mTOR抑制劑的篩選方法

1、mTOR抑制劑的篩選方法【摘要】雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是是絲氨酸/蘇氨酸激酶分子靶位。mTOR是細(xì)胞生長增生的中心調(diào)控者，直接或間接參與細(xì)胞生長增生有關(guān)環(huán)節(jié)的調(diào)控。人體多種腫瘤細(xì)胞中可見mTOR通路的失調(diào)。近年來，有關(guān)mTOR抑制劑的專利申請不斷增加，設(shè)計(jì)、合成、篩選結(jié)構(gòu)新穎的mTOR抑制劑已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研發(fā)的重大課題。本文就mTOR的結(jié)構(gòu)功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及mTOR抑制劑的篩選方法進(jìn)行簡單的介紹。【關(guān)鍵詞】雷帕霉素靶蛋白 雷帕霉素靶蛋白抑制劑 藥物篩選TOR(target of rapamycin，雷帕霉素靶蛋白)是一類進(jìn)化上非常保守的蛋白激酶家族，廣泛存在于各種生物細(xì)胞中。1994

2、年，Brown等證實(shí)并克隆了哺乳動物TOR基因，其產(chǎn)物只有一種蛋白，即mTOR(mammalian target of rapamycin，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)。mTOR屬P13K蛋白激酶類家族，是P13KPKB信號通路下游的一個效應(yīng)蛋白，其底物主要控制與細(xì)胞生長和增殖密切相關(guān)的蛋白質(zhì)的合成。mTOR控制細(xì)胞內(nèi)mRNA的翻譯，參與膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，蛋白質(zhì)降解，蛋白激酶C信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和核糖體合成等一系列生理病理過程。1. mTOR的分子結(jié)構(gòu)mTOR分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由2 549個氨基酸殘基組成，分子中有數(shù)個各自獨(dú)立而保守的結(jié)構(gòu)域，類似于酵母中TOR的結(jié)構(gòu)。mToR分子的氨基端存在20個串聯(lián)重復(fù)序列，每一個

3、重復(fù)序列包含2個分別由40個氨基酸殘基組成的螺旋，每個螺旋都有一個親水基團(tuán)和一個疏水基團(tuán)。這種重復(fù)結(jié)構(gòu)介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用，并有利于mTOR定位于漿膜。mTOR分子羧基端的中部是蛋白激酶域，結(jié)構(gòu)和P13K激酶的催化域相似。蛋白激酶域的上游是FRB域，為FKBPl2一雷帕霉素復(fù)合物與mTOR相互作用的區(qū)域，該區(qū)發(fā)生突變后可以完全阻止雷帕霉素對mTOR的抑制作用。FRB 下游大約500個氨基酸殘基處為FAT域，作用可能是與mTOR分子末端的FATC域形成一個空間結(jié)構(gòu)，從而暴露mTOR分子的催化域。FATC域和NRD域位于mTOR分子羧基末端，其中NRD域在FATC和激酶催化域之間，是mTOR的

4、負(fù)性調(diào)節(jié)域，而FATC域?qū)TOR的活性有著至關(guān)重要的作用，F(xiàn)ATC結(jié)構(gòu)中任何一個氨基酸殘基的缺失都能使mTOR喪失催化能力。由于mTOR包含的幾個相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域都能夠和其他蛋白質(zhì)發(fā)生作用，因而其能結(jié)合不同的蛋白質(zhì)。實(shí)際mTOR存在兩種復(fù)合物形式，這兩種復(fù)合物的結(jié)構(gòu)在細(xì)胞中都是相對保守的。mTOR形成的兩種不同復(fù)合物mTORC1和mTORC2。已知的mTOR對腫瘤細(xì)胞生長、分化和代謝的作用均由mTORC1完成，mTORC2對雷帕霉素不敏感。FRB區(qū)，這個區(qū)域?yàn)槊庖咭种苿〧K506結(jié)合蛋白與雷帕霉素的結(jié)合位點(diǎn)，是雷帕霉素與mTOR相互作用的區(qū)域。所以這個區(qū)域突變后可完全阻止雷帕霉素對mTOR的

