)射光譜）形狀與基態(tài)s0振動能級的分布情況（即能量間隔情況）有關(guān) b. 激發(fā)光譜(吸收譜)形狀與激發(fā)態(tài)s1振動能級的分布有關(guān)c. s0、s1態(tài)中振動能級的分布是相似的(說明峰形狀相 似）d. 根據(jù)frankcondon原理，電子躍遷過程中核的相對位置不變（近似的），若吸收光譜中某一振動帶的躍遷幾率最大，則在熒光發(fā)射光譜中，其相反躍遷的幾率也應(yīng)最大(說明高峰對高峰，低峰對低峰） 非鏡像對稱的峰出現(xiàn)，則表示有散射光或雜質(zhì)存在。（3）熒光光譜

10、波長）熒光光譜波長em大于激發(fā)光譜波長大于激發(fā)光譜波長ex 斯托克斯（stokes）于1852年首次觀察到熒光光譜波長em大于激發(fā)光譜波長ex這一現(xiàn)象（稱斯托克斯稱斯托克斯位移位移）。它說明激發(fā)與發(fā)射間有一定能量損失。產(chǎn)生的主要原因是激發(fā)態(tài)分子發(fā)射前后都存在振動弛豫現(xiàn)象。例例: : 區(qū)別譜圖中的區(qū)別譜圖中的三個(gè)峰，說明判斷三個(gè)峰，說明判斷原則原則。（三）、熒光效率及其影響因素： 1、分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件： 、分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，才能吸收激發(fā)光； 、吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率（熒光效率）激發(fā)態(tài)分子總數(shù)發(fā)熒光的分子數(shù)f、熒光效率

11、熒光效率越高，輻射躍遷概率就越大，物質(zhì)發(fā) 射的熒光也就越強(qiáng)。、熒光效率也可用各種躍遷的速率常數(shù)來表示 ifffkkk kf：表示熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，主要取決于物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)； ：表示非輻射躍遷的速率常數(shù)之和，主要取決于化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。ik2、熒光效率3、熒光效率的影響因素： 、分子結(jié)構(gòu)：、分子結(jié)構(gòu)： a、躍遷類型、躍遷類型： 實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)熒光化合物都是由*或n *躍遷激發(fā)，然后經(jīng)過vr或其它無輻射躍遷，再發(fā)生* 或* n躍遷而產(chǎn)生熒光。其中 *躍遷的熒光效率較高。 原因原因：的較大（比n大100-1000倍），其次，壽命約10-710-9s(比n壽命10-510-7s短

12、)，此外，在過程中，體系間竄躍至三重態(tài)的速率常數(shù)也較小，這都有利于熒光的發(fā)射。b、共軛效應(yīng)、共軛效應(yīng)：含有*躍遷能級的芳香族化合物的熒光最強(qiáng)；這種體系中的電子共軛度越大，則電子的離域性越強(qiáng)，越易被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，而且熒光光譜將向長波移動。所以絕大多數(shù)能發(fā)生熒光的物質(zhì)含有芳香環(huán)或雜環(huán)。 對苯基化、間苯基化和乙烯化作用都將增加苯的熒光強(qiáng)度，并使熒光光譜紅移。c c、剛性平面結(jié)構(gòu)、剛性平面結(jié)構(gòu)：此結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減小，也就減少了碰撞去活的可能性，有利于熒光的產(chǎn)生。 例例1：熒光素有很強(qiáng)熒光，但酚酞無，是由于 熒光素的剛性可減少分子振動例例2：芴和聯(lián)苯在同樣

13、條件下的熒光效率約為1.0和0.2。 芴上的亞甲基增強(qiáng)了分子的剛性。此外，當(dāng)熒光染料吸附在固體表面上時(shí)，常使熒光發(fā)射增強(qiáng)，這可用固體表面誘導(dǎo)了分子結(jié)構(gòu)的附加剛性來說明。例例3：剛性的影響可說明螯合劑同：剛性的影響可說明螯合劑同m螯合時(shí)熒光增強(qiáng)的螯合時(shí)熒光增強(qiáng)的現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 滂鉻蘭黑滂鉻蘭黑r r（bbrbbr）無熒光，它與鋁形成螯合）無熒光，它與鋁形成螯合物有熒光。物有熒光。 d、取代基效應(yīng)： 給電子取代基使共軛體系增大，使熒光增強(qiáng)，如 oh，nh2，nr2，or，cn。 吸電子取代基使熒光減弱甚至?xí)鐭晒猓?cooh，no，no2，c=o，鹵素離子等。 同電子體系相互作用小的取代基（so

