細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)

1、chapter 4 animal cell culture biology of cells in culture fluid for cell culture standard cell culture techniques establishing a cell line or cell strain cell freezing and recoveryanimal cell engineeringsection 3：細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求 原代培養(yǎng)操作原代培養(yǎng)操作 傳代培養(yǎng)操作傳代培養(yǎng)操作 細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)

2、題細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)題 細(xì)胞活力的測(cè)定方法細(xì)胞活力的測(cè)定方法培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求（培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求（1）無(wú)菌操作無(wú)菌操作 防治污染；成功或失敗的首要條件防治污染；成功或失敗的首要條件培養(yǎng)前準(zhǔn)備培養(yǎng)前準(zhǔn)備 操作卡片操作卡片 用品置于場(chǎng)地，然后消毒用品置于場(chǎng)地，然后消毒 操作野消毒操作野消毒 洗手和著裝洗手和著裝 火焰消毒火焰消毒培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求（培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求（2） 動(dòng)作準(zhǔn)確敏捷動(dòng)作準(zhǔn)確敏捷 不用手觸及已消毒物品不用手觸及已消毒物品 操作面布局合理操作面布局合理 操作保持一定順序操作保持一定順序 培養(yǎng)用瓶和吸管的放置培養(yǎng)用瓶和吸管的放置 防止各種用液的交叉污染防止各種用液的

3、交叉污染 不向操作野講話或咳嗽不向操作野講話或咳嗽模擬實(shí)驗(yàn)（模擬實(shí)驗(yàn)（1）某生物技術(shù)公司招聘操作面試：某生物技術(shù)公司招聘操作面試：小鼠肝細(xì)胞（組織塊）和脾細(xì)胞原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞（組織塊）和脾細(xì)胞原代培養(yǎng)操作前（準(zhǔn)備工作）：操作前（準(zhǔn)備工作）：操作中（分離、培養(yǎng)的具體方法）操作中（分離、培養(yǎng)的具體方法）操作后（清潔）操作后（清潔） 1）培養(yǎng)前準(zhǔn)備培養(yǎng)前準(zhǔn)備：制定實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。 2）超凈臺(tái)超凈臺(tái)要用75%酒精擦洗，然后紫外線消毒30分鐘，工作臺(tái)面上用品不要過(guò)多或重疊放置。 3）個(gè)人個(gè)人進(jìn)入無(wú)菌培養(yǎng)室原則上須徹底洗手并按外科手術(shù)要求著裝，開(kāi)始操作前要用75%酒精或0.2%新潔而滅消毒手和前臂。

4、 4）實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)中需保持無(wú)菌操作要求。實(shí)驗(yàn)前要點(diǎn)燃酒精燈，燒過(guò)的器械要注意冷卻，以防細(xì)胞損傷。 5）分別使用分別使用不同吸管吸取營(yíng)養(yǎng)液、pbs、細(xì)胞懸液及其它各種用液，而不能混用 6）不要用手不要用手觸及已消毒的器皿，如已接觸，要用火焰灼燒或取備用品更換。 7）注意操作時(shí)勿大聲講話或咳嗽勿大聲講話或咳嗽。section 3：細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求原代培養(yǎng)操作原代培養(yǎng)操作 傳代培養(yǎng)操作傳代培養(yǎng)操作 細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)題 細(xì)胞活力的測(cè)定方法細(xì)胞活力的測(cè)定方法動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程圖解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程圖解

5、原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) primary culture概念概念 從體內(nèi)取出組織細(xì)胞從體內(nèi)取出組織細(xì)胞開(kāi)始培養(yǎng)到第一次進(jìn)行開(kāi)始培養(yǎng)到第一次進(jìn)行傳代之前傳代之前的時(shí)期，一個(gè)特征性的必然的生長(zhǎng)階的時(shí)期，一個(gè)特征性的必然的生長(zhǎng)階段。段。 完成了完成了從體內(nèi)從體內(nèi)環(huán)境環(huán)境到體外到體外環(huán)境的環(huán)境的過(guò)渡過(guò)渡和和適適應(yīng)應(yīng)過(guò)程，過(guò)程，恢復(fù)恢復(fù)了了分裂增殖分裂增殖與與生長(zhǎng)發(fā)育生長(zhǎng)發(fā)育 的能力的能力取材取材分離細(xì)胞分離細(xì)胞接種接種含義含義:包含包含原代培養(yǎng)實(shí)質(zhì)是原代培養(yǎng)實(shí)質(zhì)是初次培養(yǎng)初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)器皿即培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)器皿 中就中就不再分割不再分割，任其生長(zhǎng)繁殖任其生長(zhǎng)繁殖原代培養(yǎng)中的原代培養(yǎng)中的“代代”