5、抑制作用，F(xiàn)RB區(qū)之后為激酶區(qū)，作用是使絲氨酸蘇氨酸發(fā)生磷酸化。最后的FATC為FAT碳末端區(qū)。FAT和FATC區(qū)可調(diào)節(jié)mTOR激酶的活性。2. mTOR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路mTOR可通過P13KAKT途徑或AMPK途徑來發(fā)揮作用。目前研究較多的是P13KAKT途徑。該途徑在腫瘤中常被過度激活，使細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展。正常情況下，生長因子誘導(dǎo)mTOR的活化是通過激活P13K實(shí)現(xiàn)的。P13K可磷酸化肌糖環(huán)3-羥基的磷酸肌醇。細(xì)胞膜3-磷酸磷脂(P13Ps)與Akt的PH區(qū)域連接，導(dǎo)致Akt轉(zhuǎn)位至漿膜，從而與磷酸肌醇依賴性激酶1(PDKl)接觸。PDKl負(fù)責(zé)Akt的磷酸化，從而激活A(yù)

6、kt。激活的Akt可磷酸化結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體2(TSC2)并減弱后者對mTOR的抑制作用。Akt和P13K在功能上屬于原癌基因，受到抑癌基因PTEN的負(fù)性調(diào)節(jié)。PTEN可使肌糖環(huán)3-羥基的磷酸肌醇磷酸化，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞遷移、凋亡和有效終止P13K介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著關(guān)鍵性的作用。PTEN突變在人類實(shí)體腫瘤非常常見?；罨腜13K位于細(xì)胞膜，可催化磷脂酰肌醇P2轉(zhuǎn)變?yōu)榱字＜〈糚3，后者募集并激活A(yù)KT。PTEN可以下調(diào)PtdlinsP3的濃度。從而抑制P13KAKT途徑。AKT對mTOR的激活主要通過以下兩種方式：一種是磷酸化mTOR而直接激活它；另一種是磷酸化并抑制TSC1TSC2二聚體。

7、TSClTSC2是mTOR最重要的上游信號分子。Rheb是mTOR激活蛋白，TSClTSC2二聚體通過抑制Rheb阻止mTOR的活化。 由于P13KAktmTOR通路分子發(fā)生突變或者上游信號通路分子激活，腫瘤細(xì)胞內(nèi)P13AktmTOR通路可被激活，從而使細(xì)胞增殖失控、凋亡抗拒以及引起細(xì)胞的代謝改變。mTOR經(jīng)過上述兩種途徑被活化后可將信號傳遞給下游通路，通過兩種途徑調(diào)節(jié)下游核糖體和mRNA結(jié)合，一是使抑制mRNA翻譯的4EBP1磷酸化失活，二是使促進(jìn)mRNA翻譯的S6K1磷酸化而激活，從而啟動核糖體蛋白的翻譯。兩條途徑的最終效應(yīng)都是促進(jìn)mRNA翻譯，從而直接或間接調(diào)控翻譯起始階段、微絲形成、膜

8、轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白降解、蛋白激酶C(PKC)通路、核蛋白體合成、tRNA合成及轉(zhuǎn)錄等。3. mTOR抑制劑mTOR抑制劑雷帕霉素及其衍生物能結(jié)合FKBP(FKS06結(jié)合蛋白)，抑制mTOR，阻止P70S6K和4EBP磷酸化。同時也間接抑制了其它相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯，具有抗菌、免疫抑制和抗腫瘤作用。mTOR抑制劑是具有抗排斥、抗增殖、抗腫瘤及延長哺乳動物壽命等作用的多功能藥物。第一個mTOR抑制劑雷帕霉素（Rapamycin，現(xiàn)稱西羅莫司，Sirolimus）及其后來通過化學(xué)半合成獲得的西羅莫司衍生物已作為免疫抑制劑用于器官移植的抗排斥反應(yīng)、作為雷帕霉素涂層支架治療冠狀動脈支架植入后的再狹窄、作為治療腎癌

9、等癌癥的mTOR靶向抗癌藥物。目前又發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能夠治療老年性癡呆癥，也是第一個被報(bào)道能夠延長哺乳動物生命的藥物。雷帕霉素及其衍生物臨床上的新適應(yīng)癥逐步被開發(fā)，它們在治療罕見病、疑難病癥方面可能發(fā)揮更大的作用。近年來，有關(guān)mTOR抑制劑的專利申請不斷增加，設(shè)計(jì)、合成、篩選結(jié)構(gòu)新穎的mTOR抑制劑已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研發(fā)的重大課題。4. mTOR抑制劑的篩選方法（1）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）ELISA的原理是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與

