實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒的提取堿法

1、 3學(xué)時(shí)1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 實(shí)驗(yàn)原理 3. 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 4. 實(shí)驗(yàn)步驟 5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膌了解堿法提取質(zhì)粒的原理；了解堿法提取質(zhì)粒的原理；l掌握堿法提取質(zhì)粒的方法。掌握堿法提取質(zhì)粒的方法。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理l質(zhì)粒是一種細(xì)菌染色體外的、具有自主質(zhì)粒是一種細(xì)菌染色體外的、具有自主復(fù)制能力的、共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)復(fù)制能力的、共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)的小型的小型dna分子。堿裂解法提取質(zhì)粒是分子。堿裂解法提取質(zhì)粒是實(shí)驗(yàn)室常用的方法。實(shí)驗(yàn)室常用的方法。l這種方法是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒這種方法是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒dna與線性染色體與線性染色體dna在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來在拓?fù)鋵W(xué)上的差異

2、來分離它們。分離它們。結(jié)構(gòu)的三大要素：結(jié)構(gòu)的三大要素： 多克隆位點(diǎn) 選擇標(biāo)記（耐藥性，lacz） 獨(dú)立的復(fù)制單位種類：種類： 質(zhì)粒 噬菌體 酵母人工染色體（yac） 反轉(zhuǎn)錄病毒載體 表達(dá)載體等pbc sk mappbc sk map在堿性條件（在堿性條件（ph 12.5）下，線性染色體）下，線性染色體dna的雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒的雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒dna的氫鍵雖的氫鍵雖然斷裂但兩條互補(bǔ)鏈彼此纏繞，緊密結(jié)合在一然斷裂但兩條互補(bǔ)鏈彼此纏繞，緊密結(jié)合在一起。當(dāng)加入乙酸鉀恢復(fù)至中性時(shí)，染色體起。當(dāng)加入乙酸鉀恢復(fù)至中性時(shí)，染色體dna分子難以復(fù)性，而質(zhì)粒分子難以復(fù)性，而質(zhì)粒dna分子很快復(fù)

3、性，離分子很快復(fù)性，離心時(shí)染色體心時(shí)染色體dna與細(xì)胞碎片一起被沉淀出來，與細(xì)胞碎片一起被沉淀出來，而質(zhì)粒而質(zhì)粒dna則留在上清液中。則留在上清液中。用異丙醇或乙醇沉淀后洗滌，可得到較純的質(zhì)用異丙醇或乙醇沉淀后洗滌，可得到較純的質(zhì)粒粒dna。實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 （一）（一） 儀器儀器 1. 恒溫?fù)u床 2. 超凈工作臺(tái) 3. 高壓滅菌鍋 4. 高速臺(tái)式離心機(jī) 5. 微量取液器 （二） 材料 l含pbc ks質(zhì)粒的大腸桿菌 dh 5。l含重組質(zhì)粒的大腸桿菌 dh 5。（三） 試劑 l1. lb液體培養(yǎng)基（1l） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g nacl 10 g 加去離子水至800ml 攪

4、拌，使溶質(zhì)完全溶解，用naoh調(diào)節(jié)ph值至7.0，加入去 離子水至總體積為1升，高壓蒸汽滅菌20 分鐘。 llb固體培養(yǎng)基（1l） 在上述lb液體培養(yǎng)基（1l）中加入瓊脂粉15g。 l2. solution 50 mmol/l 葡萄糖 25 mmol/l tris.cl (ph 8.0) 10 mmol/l edta (ph 8.0) 高壓滅菌后，4保存?zhèn)溆谩?l3. solution(現(xiàn)用現(xiàn)配制) 0.2 mol/l naoh 1% sds 4. solution （100 ml） 5mol/l kac 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液含3 mol/l鉀鹽