6、并并不是指細(xì)胞繁殖的不是指細(xì)胞繁殖的“代代”數(shù)數(shù)原代培養(yǎng)過(guò)程中不分割培養(yǎng)物原代培養(yǎng)過(guò)程中不分割培養(yǎng)物 不等于不更換培養(yǎng)液不等于不更換培養(yǎng)液建立方法建立方法:組織塊法組織塊法；分散分散( (細(xì)胞懸液）法細(xì)胞懸液）法時(shí)間時(shí)間: 一般一般14周周 1、取 材 理論上講，各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織都可理論上講，各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)。以用于培養(yǎng)。 幼體較成體、分化程度低的較分化程度高的、幼體較成體、分化程度低的較分化程度高的、腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng) 組織取材應(yīng)先切成組織取材應(yīng)先切成1cm1cm3 3的小塊，可置于培養(yǎng)液的小塊，可置于培養(yǎng)液中中4 4度保存

7、，不易超過(guò)度保存，不易超過(guò)2424小時(shí)。小時(shí)。 取材時(shí)避免污染及化學(xué)物質(zhì)的損傷。取材時(shí)避免污染及化學(xué)物質(zhì)的損傷。血細(xì)胞取材 靜脈取血 指尖或耳垂取血 用肝素抗凝劑20u/ml 抽血嚴(yán)格無(wú)菌取鼠胚 用引頸法殺死動(dòng)物 浸入75酒精中5分鐘消毒 開(kāi)腹取材取雞胚 選新鮮受精雞蛋，選新鮮受精雞蛋，3737度孵育度孵育9 91212天，每天翻動(dòng)天，每天翻動(dòng)雞蛋一次。雞蛋一次。 無(wú)菌條件下，將雞卵置于一個(gè)小燒杯中，令氣無(wú)菌條件下，將雞卵置于一個(gè)小燒杯中，令氣室端向上，用碘酒消毒卵殼，再用酒精消毒。室端向上，用碘酒消毒卵殼，再用酒精消毒。 用彎剪刀環(huán)行剪除氣室端卵殼，切開(kāi)卵膜，暴用彎剪刀環(huán)行剪除氣室端卵殼，切

8、開(kāi)卵膜，暴露出雞胚。露出雞胚。 用彎頭鈍玻璃棒伸入雞胚頭體之間下方，取出用彎頭鈍玻璃棒伸入雞胚頭體之間下方，取出雞胚。雞胚。問(wèn)題：?jiǎn)栴}： 原代培養(yǎng)時(shí)，如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分原代培養(yǎng)時(shí)，如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離和接種？離和接種？（1 1）細(xì)胞懸液的分離方法）細(xì)胞懸液的分離方法 材料為血液、羊水、胸水和腹水等細(xì)胞懸液時(shí)，可以采用離心法分離細(xì)胞。 一般多用5001000rmp，510分鐘。2、分 離（2）組織的解離方法）組織的解離方法 解離組織：解離組織：在無(wú)菌情況下采取動(dòng)物的組織或器官，放在含有抗生素的平衡鹽溶液(bss)中，然后盡快在超凈臺(tái)或無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行解離處理。解離時(shí)應(yīng)注意解離時(shí)應(yīng)注意: :1) 盡可能將

9、脂肪和壞死組織去除干凈；2) 剪碎組織時(shí)，避免損傷組織塊；3) 解離組織用的各種酶系，需要先進(jìn)行低速離心。（3）解離細(xì)胞）解離細(xì)胞常用機(jī)械法機(jī)械法和消化法消化法進(jìn)行當(dāng)實(shí)驗(yàn)室需要制備具有均勻細(xì)胞層的培養(yǎng)物；當(dāng)實(shí)驗(yàn)室需要制備具有均勻細(xì)胞層的培養(yǎng)物；從單個(gè)細(xì)胞出發(fā)獲得細(xì)胞群體；從單個(gè)細(xì)胞出發(fā)獲得細(xì)胞群體；從一定量的組織中獲得最多的細(xì)胞量時(shí)。從一定量的組織中獲得最多的細(xì)胞量時(shí)。a. 機(jī)械法解離細(xì)胞機(jī)械法解離細(xì)胞1 1）離心分離法離心分離法：適用于血液、腹水等細(xì)胞懸液的分離。2 2）切割分離法切割分離法：將組織塊剪切成1mm3左右的小塊。3 3）機(jī)械分散法機(jī)械分散法：纖維成分很少的某些軟組織（脾、胸腺、