10、固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。mTOR的Ser2448磷酸化是上游信號AKT激酶和下游p70S6激酶反饋?zhàn)饔玫慕Y(jié)果，通過檢測mTOR的Ser2448磷酸化程度可以檢測mTOR的活性。 我們找了Abcam公司 的mTOR pS

11、er2448 in vitro ELISA試劑盒，這個試劑盒是專為在細(xì)胞和組織裂解液精確測量mTOR的活性。具體如下：采用mTOR特定的抗體包被微孔板，制成固相載體，樣品吸入孔中，樣品中存在的mTOR被固定化的抗體結(jié)合到孔中。洗滌后，在微孔中加入檢測抗體。洗去未結(jié)合的檢測抗體，將酶標(biāo)抗體加入孔中。各孔再次洗滌，將TMB底物溶液加入到孔中，TMB被催化轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，藍(lán)色的深淺與磷酸化的Ser2448的數(shù)量呈正相關(guān)。加入鹽酸停止反應(yīng)，顏色從藍(lán)色變到黃色，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定光密度值（OD值），可計(jì)算樣品濃度。受檢抗原： mTOR phospho Ser2448 檢測抗體： anti-mTO

12、R phospho Ser2448 detector antibody酶標(biāo): HRP-conjugated label specific for the detector antibody底物： TMB檢測：最后加入鹽酸停止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm處測定OD值。 分析：OD值越小，mTOR的Ser2448磷酸化程度越低，抑制劑作用越強(qiáng)。（2）熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指兩個熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近（710nm）時，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實(shí)現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移（即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移）。FRET是一種

13、非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)的過程，使供體熒光強(qiáng)度降低，而受體可以發(fā)射更強(qiáng)于本身的特征熒光（敏化熒光），也可以不發(fā)熒光（熒光猝滅），同時也伴隨著熒光壽命的相應(yīng)縮短或延長。蛋白質(zhì)磷酸化是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要標(biāo)志，研究其中的酶活性是研究信號通路的一個重要方面。利用放射性以及免疫化學(xué)發(fā)光等方法檢測酶活性，都需要破碎細(xì)胞，用細(xì)胞提取物測定酶活性，無法做到活細(xì)胞內(nèi)定時、定量、定位的觀測酶活性變化，而利用FRET方法就可以很好的解決這個問題。利用FRET原理設(shè)計(jì)了一種新的探針（一種融合蛋白）：新探針包含一個對已知蛋白激酶特異性的底物結(jié)構(gòu)域，一個與磷酸化底

14、物結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的磷酸化識別結(jié)構(gòu)域。這個探針蛋白的兩端分別是供體、受體熒光分子，利用FRET原理工作。當(dāng)?shù)孜锝Y(jié)構(gòu)域被磷酸化后，分子內(nèi)部就會發(fā)生磷酸化識別結(jié)構(gòu)域與其結(jié)合而引起的內(nèi)部折疊，兩個熒光蛋白相互靠近就會發(fā)生能量遷移。實(shí)驗(yàn)用到的供體是Thr46（鋱標(biāo)記的anti-phospho-4EBP1），受體是綠色熒光標(biāo)記的4EBP1，是mTOR下游信號通路的蛋白，有活性的mTOR能磷酸化4EBP1，使之與供體結(jié)合。如果mTOR活性受到抑制，供體受體距離不能達(dá)到熒光能量轉(zhuǎn)移的要求，則在515nm處與485nm處的信號比值增大。抑制劑的活性越大，比值越大。（3）均相時間分辨熒光（HTRF）我們找到的是HT

15、RF ADP Transcreener試劑盒。HTRF Transcreener ADP測定是競爭性免疫測定。mTOR是一種激酶，在反應(yīng)時會使ATP轉(zhuǎn)化為ADP。ATP轉(zhuǎn)化的ADP與d2標(biāo)記ADP競爭性地與銪標(biāo)記的ADP單克隆抗體結(jié)合。當(dāng)銪標(biāo)記的ADP單克隆抗體與有標(biāo)記的ADP相結(jié)合后，他們便能發(fā)射熒光；當(dāng)抗體與沒有標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)ADP結(jié)合后，沒有熒光產(chǎn)生。所以，通過檢測熒光值的變化，便可量化細(xì)胞內(nèi)的ADP。該測定法包括兩個步驟：一個酶促步驟及隨后的通用檢測步驟。首先在激酶作用下，ATP轉(zhuǎn)化成ADP；銪標(biāo)記的抗體與加入的標(biāo)記的ADP能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，與反應(yīng)中轉(zhuǎn)化的ADP沒有能量轉(zhuǎn)移，檢測不到熒光。