14、3h， nh3+和烷基），對分子發(fā)光影響小。 重原子效應(yīng)重原子效應(yīng)：將一高原子序數(shù)的原子引入到電 子體系中去，往往會使物質(zhì)的熒光減弱，而磷光增強(qiáng)。重原子效應(yīng)重原子效應(yīng)： 若使用含重原子的溶劑，也會發(fā)生外部重原子效應(yīng)，導(dǎo)致磷光增強(qiáng)和熒光減弱。 如 鹵素取代基 熒光的相對強(qiáng)度 氟代苯 10 氯代苯 7 溴代苯 5 碘代苯 0 原因：因?yàn)樵谠有驍?shù)高的原子中，電子自旋和軌道運(yùn)動間的相互作用變大，更有利于電子自旋的改變，增大了體系間竄躍，而使熒光減弱，磷光增強(qiáng)。、環(huán)境因素：、環(huán)境因素：a、溶劑的極性、溶劑的極性：極性增加，對激發(fā)態(tài)會產(chǎn)生更大的 穩(wěn)定作用，結(jié)果使物質(zhì)的熒光波長紅移，熒光強(qiáng) 度增大。b、溫

15、度、溫度：輻射躍遷的速率基本不隨溫度而變； 非輻射躍遷的速率隨溫度升高而顯著地增大； 因此，升高溫度會使非輻射躍遷概率增大，熒光效 率降低。 c、ph值值：影響酸性、堿性取代基團(tuán)的存在型體，應(yīng) 嚴(yán)格控制ph。 如苯胺在ph=712時(shí)以分子型體存在，發(fā)蘭色熒光，而ph小于2、ph大于13時(shí)以離子形式存在，不發(fā)生熒光。d、表面活性劑、表面活性劑：增大熒光效率e、順磁性物質(zhì)、順磁性物質(zhì)：減小熒光效率如o2。 （四）熒光強(qiáng)度同濃度的關(guān)系（四）熒光強(qiáng)度同濃度的關(guān)系 1、熒光強(qiáng)度if正比于吸收的光量ia與熒光量子產(chǎn)率 。 if = ia 據(jù)beer定律： ia = i0 - it = i0(1- 10 -

16、a) 代入上式得： if = i0(1- 10 -a) = i0(1- 10 - b c) 若溶液很稀(a0.05），則可近似為 if =2.3 i0 bc 對于一給定的物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長和強(qiáng)度一定時(shí)，熒光強(qiáng)度只與溶液濃度有關(guān)。 if = k c 熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比2、高濃度偏離線性關(guān)系的因素：、高濃度偏離線性關(guān)系的因素：a. 當(dāng)濃度較濃，不滿足a0.05，公式近似處理誤差大（如果a=104，b=1.0 代入abc0.05 得c=5.010-6mol/l)b. 自猝滅（self-quenching）由熒光分子間以及熒光分子同溶劑分子間的碰撞產(chǎn)生的。 c

17、 ，自猝滅。c. 自吸收（self-absorption）發(fā)生在熒光發(fā)射波長同化合物的吸收峰重迭的情況下，當(dāng)熒光通過溶液時(shí)便被吸收一部分。3、影響熒光強(qiáng)度的因素： 內(nèi)濾光作用和自吸收現(xiàn)象： 溶液中若存在著能吸收激發(fā)或熒光物質(zhì)所發(fā)射光能的物質(zhì)，就會使熒光減弱。 熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜的短波長一端與該物質(zhì)的吸收光譜的長波長一端有重疊，在溶液濃度較大時(shí)，一部分熒光發(fā)射被自身吸收，產(chǎn)生“自吸收”現(xiàn)象而降低了溶液的熒光強(qiáng)度。熒光猝滅（熒光熄滅）：熒光猝滅（熒光熄滅）： 廣義的說，指任何可使物質(zhì)熒光強(qiáng)度下降的作用，任何可使熒光強(qiáng)度不與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系的作用，或任何可使熒光量子產(chǎn)率降低的作用。 狹義