5、、5 mol/l醋酸 （ph 4.8）。 5. 氨芐青霉素（氨芐青霉素（amp） 用無菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20冰箱保存?zhèn)溆谩?6. 胰胰rna酶酶 l 將胰rna酶（rna 酶 a）溶于10 mmol/l tris.cl (ph 7.5)、15 mmol/l nacl中， 配成10 mg/ml的濃度，于100加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20。 7. 氯仿，乙醇氯仿，乙醇 ，70%乙醇乙醇。 質(zhì)粒的提取質(zhì)粒的提取 l1. 用滅菌的牙簽挑取單菌落放入50ml lb液體培養(yǎng)基（含amp 0.1 mg/ml ）中，37振蕩培養(yǎng)過夜。 l2. 將菌液倒入1.5 m

6、l eppendorf管中，10,000 rpm離心1min，去掉上清液，重復(fù)兩次。沉淀懸于200l solutioni 中, 渦旋使充分懸浮。 l3. 加入300l solutionii，混勻（注意動(dòng)作輕），冰箱3 放置5min。 l4. 加入300l solutioniii,混勻（注意動(dòng)作輕） ，冰箱3 放置5min。 l5. 12,000rpm，離心5min，將上清移至1個(gè)新eppendorf 管中，注意所取體積（約600 l ） 。 l6. 加入等體積氯仿（約600 l ），混勻（注意動(dòng)作輕）。12,000rpm，4，離心10min，取上清液。 l7. 上清液中加入預(yù)冷的等體積異丙醇，

7、-20沉淀 2030 min。 l8. 12,000 rpm離心15 min。l9. 去上清，沉淀加入500l 70%乙醇洗滌2次（ 12,000 rpm離心3分鐘）。 l10. 去掉上清（注意沉淀勿丟失），室溫或真空干燥沉淀。 l11. 每管中加入25l無菌水1l rnase， 37溶解質(zhì)粒dna。lbiospin 質(zhì)粒dna 小量提取試劑盒（實(shí)際用）實(shí)際用）l l操作過程操作過程l1. 將11.5ml 過夜培養(yǎng)的細(xì)菌菌液加入1.5ml 離心管中。l2. 于10，000rpm離心30 秒，并棄去上清液。l如有需要，可多次重復(fù)步驟1、2，以收集更多細(xì)菌菌體。但勿過量，以免影響提取質(zhì)粒的質(zhì)量。l

8、3. 加250l resuspension buffer，重懸細(xì)菌體沉淀。l重懸后應(yīng)該沒有細(xì)菌團(tuán)塊。l4. 加250l 細(xì)胞lysis buffer，輕柔顛倒46 次。l不要?jiǎng)×艺駝?dòng)，以防止基因組dna 被剪切。注意不要讓反應(yīng)持續(xù)超過5 分鐘。l5. 加350l neutralization buffer，立即輕柔顛倒離心管46 次。l溶液應(yīng)該出現(xiàn)絮狀物，但不會(huì)出現(xiàn)局部沉淀。l6. 于13,000rpm離心10 分鐘。l如離心機(jī)轉(zhuǎn)速不夠可延長離心時(shí)間，直至形成緊密的白色沉淀。l7. 將步驟6 離心后得到的上清液轉(zhuǎn)移到spin column 內(nèi)。于6,000rpm離心1 分鐘，并棄去接液管內(nèi)液體

9、。l8. 向spin column 內(nèi)加650l wash buffer，于12，000g 離心3060 秒，并棄去接液管內(nèi)液體。l9. 重復(fù)第8 步一次。l10. 再次于12，000rpm 離心1 分鐘，然后將spin column 轉(zhuǎn)移到無菌的1.5ml 離心管中。如不進(jìn)行該步離心，則無法保證離心柱內(nèi)殘液被徹底清除。l11. 向spin column 內(nèi)加20l elution buffer、去離子水或te 溶液，并于室溫靜置1 分鐘。l可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際需要決定洗脫液用量。l12. 于12，000rpm離心1 分鐘，1.5ml 離心管內(nèi)溶液中含有質(zhì)粒dna。l13. 提取的質(zhì)粒dna 可直接用于各類下游