16、所以熒光強(qiáng)度會隨著反應(yīng)轉(zhuǎn)化的ADP量增加而減小。mTOR抑制劑活性越大，反應(yīng)轉(zhuǎn)化的ADP越少，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，通過作圖計(jì)算IC50，可以比較不同抑制劑的活性。熒光檢測還可以采用以下幾種方法。 ADP Hunter試劑盒我們也可以直接檢測激酶反應(yīng)產(chǎn)生的ADP的量。ADP Hunter是一種高通量篩選激酶抑制劑的試劑盒。它的優(yōu)點(diǎn)是更加簡便和靈敏。此測定法直接檢測磷酸化反應(yīng)而產(chǎn)生的ADP分子，采用非放射性，非基于抗體的方法。激酶反應(yīng)將ATP轉(zhuǎn)化為ADP，通過偶聯(lián)酶反應(yīng)系統(tǒng)從ADP生成過氧化氫。在有過氧化氫酶（HRP）存在時，過氧化氫與ADHP（HRP顯色底物）結(jié)合顯色，用熒光酶標(biāo)儀在最大激發(fā)波長和最大

17、發(fā)射波長分別為530納米和590納米處檢測熒光強(qiáng)度。 ADP-Glo是測定激酶活性的一種常用方法，檢測也是激酶反應(yīng)產(chǎn)生的ADP的量。在激酶反應(yīng)后，把殘留的未反應(yīng)的ATP用酶降解，反應(yīng)產(chǎn)生的ADP在酶作用下轉(zhuǎn)化成ATP，最后在熒光素酶作用下檢測熒光。不同濃度的ADP含量可做出的標(biāo)準(zhǔn)圖，將最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)圖對照，可得出結(jié)論。在最下面的一條曲線表明磷酸化程度最弱，抑制劑的活性越強(qiáng)。 LabChip EZ Reader MSA assays這個方法跟之前的原理都略有不同，雖然最后也是檢測熒光強(qiáng)度，但是它是把處理過的樣品用熒光后標(biāo)記吸入管中，根據(jù)不同帶荷質(zhì)比遷移率不同，熒光底物和熒光底物標(biāo)記的檢測物

18、最后到達(dá)檢測窗口的時間也不同，最后就能得到一幅關(guān)于時間與熒光強(qiáng)度的關(guān)系圖。跟高效液相的過程有點(diǎn)類似，只不過高效液相是根據(jù)組分的極性不同，檢測器是紫外。而這個方法是根據(jù)荷質(zhì)比，檢測方法是熒光。在試驗(yàn)中用到的樣品可以是抑制劑處理過的mTOR下游靶蛋白，靶蛋白磷酸化程度越弱，則熒光信號越弱，抑制劑活性越強(qiáng)。（4）時間分辨熒光技術(shù)（TRF）時間分辨熒光技術(shù)的原理是用三價稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標(biāo)記抗原、抗體、激素、核酸探針等物質(zhì)。當(dāng)免疫反應(yīng)發(fā)生后，根據(jù)稀土離子螯合物的熒光光譜的特點(diǎn) （特異性強(qiáng)、熒光光譜的Stokes位移、壽命長），用時間分辨熒光分析儀，測

19、定免疫反應(yīng)最后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度和相對熒光強(qiáng)度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的。示蹤劑一般是具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘南⊥两饘?鑭系元素，鑭系元素共有15種，應(yīng)用在時間分辨熒光免疫技術(shù)中有四種：銪(Eu)、釤（Sm)、鏑(Dy)、锝(Te)。鑭系元素?zé)晒馓攸c(diǎn)：（1）熒光壽命極長v 鑭系元素螯合物（60900 us) v 普通熒光免疫中熒光團(tuán)：1100usv 樣本中蛋白質(zhì)熒光：110us，易猝滅。（2）Stokes位移大（大約290nm）v 銪：發(fā)射光613nm、激發(fā)光340nm，v 熒光素的Stokes位移為28nm （3）熒光特異性強(qiáng)（發(fā)射光譜帶很窄：615 5nm）（