10、腦等）。組織塊分離 切割分離組織法 用剪刀剪至1mm3左右的大小的塊。機(jī)械解離分離法 某些軟組織如腦、胚胎和一些腫瘤等b. 消化法解離細(xì)胞消化法解離細(xì)胞1 1）胰蛋白酶解離細(xì)胞法）胰蛋白酶解離細(xì)胞法：所需時(shí)間較短，主要缺點(diǎn)是破損細(xì)胞。2 2）膠原酶解離細(xì)胞法）膠原酶解離細(xì)胞法：這種方法對(duì)解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的。膠原酶最終濃度200u/ml，36.5溫育，一般溫育4-48h。膠原酶和透明質(zhì)酸酶協(xié)同作用有助于分離大鼠或兔的肝臟組織。3 3）螯合劑解離細(xì)胞法）螯合劑解離細(xì)胞法：分離效果差（通常用（通常用1 1：1 1的的edtaedta和和胰蛋白酶胰蛋白酶混合液）混合液）消化分解法 胰

11、蛋白酶法 適用消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎組織、羊膜、上皮、肝、腎等 鈣離子、鎂離子、血清等都對(duì)其有抑制作用。膠原酶解細(xì)胞法 結(jié)締組織復(fù)合膠原，用膠原酶解，使膠原酶最終濃度為200u/ml，36.5，靜置448小時(shí)，上面懸液經(jīng)離心獲得或纖維細(xì)胞沉淀，沉淀重置于生理鹽水，去掉未解向組織塊后沉淀得到上皮樣細(xì)胞。edta法 乙二胺四乙酸二鈉，非酶性消化物 用于消化分離傳代細(xì)胞，能螯合鈣離子，鎂離子， edta工作液用不含鈣離子和鎂離子的bss配制成0.02%的濃度 通常和0.25的胰蛋白酶1：1合用section 3：細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求培養(yǎng)操作的基本要

12、領(lǐng)和要求 原代培養(yǎng)操作原代培養(yǎng)操作傳代培養(yǎng)操作傳代培養(yǎng)操作 細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)題 細(xì)胞活力的測(cè)定方法細(xì)胞活力的測(cè)定方法能能維持的代數(shù)維持的代數(shù)一般一般是是有限細(xì)胞系有限細(xì)胞系種族種族(主要主要):成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞 人人,50; 猴猴,40; 雞雞,37;鼠鼠,8 部位部位:人人: 胚肺胚肺 5010; 腎腎819 猴猴: 肺肺 5; 腎腎 20; 耳耳 40條件條件:如表皮細(xì)胞如表皮細(xì)胞 +egf 從從50代代 增加至增加至150年齡年齡模擬實(shí)驗(yàn)（模擬實(shí)驗(yàn)（2）小鼠肝細(xì)胞和脾細(xì)胞原代培養(yǎng)兩周后，進(jìn)小鼠肝細(xì)胞和脾細(xì)胞原代培養(yǎng)兩周后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)行傳代培養(yǎng)

13、肝細(xì)胞：肝細(xì)胞：脾細(xì)胞：脾細(xì)胞：細(xì)胞傳代方法細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，傳代方法有根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，傳代方法有3種：種：1 1、懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代、懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 離心法傳代離心法傳代：離心（離心（1000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l/2一一2/3，然后用，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2 2、半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代、半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打

14、法使細(xì)胞此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。3 3、貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代、貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液（含的胰蛋白酶液（含0.02% edta）。）。貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法1、吸盡（或倒掉）培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液、吸盡（或倒掉）培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2、加入、加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置底為準(zhǔn)）靜置2-10 min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。）。3、吸去胰蛋

15、白酶液，加入培養(yǎng)液（、吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液（可終止胰酶的作用可終止胰酶的作用）。）。4、用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞、用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。懸液。5、吸取、吸取1/101/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。6、加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。、加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。7、將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。、將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)常用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)常用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 懸滴培養(yǎng)懸滴培養(yǎng) 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng) 細(xì)胞同步化培養(yǎng)細(xì)胞同步