18、的說，指熒光分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子之間所發(fā)生的導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降的物理或化學(xué)作用過程。熒光猝滅劑：熒光猝滅劑：與熒光物質(zhì)分子發(fā)生相互作用而引起熒光強(qiáng)度下降的物質(zhì)。(1).(1).動態(tài)猝滅動態(tài)猝滅 猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間發(fā)生的相互作用過程(能量轉(zhuǎn)移過程等），可生成瞬時(shí)激發(fā)態(tài)復(fù)合物（不發(fā)射熒光，或熒光的發(fā)射特性與原先的熒光物質(zhì)不同），從而引起熒光猝滅現(xiàn)象。動態(tài)猝滅的效率受熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)分子的壽命和猝滅劑的濃度限制。 1-萘胺的熒光在堿性溶液中發(fā)生猝滅現(xiàn)象，但它的吸收光譜并無變化，這是動態(tài)猝滅的一個(gè)例子。 (2).(2).靜態(tài)猝滅靜態(tài)猝滅 猝滅劑和熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時(shí)發(fā)生配合反應(yīng)，降低了熒

19、光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。 動態(tài)猝滅中的熒光量子產(chǎn)率由光反應(yīng)動力學(xué)控制，靜態(tài)猝滅中的熒光量子產(chǎn)率只受基態(tài)的配位作用的熱力學(xué)所控制。(3).(3).猝滅劑猝滅劑 氧氧能使多數(shù)熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光猝滅現(xiàn)象。 胺類胺類是大多數(shù)未取代的芳烴的有效猝滅劑。 鹵素化合物、重金屬離子以及硝基化合物鹵素化合物、重金屬離子以及硝基化合物等，也是常見的猝滅劑。鹵素離子對奎寧有顯著的猝滅作用。但對某些物質(zhì)卻無猝滅作用。這表明猝滅劑和熒光物質(zhì)分子之間的相互作用是有一定選擇性的。(4)自猝滅：自猝滅：當(dāng)熒光物質(zhì)濃度超過1g/l時(shí)，常發(fā)生熒光的自猝滅（濃度猝滅）現(xiàn)象。 可能的原因：a. 熒光輻射的自吸收，這在熒光物質(zhì)的吸收

20、光譜和發(fā)射光譜有較大重疊時(shí)較嚴(yán)重。b. 熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子m*與基態(tài)分子m形成激發(fā)態(tài)的二聚體（m*m）。c. 基態(tài)的熒光物質(zhì)分子的締合。熒光自猝滅是與濃度有關(guān)的效應(yīng)，因而通過在熒光測定前稀釋溶液的辦法，可避免這一現(xiàn)象的發(fā)生，或減小它所產(chǎn)生的影響。二、熒光分析儀器示意圖二、熒光分析儀器示意圖激發(fā)單色器液槽發(fā)射單色器檢測器記錄儀ifi0ii光源1、與分光光度計(jì)的差別： 、熒光分析儀器采用垂直測量垂直測量方式； 、熒光分析儀器有兩個(gè)單色器，兩個(gè)單色器，一個(gè)是激發(fā)單色器，置于液槽前，用于獲得單色性較好的激發(fā)光；另一個(gè)是發(fā)射單色器，置于液槽和檢測器之間，用于分出某一波長的熒光。2、儀器各部分簡介： 光

21、源 激發(fā)單色器 液槽 發(fā)射單色器 檢測器 記錄儀 激發(fā)光源激發(fā)光源 作用：提供連續(xù)輻射，激發(fā)樣品 要求：光源（i0）強(qiáng)度足夠；強(qiáng)度與波長無關(guān) 種類： 鹵鎢燈，高壓汞燈，氙弧燈。激發(fā)單色器激發(fā)單色器- 作用：用于選擇激發(fā)光的波長樣品池樣品池 用石英制成 形狀:正方形、長方形、圓形的。低溫測定時(shí)在石英液槽外套一個(gè)盛放液氮的透明石英真空瓶。發(fā)射單色器發(fā)射單色器 用于選擇投射到檢測器的熒光波長。檢測器檢測器 熒光或磷光的強(qiáng)度較弱，要求檢測器靈敏度高。 光電管，光電倍增管光電管，光電倍增管三、熒光分析方法及應(yīng)用三、熒光分析方法及應(yīng)用 1 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法 用已知的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過和試樣同樣的處理后

22、，配成一系列標(biāo)液。測定標(biāo)液的熒光強(qiáng)度，用熒光強(qiáng)度對標(biāo)液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)試液的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出試樣中熒光物質(zhì)的含量。2.熒光分析法的靈敏度：熒光分析法的靈敏度：比吸光法高得多，更適合于低濃度物質(zhì)的分子。 這兩種方法在靈敏度方面的差別主要是由于同濃這兩種方法在靈敏度方面的差別主要是由于同濃度相關(guān)的參數(shù)的測量方式不同度相關(guān)的參數(shù)的測量方式不同。 在光度計(jì)中，同濃度相關(guān)的參數(shù)a是i0/i的對數(shù)。在測低濃度液時(shí)，檢測器必須能區(qū)分i、i0訊號的微小差別，故在低a時(shí)測量的精確度迅速降低。iia0lg 而熒光強(qiáng)度而熒光強(qiáng)度f（或磷光強(qiáng)度（或磷光強(qiáng)度p）直接同熒光（磷光）直接同熒光（磷光）物