20、4）解離-增強(qiáng)技術(shù)可使其熒光性提高100萬倍所以鑭系元素有兩個優(yōu)點(diǎn)， stocks位移,也就是激發(fā)光和發(fā)射光距離很大,很容易分辨激發(fā)光和發(fā)射光，而排除激發(fā)光的干擾。第二個優(yōu)點(diǎn)是鑭系元素的熒光不僅強(qiáng)度高，而且半衰期也很長，通過時間分辨，極大地降低了自發(fā)熒光背景,實(shí)現(xiàn)了高信噪比。故我們在時間分辨熒光檢測中一般會采用DELFIA法(解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖邫z測)。這一技術(shù)使用鑭系螯合物標(biāo)記的試劑，通過洗滌來分離出未被結(jié)合的試劑，從而檢測體系中被標(biāo)記的某種化合物或生物分子。在加入樣品后經(jīng)過洗脫，phospho-p70S6K抗體留在板上，再加入銪標(biāo)記的Eu-anti-phospho-p70S6K 抗體經(jīng)

21、過洗脫，加入增強(qiáng)劑，Eu3+從復(fù)合物上解離下來，自由Eu3+在增強(qiáng)劑作用下在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強(qiáng)的熒光，信號增強(qiáng)了百萬倍。實(shí)驗(yàn)用處理過的mTOR與p70S6K一起培養(yǎng)一段時間，之后加入銪標(biāo)價的磷酸化p70S6K抗體，在熒光下檢測信號強(qiáng)度。信號強(qiáng)度越低表示磷酸化程度越低，mTOR活性越小，小分子抑制劑活性越大。DELFIA 優(yōu)點(diǎn)包括：DELFIA 適用于各種標(biāo)記分子的結(jié)合檢測: 從小肽段至蛋白大分子；高靈敏度 -信噪比可達(dá) 20 000:1；大的動態(tài)范圍 - 動態(tài)范圍超過 3 logs；檢測過程不涉及酶 無時間依賴性；試劑用量更少；價格不菲的抗體所需更少；無需像ELISA那樣添加實(shí)驗(yàn)終止液；

22、可同時檢測多種待測物；減少了測量過程中的樣品干擾；信號穩(wěn)定超過24小時, 提高了試驗(yàn)重復(fù)性。（4）AlphascreenAlphascreen的作用原理：在Alphascreen系統(tǒng)中主要含有兩種核心物質(zhì)，一為Donor Bead，另一為Acceptor Bead，當(dāng)Donor Bead所帶有的A分子與Acceptor Bead所帶有的B分子產(chǎn)生相互作用時，可以680nm鐳射光去激發(fā)Donor Bead表面所帶有的光敏感物質(zhì)，使其催化周遭的氧分子形成活化態(tài)。此時活化態(tài)的氧分子可以與鄰近的Acceptor Bead產(chǎn)生化學(xué)冷光化反應(yīng)，并進(jìn)一步藉由能量轉(zhuǎn)換激發(fā)Acceptor Bead所帶有的熒光

23、物質(zhì)產(chǎn)生520-620nm的熒光信號。當(dāng)分子不存在特異的相互作用時，活化態(tài)的氧無法擴(kuò)散到Acceptor Bead，則不會有信號的產(chǎn)生。AlphaScreen SureFire 檢測試劑盒可用于 mTOR 通路的研究，由下圖可見相關(guān)產(chǎn)品很多，方便用于mTOR抑制劑的篩選。與同類型的檢測方法TR-FRET、EFC和FP相比，AlphaScreen的優(yōu)勢在于蛋白和多肽都可作為磷酸化底物用于激酶檢測。 與ELISA相比，該檢測方法最大的優(yōu)勢在于無需進(jìn)行引物標(biāo)記，檢測靈敏度比ELISA方法更高。5. mTOR抑制劑的篩選方法的比較以上就是mTOR抑制劑幾種篩選方法的介紹，最后對幾種篩選方法進(jìn)行簡單的比較：1.ELISA操作簡單快速，特異性強(qiáng)，沒有放射性污染，設(shè)備要求簡單，應(yīng)用范圍廣。 2.熒光諧振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）操作簡便，結(jié)果直觀，但供體受體之間發(fā)生有效能量轉(zhuǎn)移的條件是苛刻的，尋找一個合適的D-A對是很不容易的。采用ADP含量測定試劑盒更方便，靈敏度很高。3. DELFIA 適用于各種標(biāo)記分子的結(jié)合檢測,試劑用量少；價格不菲的抗體所需少,減少了測量過程中的樣品干擾,靈敏度高。