16、化培養(yǎng) 克隆培養(yǎng)（克隆培養(yǎng)（見(jiàn)后見(jiàn)后）常用培養(yǎng)技術(shù)常用培養(yǎng)技術(shù)1 1、懸滴培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng)l也稱組織塊懸滴培養(yǎng)，是最早建立的體外培養(yǎng)技術(shù)，是組織和器官培養(yǎng)的經(jīng)典方法。l將培養(yǎng)液滴于蓋玻片上并鋪展開(kāi)，將待培養(yǎng)的組織或器官植塊放于鋪展開(kāi)的培養(yǎng)液中央部位，然后將蓋玻片翻轉(zhuǎn)放于凹載玻片上，密封后進(jìn)行培養(yǎng)。2 2、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)l將擬培養(yǎng)對(duì)象直接接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)再放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)的方法。3 3、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)l將所培養(yǎng)的組織細(xì)胞接種在一管狀培養(yǎng)皿（稱旋轉(zhuǎn)管），再將旋轉(zhuǎn)管置于一可旋轉(zhuǎn)的裝置上，邊旋邊進(jìn)行培養(yǎng)的一種方法。4 4、 克隆培養(yǎng)法克隆培養(yǎng)法l又稱單細(xì)胞分離培養(yǎng)法，就是將從細(xì)胞懸浮液中

17、獲得的單個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng)，使之重新衍生成一個(gè)新細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。l克隆培養(yǎng)法強(qiáng)調(diào)培養(yǎng)產(chǎn)物的單一性而排除異質(zhì)性，所獲得的培養(yǎng)產(chǎn)物遺傳產(chǎn)物幾乎完全相同，即培養(yǎng)得到的后裔細(xì)胞群來(lái)源于一個(gè)共同的祖細(xì)胞，稱細(xì)胞株。section 3：細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求 原代培養(yǎng)操作原代培養(yǎng)操作 傳代培養(yǎng)操作傳代培養(yǎng)操作細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)題 細(xì)胞活力的測(cè)定方法細(xì)胞活力的測(cè)定方法細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù) 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/毫升細(xì)胞懸液毫升細(xì)胞懸液4大格細(xì)胞總數(shù)大格細(xì)胞總數(shù)/410000稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)1毫

18、米毫米計(jì)數(shù)原則：計(jì)數(shù)原則：不數(shù)死細(xì)胞（染不數(shù)死細(xì)胞（染藍(lán)）、壓線細(xì)胞數(shù)藍(lán)）、壓線細(xì)胞數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，一團(tuán)細(xì)胞按數(shù)右，一團(tuán)細(xì)胞按一個(gè)計(jì)數(shù)！一個(gè)計(jì)數(shù)！section 3：細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求 原代培養(yǎng)操作原代培養(yǎng)操作 傳代培養(yǎng)操作傳代培養(yǎng)操作 細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)題 細(xì)胞活力的測(cè)定方法細(xì)胞活力的測(cè)定方法細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題 1 1）培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例）培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃度的培養(yǎng)液僅一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細(xì)胞生長(zhǎng)，不能盲目

19、增加每單位體積能支持一定數(shù)量的細(xì)胞生長(zhǎng)，不能盲目增加每單位體積的細(xì)胞濃度。的細(xì)胞濃度。2 2）phph：初培養(yǎng)初培養(yǎng)phph應(yīng)為應(yīng)為7.47.4，培養(yǎng)過(guò)程應(yīng)不低于，培養(yǎng)過(guò)程應(yīng)不低于7.07.0。（耐酸不耐堿耐酸不耐堿）3 3）培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的空間）培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的空間：一般培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液與液面上一般培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為的空間體積之比為1:101:10。 4 4）容積、深度、表面面積）容積、深度、表面面積：培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.20.5ml/cm2。需高濃度氧的，在淺的培養(yǎng)液（2mm）中生長(zhǎng)較好；需要低濃度氧的。在深的培養(yǎng)液（5mm）中生長(zhǎng)較好。5 5）去除死細(xì)胞）去除死細(xì)胞6 6）溫度控制）溫度控制：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)溫度波動(dòng)的敏感性很大。溫度低于36.5，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；溫度高于37.5，細(xì)胞存活力降低。section 3：細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求 原代培養(yǎng)操作原代培養(yǎng)操作 傳代培養(yǎng)操作傳代培養(yǎng)操作 細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)題細(xì)胞活力的測(cè)定方法（細(xì)胞活力的