23、質(zhì)的濃度成正比物質(zhì)的濃度成正比。同濃度相關(guān)的參數(shù)是在很小噪聲背景上的熒光（磷光）發(fā)射訊號本身，可用增強(qiáng)入射光強(qiáng)度i0或增大熒光訊號的放大倍數(shù)來提高靈敏度。而在光度法中, 若檢測器放大倍數(shù)，i0及i同時(shí)， a值不變。 故熒光法靈敏度常比相應(yīng)光度法高故熒光法靈敏度常比相應(yīng)光度法高2-4個(gè)數(shù)量級。個(gè)數(shù)量級。 3. 熒光分析法的選擇性熒光分析法的選擇性 很多分子在紫外可見區(qū)有吸收，但其中只有一部分能再發(fā)射熒光或磷光，故熒光法固有干擾很少，選擇性較好。4熒光分析法的應(yīng)用熒光分析法的應(yīng)用5 3 磷光分析法磷光分析法 一、一、 概述概述 磷光的產(chǎn)生涉及到激發(fā)單重態(tài)至激發(fā)三重態(tài)和由激發(fā)三重態(tài)經(jīng)禁阻躍遷回到基態(tài)

24、，易受其它輻射或無輻射躍遷的干擾而使磷光強(qiáng)度減弱，甚至完全消失。因此，為獲得較強(qiáng)磷光，宜采取下列措施： 1 1、增加試樣的剛性、增加試樣的剛性可減小質(zhì)點(diǎn)間的碰撞幾率，以減小無輻射躍遷。低溫磷光低溫磷光就是基于這一原理建立起來的。通常，將被分析試樣的乙醚或異戊醇溶液置于液氮中（或用二乙醚，異戊烷和乙醇按5：5：2混合稱epa混合溶劑），讓其冷凍至玻璃狀態(tài)后，即可測定磷光。 2、室溫磷光：、室溫磷光： 固體磷光法固體磷光法 在薄層色譜板上分析斑點(diǎn)磷光，可將被分析物質(zhì)直接固定在薄層色譜板上，而將任何液體溶劑除去。理想的載體應(yīng)是既能將分析物牢固地束縛在表面或基體中以增強(qiáng)磷光強(qiáng)度，本身又不產(chǎn)生背景。常用

25、的是濾紙和纖維素色層紙。 分子締合物的形成分子締合物的形成 在試液中，表面活性劑與被測物形成膠束締合物后，可增強(qiáng)其剛性，減小因碰撞而引起的能量損失。例表面活性劑十二烷基硫酸鹽和重原子存在下，可測10-610-7mol的萘、芘和聯(lián)苯，精密度達(dá)6%3、重原子效應(yīng)、重原子效應(yīng) 在含重原子的溶劑（碘乙烷和溴乙烷）中，有利于體系間跨躍，磷光增強(qiáng)。另外，還可用ag+鹽、pb2+鹽和tl+鹽等重原子鹽類。 磷光光度計(jì)由光源，激發(fā)光單色器、液槽、發(fā)射光單色器、檢測器等組成。二、二、 磷光分析儀器磷光分析儀器1 1、液槽：、液槽： 為在低溫下測磷光，液槽 （一個(gè)直徑為1mm左右的石英管）需放在充有液氮的石英制的

26、小杜瓦瓶中。常用的溶劑是按5：5：2比例混合的二乙醚，異戊烷和乙醇的混合物，稱epa混合溶劑。當(dāng)它在液氮中冷凍后成為透明的玻璃狀物質(zhì)。2、磷光鏡、磷光鏡 由于發(fā)生磷光的物質(zhì)常伴隨有熒光產(chǎn)生，為了區(qū)別磷光和熒光，在激發(fā)光單色器和液槽之間以及在液槽和發(fā)射光單色器之間各裝一個(gè)斬波片，并由一個(gè)同步電動機(jī)帶動。這兩個(gè)斬波片可調(diào)節(jié)為同相或異相。同相時(shí)，磷光和熒光一起進(jìn)入發(fā)射光單色器，測到的是磷光和熒光的總光強(qiáng)。當(dāng)斬波片調(diào)節(jié)為異相時(shí)，激發(fā)光被遮斷。此時(shí)，由于熒光的壽命短，立即消失，而磷光壽命長，測到的僅為磷光。 利用斬波片，不僅可分別測出磷光和熒光，而且可通過調(diào)節(jié)兩個(gè)斬波片的轉(zhuǎn)速，測出不同壽命的磷光。這種具

27、有時(shí)間分辨功能的裝置，是磷光光度計(jì)的一個(gè)特點(diǎn)。 美國pe公司生產(chǎn)的ls5和ls3型發(fā)光光度計(jì)可用于測定熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光。三、三、 分析方法及應(yīng)用分析方法及應(yīng)用 一般與熒光分析法相同，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。 與熒光分析法相似，磷光分析法在有機(jī)、生物、醫(yī)藥及臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域中得到了應(yīng)用。它與熒光法相互補(bǔ)充，成為痕量有機(jī)分析的重要手段。 5-4 5-4 化學(xué)發(fā)光分析法化學(xué)發(fā)光分析法一、概述： 某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，由于吸收了反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，便發(fā)出一定波長的光。這種吸收化學(xué)能使分子發(fā)光的過程稱為化學(xué)發(fā)吸收化學(xué)能使分子發(fā)光的過程稱為

28、化學(xué)發(fā)光光。利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)而建立起來的分析方法稱為化學(xué)發(fā)光分析法化學(xué)發(fā)光分析法。化學(xué)發(fā)光也發(fā)生于生命體系，這種發(fā)光稱為生物發(fā)光。二、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理二、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理 1、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件：化學(xué)發(fā)光是吸收化學(xué)反應(yīng)過程產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)所發(fā)射的光。任何一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都應(yīng)包括化學(xué)激發(fā)化學(xué)激發(fā)和發(fā)光發(fā)光兩個(gè)步驟，必須滿足如下條件： （1）化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能，激發(fā)能主要來源于反應(yīng)焓。大多數(shù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)為氧化還原反應(yīng)。 （2）要有有利的化學(xué)反應(yīng)歷程，使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)。 對于有機(jī)分子的液相化學(xué)發(fā)光來說，容易

29、生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的常是芳香族化合物和羰基化合物 （3）激發(fā)態(tài)能釋放光子或能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個(gè)分子，而使該分子激發(fā)，然后以輻射光子的形式回到基態(tài)。2、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率cl 又稱化學(xué)發(fā)光的總量子產(chǎn)率。它決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率ce和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率em。 定義為 clcl = =發(fā)射光子的分子數(shù)發(fā)射光子的分子數(shù) / / 參加反應(yīng)的分子數(shù)參加反應(yīng)的分子數(shù) = = cece emem 化學(xué)反應(yīng)的發(fā)光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由參加反應(yīng)物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)所決定。每個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都有其特征的化學(xué)發(fā)光光譜及不同的化學(xué)發(fā)光效率。 3、化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度icl 以單位時(shí)間內(nèi)發(fā)射的光子數(shù)表

30、示。它與化學(xué)發(fā)光反化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的速率有關(guān)應(yīng)的速率有關(guān)，而反應(yīng)速率又與反應(yīng)分子濃度反應(yīng)分子濃度有關(guān)。即 icl （t）= cl dc/dt 式中 icl（t）表示t時(shí)刻的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，是與分析物有關(guān)的化學(xué)發(fā)光效率；dc/dt是分析物參加反應(yīng)的速率。 發(fā)光強(qiáng)度發(fā)光強(qiáng)度icl與分析物濃度成正比與分析物濃度成正比三、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型三、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型1. 直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光 直接發(fā)光直接發(fā)光是被測物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。 a + b c* + d c* c + h 式中a或b是被測物，通過反應(yīng)生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物c* ，當(dāng)c* 躍遷回基態(tài)時(shí)，輻射光子。 間接發(fā)光間接發(fā)光是被測物a或b，通過化學(xué)反應(yīng)生成初始激發(fā)態(tài)產(chǎn)物c* ， c* 不直接發(fā)光，而是將其能量轉(zhuǎn)移給f，使f躍遷回基態(tài)，產(chǎn)生發(fā)光。 a + b c* + d c*+f f* + e f* f + h 式中c*為能量給予體，而f為能量接受體 2. 氣相化學(xué)發(fā)光和液相化學(xué)發(fā)光氣相化學(xué)發(fā)光和液相化學(xué)發(fā)光 按反應(yīng)體系的狀態(tài)分類，如化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在氣相中進(jìn)行稱為氣相化學(xué)發(fā)